衛(wèi)曉豐，譚秀華，梁建軍，詹 鴻

七氟醚麻醉對子代大鼠海馬神經(jīng)元自噬的影響

衛(wèi)曉豐1，譚秀華1，梁建軍2*，詹 鴻1

目的 探討七氟醚麻醉對子代大鼠海馬神經(jīng)元自噬的影響。方法 孕5～7 d的SD雌鼠18只，采用隨機數(shù)字表法將其分為3組(n=6)：對照組(C組)、七氟醚組(S組)、七氟醚+自噬抑制劑wortmannin組(SW組)。C 組母鼠僅置于麻醉箱內(nèi)，通入相同流量氧氣暴露4 h，S組和SW組母鼠給予2.8%七氟醚吸入麻醉4 h。SW組子代大鼠于出生后1～3 d腹腔注射0.5 mg/kg自噬抑制劑wortmannin，C組和S組于相同時點腹腔注射等量的生理鹽水對照。于出生后 22 d，對各組子代大鼠進行水迷宮實驗，測定其學(xué)習(xí)記憶功能，出生后28 d，完成水迷宮測試后處死子代大鼠，并取其海馬組織。采用TUNEL染色測定子代大鼠海馬組織內(nèi)神經(jīng)元的凋亡率，采用Western blot法檢測子代大鼠海馬組織內(nèi)微管相關(guān)蛋白l輕鏈3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ比值作為自噬活性的指標。結(jié)果 S組、C組子代大鼠逃避潛伏期較C組，穿越平臺次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，SW組子代大鼠逃避潛伏期較C組延長，穿越平臺次數(shù)較C組減少(P<0.05)。與C組比較，S組和SW組子代大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均升高(P<0.05)；與S組比較，SW組子代大鼠海馬神經(jīng)元的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05)。結(jié)論 大鼠孕期七氟醚麻醉對子代學(xué)習(xí)記憶功能無影響，其機制與激活生理性自噬對抗神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

七氟醚；麻醉；神經(jīng)元；自噬；凋亡；海馬

0 引言

臨床上孕婦在妊娠期間行非產(chǎn)科手術(shù)常采用全身麻醉，并且常應(yīng)用具有循環(huán)穩(wěn)定特點的七氟醚[1]。有研究表明，七氟醚麻醉可促進幼齡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，從而導(dǎo)致認知功能障礙[2]。但也有研究證實，七氟醚麻醉對子代大鼠認知功能無影響[3-4]，其機制尚不明確。自噬是細胞清除體內(nèi)錯誤蛋白質(zhì)和損害的細胞器，具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[5]。生理性自噬增強對改善認知障礙、減緩神經(jīng)退行性疾病發(fā)展具有積極意義[6]，然而自噬是否影響七氟醚麻醉后子代大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力鮮有報道。因此，本研究旨在探討七氟醚麻醉對子代大鼠海馬神經(jīng)元自噬的影響，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康孕5～7 d SD雌鼠18只，體重250～280 g，由廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供。于室溫25 ℃、濕度55%～65%的環(huán)境中飼養(yǎng)，單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。采用隨機數(shù)字表法將其分為3組(n=6)：對照組(C組)、七氟醚組(S組)、七氟醚+自噬抑制劑wortmannin組(SW組)。C組母鼠僅置于麻醉箱內(nèi)，通入相同流量氧氣暴露4 h，S組和SW組母鼠接受2.8%七氟醚吸入麻醉4 h。SW組子代大鼠于出生后1～3 d腹腔注射0.5 mg/kg自噬抑制劑wortmannin (貨號：IPA1003-0001MG，上海前塵生物科技有限公司)，C組和S組于相同時點腹腔注射等體積的二甲基亞砜(DMSO)對照。

1.2 七氟醚麻醉處理 參考相關(guān)文獻[3]對孕鼠進行七氟醚麻醉處理，將S組和SW組孕鼠置于自制麻醉箱(50 cm×30 cm×30 cm)中，接受2.8%七氟醚吸入麻醉4 h。箱底鋪鈉石灰，麻醉箱放于37 ℃恒溫水浴箱內(nèi)，以排除CO2及溫度對實驗的干擾。麻醉箱有2個通氣孔，上孔連接麻醉機，用于通入七氟醚，氧流量2 L/min，氧濃度50%，下孔位于對側(cè)，連接Ohmeda麻醉氣體監(jiān)測儀(Datex-Ohmeda公司，芬蘭)監(jiān)測MAC值，維持麻醉。C組僅置于麻醉箱內(nèi)對照，不進行七氟醚麻醉。采用便攜式血氧儀監(jiān)測麻醉期間孕鼠的脈搏血氧飽和度及心率。剔除脈搏血氧飽和度低于95%或心率下降幅度超過基礎(chǔ)值30%的大鼠。

1.3 行為學(xué)測定 水迷宮法測定子代大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，于出生后22 d取各組母鼠的子鼠，采用ZH0065型Morris水迷宮系統(tǒng)(京碩林苑科技有限公司)測定認知功能，持續(xù)7 d，第22～27天進行定位航行實驗，第28天進行空間探索實驗，實驗均于上午9∶00開始，維持水溫23 ℃。將子代大鼠從一個固定入水點面向池壁置入水中，記錄150 s內(nèi)尋找平臺的時間為逃避潛伏期，并使其在平臺上停留30 s。若150 s內(nèi)未能找到平臺，則將其引上平臺，停留30 s。隨后撤去隱匿于水中的平臺，將子代大鼠從固定處放入水中，記錄150 s內(nèi)子代大鼠游過前期放置平臺所在象限(第Ⅱ象限)的次數(shù)為穿越平臺次數(shù)。

1.4 神經(jīng)元凋亡檢測 完成空間探索實驗后，子代大鼠快速斷頭處死，快速開顱，分離出雙側(cè)海馬，取3只孕鼠子代大鼠的海馬，在Bonin′s液中固定24 h，組織塊經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋成蠟塊，延垂直脊髓長軸方向連續(xù)切片，片厚5 μm，制備切片分別用于TUNEL染色。切片常規(guī)二甲苯脫臘梯度酒精脫水后蒸餾水沖洗。3% H2O2室溫處理10 min，蒸餾水沖洗3 min×3次。標本片加TBS 1∶200新鮮稀釋ProteinaseK 37 ℃消化15 min，TBS洗1 min×3次。標本片加標記緩沖液(Labeling，buffer)，20 μL/片，以保持切片濕潤，并置樣品于濕盒中，37 ℃標記2 h，TBS洗3 min×3次。用1%的TBS稀釋SABC，均勻后50 μL/片加至切片，37 ℃反應(yīng)60 min，TBS洗5 min。DAB顯色10 min，蒸餾水沖洗5 min。蘇木素復(fù)染1 min。TBS洗，蒸餾水洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。應(yīng)用Image-pro plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析處理，高倍視野下計算子代大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡率，凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100 %。

1.5 神經(jīng)元自噬檢測 將其余3只孕鼠子代大鼠海馬用冰冷生理鹽水沖洗，經(jīng)12%分離膠、5%濃縮膠SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過電轉(zhuǎn)膜儀100 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)印蛋白至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的洗脫緩沖液室溫封閉1 h，加入兔抗大鼠LC3抗體(1∶5 000，Santa Cruz公司，美國)，4 ℃孵育過夜，洗后加過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗(1∶3 000，Santa Cruz公司，美國)，37 ℃孵育l h；洗后再移入顯色液中，曝光后顯影、定影，最后掃描并圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 子代大鼠水迷宮行為學(xué)的變化 與C組比較，SW組子代大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)較C組減少(P<0.05)。見表1。

2.2 子代大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和自噬的變化 與C組比較，S組和SW組子代大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡率和LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均升高(P<0.05)；與S組比較，SW組子代大鼠海馬神經(jīng)元的LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組子代大鼠水迷宮行為學(xué)變化比較(n=6)

注：與C組比較，*P<0.05

表2 各組子代大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比較(n=3)

注：與C組比較，*P<0.05；與S組比較，#P<0.05

3 討論

本研究采用孕早期母鼠作為麻醉處理對象，選擇其子代大鼠為研究對象，從而探討孕鼠七氟醚麻醉對子代神經(jīng)發(fā)育的影響。本實驗采用李夢圓等[3]應(yīng)用的七氟醚濃度與時點，建立動物模型，同時，麻醉期間各組孕鼠的生理指標均在正常范圍內(nèi)，排除了生理性干擾對其子代大鼠的影響。本研究結(jié)果表明，S組子代大鼠行為學(xué)與C組無顯著差異，與文獻[3]一致，提示模型制備成功。

七氟醚作為目前最常用的吸入麻醉劑[7-8]被廣泛應(yīng)用于孕婦的手術(shù)。研究表明，所有吸入麻醉藥均可通過胎盤作用于胎兒，若濃度大，血藥濃度高，則會對胎兒產(chǎn)生抑制作用[9-10]。進一步研究指出，七氟醚既可增加新生大鼠腦細胞凋亡[11]，又可抑制突觸后膜乙酰膽堿傳遞，進而抑制突觸可塑性[12]。神經(jīng)元凋亡和突觸可塑性障礙均可導(dǎo)致學(xué)習(xí)認知功能障礙。但也有大量研究證實，不同孕期接受不同濃度的七氟醚麻醉，對子代大鼠的學(xué)習(xí)認知功能均無影響，提示新生神經(jīng)元被七氟醚麻醉造成損傷的同時，將啟動自身保護系統(tǒng)。本研究證實了這種自身保護系統(tǒng)可能與海馬內(nèi)自噬有關(guān)。

自噬是保持細胞正常代謝及功能必不可少的生理過程，其在神經(jīng)損傷和修復(fù)過程中發(fā)揮雙重作用。自噬可以降解胞質(zhì)大分子和細胞器，為蛋白質(zhì)合成提供能量和氨基酸，同時能降解異常蛋白質(zhì)，防止其在神經(jīng)元內(nèi)積聚；但是自噬的過度活躍會形成自噬應(yīng)激，可能對細胞有毒性作用，并參與神經(jīng)變性疾病的致病過程[13]。自噬增強時，胞質(zhì)內(nèi)LC3Ⅰ在泛素樣反應(yīng)酶作用下，與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)生成LC3Ⅱ，并與新生成的自噬體膜結(jié)合，因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ可準確地反映細胞的自噬水平[14]。自噬可能通過清除破損線粒體延遲凋亡和對抗凋亡，自噬體吞噬去極化的線粒體，抑制細胞色素C釋放至胞漿，抑制caspase家族激活，從而減少細胞凋亡[15-16]。本研究證實，孕早期七氟醚麻醉造成子代大鼠海馬神經(jīng)元凋亡增強，然而，在后天學(xué)習(xí)記憶過程中，生理性自噬也隨之增加，對抗凋亡，使得子代大鼠并未表現(xiàn)出學(xué)習(xí)認知障礙，但在使用自噬抑制劑wortmannin打破上述平衡后，子代大鼠將表現(xiàn)為學(xué)習(xí)認知能力障礙。

綜上所述，孕期七氟醚麻醉對子代大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能無影響，其機制與激活生理性自噬對抗神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

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Influence of sevoflurane anesthesia on hippocampal neuron autophagy in offspring rats

WEI Xiao-feng1,TAN Xiu-hua1,LIANG Jian-jun2*,ZHAN Hong1

(1.Department of Anesthesiology,the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510150,China;2.Department of Anesthesiology,Sun Yat-Sen Memorial Hospital,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510280,China)

Objective To explore the influence of sevoflurane anesthesia on hippocampal neuron autophagy in offspring rats.Methods A total of 18 female SD rats with 5～7 d pregnancy were randomly divided into 3 groups (n=6):control group (group C),sevoflurane group (group S) and sevoflurane+wortmannin (autophagy inhibitory agent) group (group SW).Maternal rats in group C were exposed to the same flow of oxygen for 4 h in the anesthesia box,while maternal rats in group S and group SW were given inhalation anesthesia with 2.8% sevoflurane for 4 h.Offspring rats in group SW were given 0.5 mg/kg wortmannin via intraperitoneal injection at 1～3 d after birth,while offspring rats in group C and group S were given the same amount of saline at the same time point via intraperitoneal injection.Water maze test was carried out to determine the learning and memory function of offspring rats in each group at 22 d after birth.The offspring rats were sacrificed at 28 d after birth after the completion of water maze test,then the hippocampus were taken.The apoptosis rate of hippocampus neuron in offspring rats was measured by TUNEL staining.As the indicator for autophagy activity,the ratio of microtubule associated protein 1 light chain 3 (LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ in hippocampus neuron of offspring rat was detected by using Western bolt.Results There was no significant difference in escape latency or the number of times the offspring rats crossed the platform between group S and group C (P>0.05),and the latency in group SW was shorter than that of group C with less number of times the offspring rats crossed the platform (P<0.05).The apoptosis rate of hippocampal neurons and the LC3Ⅱ/LC3Ⅰratio of offspring rats in group S and group SW was higher than those of group C (P<0.05),while the LC3Ⅱ/LC3Ⅰratio in offspring rats in group SW was lower than that of group S (P<0.05).Conclusion Sevoflurane anesthesia at early pregnancy has no effect on learning and memory function of offspring rats,the mechanism by which it activates physiologic autophagy is associated with anti-apoptosis of neurons.

Sevoflurane;Anesthesia;Neuron;Autophagy;Apoptosis;Hippocampus

2016-07-15

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科，廣州 510150；2.中山大學(xué)附屬孫逸仙紀念醫(yī)院麻醉科，廣州 510280

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201702004