王金輝

（浙江義烏市自來水有限公司，浙江義烏322000）

維生素B6高產(chǎn)菌選育及高強(qiáng)度發(fā)酵技術(shù)研究

王金輝

（浙江義烏市自來水有限公司，浙江義烏322000）

試驗(yàn)將野生根瘤菌篩選后經(jīng)16S-rDNA分子鑒定，確定目標(biāo)菌株為慢生大豆根瘤菌。為了強(qiáng)化維生素B6合成途徑，從碳源和氮源角度進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化。以YMA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取8種碳源和4種氮源來替換YMA中原有碳源或氮源，采用卡爾斯伯酵母法檢測發(fā)酵液中的維生素B6含量，結(jié)果表明，葡萄糖和牛肉膏濃度分別在10%和4%的條件下產(chǎn)量從35.30mg/L提高到66.12mg/L。

維生素B6；根瘤菌；微生物

維生素B6是一種已知較為活潑的化合物——5'-磷酸吡哆醛前體，在人體中以輔因子的形式參與了大量酶活反應(yīng)。一般人與動物腸道中的微生物(細(xì)菌)可合成維生素B6，但其量極少，需從食物中補(bǔ)充。

而眾多產(chǎn)維生素B6的細(xì)菌中，主要有黃桿菌、季也蒙畢赤酵母、大腸桿菌和根瘤菌。其中，黃桿菌、季也蒙畢赤酵母的產(chǎn)量約20mg/L、25mg/L，大腸桿菌則能達(dá)到78.5mg/L，而一種苜蓿根瘤菌能達(dá)103mg/L。

本文研究了野生根瘤菌篩選，后經(jīng)16S-rDNA分子鑒定，確定目標(biāo)菌株為慢生大豆根瘤菌，作為維生素B6發(fā)酵法合成途徑，從碳源和氮源角度進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化。以YMA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取8種碳源和4種氮源來替換YMA中原有碳源或氮源，采用卡爾斯伯酵母法檢測發(fā)酵液中的維生素B6含量，優(yōu)化結(jié)果表明，葡萄糖和牛肉膏濃度分別在10%和4%的條件下產(chǎn)量從35.30mg/L提高到66.12mg/L。

1 試驗(yàn)部分

1.1 目標(biāo)菌株的篩選

從根瘤中提取的菌液經(jīng)分離純化后挑取兩三個表面覆蓋有一層粘多糖，且菌落為白色或淡黃色，邊緣圓滑呈圓形的菌落[1，2]，培養(yǎng)后用卡爾斯伯酵母法[3]選擇產(chǎn)量較高的5株菌株發(fā)酵液離心后取20～25mL，用HCl調(diào)pH至1.7±0.1，再用NaOH調(diào)節(jié)pH至4.5±0.1，并定容至50mL，即可得到待測溶液。

1.2 16S-rDNA分子鑒定

從根瘤菌中提取DNA后用細(xì)菌16S-rDNA擴(kuò)增通用引物F27和R1492對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的DNA用瓊脂糖凝膠電泳分離并將1.5kb處的條帶割下回收，跑膠驗(yàn)證后連接到T載體上，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞，在含50μg/mL氨芐的培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，挑取單斑接種至裝有600μL含氨芐的液體LB培養(yǎng)基的EP管中，37℃培養(yǎng)至渾濁后送至測序。

根據(jù)網(wǎng)上查找的根瘤菌的登陸號[4，5]，在NCBI的GenBank上查找相關(guān)基因序列，與測序所得序列進(jìn)行相似度匹配，從而獲知目標(biāo)菌種的種屬。

1.3 不同碳/氮源對產(chǎn)量的影響

用葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、甘油、甘露醇或酵母粉、牛肉膏、蛋白胨和大豆粉來替代YMA培養(yǎng)基中的碳/氮源，濃度與原濃度相同。

在培養(yǎng)基中接入根瘤菌，28℃培養(yǎng)5d后8 000rpm離心10min，取上清液0.2mL于1.5mL EP管中，加入1mL蒸餾水。再取若干支試管，加入一定量稀釋后的發(fā)酵液，121℃滅菌10min，冷卻后加入提前制備好的種子液50μL，30℃培養(yǎng)18～20h，測吸光度。

1.4 不同碳/氮源濃度對產(chǎn)量的影響

選出使維生素B6產(chǎn)量達(dá)到最大的碳源或氮源，將碳源濃度設(shè)置成5%、8%、10%、12%和15%，氮源濃度設(shè)置成1%、2%、3%、4%和5%來進(jìn)行優(yōu)化測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素B6高產(chǎn)菌篩選

將根瘤菌的發(fā)酵液過高效液相色譜可知，吡哆醛的含量較其余兩種相對較高，但由于維生素B6的3種主要成分在結(jié)構(gòu)上具有同源性，且從性質(zhì)來看，吡哆醇的性質(zhì)較其余兩者更加穩(wěn)定。因此，在試驗(yàn)過程中，主要通過測量發(fā)酵液中吡哆醇含量來判定菌株產(chǎn)維生素B6的能力。

試驗(yàn)選取表面有粘多糖，白色且邊緣圓滑的菌落進(jìn)行純化，并選取40株長勢較好的根瘤菌，通過微生物檢測法檢測發(fā)酵液中的維生素B6含量。選取其中產(chǎn)量最高的5株菌株，將其發(fā)酵液過高效液相色譜，選取其中維生素B6含量最高的一株菌株作為試驗(yàn)菌，其產(chǎn)量為35.30mg/L。

2.2 16S-rDNA分子鑒定

對菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到一條約1.5kb大小的條帶。將產(chǎn)物連至pMD?18-T Simple Vector載體后，篩選陽性克隆。挑取的單菌落均為陽性。

將16S-rDNA測序后得到一個1 487bp的序列，與NCBI上已報(bào)道真核生物16S-rDNA序列比對可發(fā)現(xiàn)，菌株與慢生大豆根瘤菌HMJ-03（Bradyrhizobium japonicum strain HMJ-03）的16S-rDNA序列相似性為100%。因此，將其歸屬于根瘤菌目、慢生根瘤菌科、慢生根瘤菌屬的慢生大豆根瘤菌。

2.3 不同碳源對產(chǎn)量的影響

選取葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、甘油和甘露醇作為碳源，其濃度均為10%。由圖1可得，根瘤菌對上述碳源均有一定的利用率。從單一碳源的角度看，以葡萄糖這種速效碳源的利用率最高，其次是甘露醇和甘油，而果糖、乳糖、麥芽糖、淀粉和蔗糖等遲效碳源的利用率則相對偏低。速效碳源可被菌株直接利用，而遲效碳源則存在一個菌株的適應(yīng)過程。當(dāng)然，不同的碳源對菌株生長及代謝過程的影響是不同的，可能是促進(jìn)，也可能會是抑制。因此，在碳源優(yōu)化的過程中也可采用多種碳源結(jié)合的方式，分別對菌株的生長及代謝過程進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 不同碳源對產(chǎn)量的影響

2.4 不同濃度葡萄糖對產(chǎn)量的影響

從成本和利用率的角度來看，選擇葡萄糖作為碳源，根據(jù)梯度添加量可知，碳源并不是越多越好，過多的碳源會對菌株產(chǎn)生底物分解阻遏效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基中的碳源濃度以8%～10%為宜。

2.5 不同氮源對產(chǎn)量的影響

選取酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、大豆粉作為氮源，其濃度均3%。由圖2可得，試驗(yàn)所采用的4種氮源中，以牛肉膏利用率為最，其次是大豆粉，再則是蛋白胨和酵母粉。故可以認(rèn)為，在以上4種氮源中，牛肉膏為一種較為合適的氮源，對菌株的維生素B6代謝有一定的促進(jìn)作用。同時，因其廉價的成本及穩(wěn)定的來源，其是工業(yè)上發(fā)酵較為理想的氮源。

圖2 不同氮源對產(chǎn)量的影響

2.6 不同濃度牛肉膏對產(chǎn)量的影響

將牛肉膏設(shè)置梯度添加量，隨著氮源濃度的增加，菌株的維生素B6產(chǎn)量也在逐漸增加。同樣的，其濃度也不是越多越好。當(dāng)?shù)礉舛仍诘陀?%時，其維生素B6產(chǎn)量明顯較低，而達(dá)到3%之后，則產(chǎn)量處于一個較高值，且隨著濃度增加，產(chǎn)量的增加幅度逐漸減小。

從氮源的濃度來看，當(dāng)?shù)礉舛忍幱?%～5%時，維生素B6的產(chǎn)量是最高的。但是，在兼顧成本后，氮源濃度在4%～5%，維生素B6的產(chǎn)量增加趨勢漸緩甚至略微減小。也就是說，在3%～4%，維生素B6的產(chǎn)量已處于一個較高值。故綜合考慮，認(rèn)為在3%～4%是氮源的一個合適濃度。

3 結(jié)論

維生素B6作為動物體中的一種重要營養(yǎng)物質(zhì)，動物體本身基本不能合成（僅人體的腸道微生物能進(jìn)行微量的維生素B6的合成），只能通過飲食來獲取，而在部分植物和微生物中卻有維生素B6的生物合成途徑。本試驗(yàn)從大豆和花生根瘤中提取根瘤菌，選擇合適的高產(chǎn)菌經(jīng)16S-rDNA分子鑒定，確定實(shí)驗(yàn)菌株屬于慢生大豆根瘤菌。

通過培養(yǎng)基優(yōu)化來提高維生素B6產(chǎn)量。碳源方面，選擇葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、甘油和甘露醇，從而得出了葡萄糖在根瘤菌的生長代謝過程中利用率最高，且濃度以8%～10%為宜。氮源方面，選擇酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、大豆粉，確定了牛肉膏對根瘤菌合成維生素B6過程的促進(jìn)作用，同時為兼顧成本，牛肉膏濃度為3%～4%時性價比最高。最終，通過對培養(yǎng)基進(jìn)行初步優(yōu)化，在采用葡萄糖濃度為10%，牛肉膏濃度為4%的條件下，維生素B6的產(chǎn)量從35.30mg/L提升到了66.12mg/L。

[1]RE 布坎南,NE 吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版.北京:科學(xué)出版社,1984:340-349.

[2]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001:143-146.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部,中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5009.154-2003.食品中維生素B6的測定[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004.

[4]楊江科.花生根瘤菌遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2002.

[5]劉曉云,陳文新.三葉草、豬屎豆和含羞草植物根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP分析和數(shù)值分類研究[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,8(3):1-6.

Study on the Breeding of High Yield Vitamin B6and High Strength Fermentation

Wang Jin-hui
(Yiwu Zhejiang Tap Water Co., Ltd., Zhejiang Yiwu 322000)

In this paper, 16S-rDNA was used to identify the wild rhizobia, and the target strain was slow growing soybean rhizobia. In depth understanding of vitamin B6synthesis pathway, the medium was optimized from carbon and nitrogen sources. With YMA as basic medium, by selection of eight carbon sources and four nitrogen sources to replace YMA in the carbon or nitrogen sources, the content of vitamin B6of fermentation liquid was detected by using Pichia burtonii boidin method, to determine the production increased from 35.30 mg/L to 66.12 mg/L under the conditions of the concentration of glucose and beef extract respectively in 10% and 4%.

Vitamin B6; Rhizobium; Microorganism

TQ924

A

2096-0387（2017）01-0027-03

王金輝（1990-），男，浙江義烏人，碩士，研究方向：發(fā)酵工程。