王洪財(cái)，趙 虹

miR-204通過RAP1信號(hào)通路誘導(dǎo)多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡

王洪財(cái)，趙 虹*

目的 探討多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)中miRNA-204差異表達(dá)，及其對(duì)GBM U87凋亡的影響及作用機(jī)制。方法 下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)level 3水平下的miRNA以及mRNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，基于顯著負(fù)向調(diào)控關(guān)系建立miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合單因素和多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型以及K-M生存分析識(shí)別預(yù)后相關(guān)miRNA集合，且能顯著區(qū)分GBM患者高低生存。利用生物信息學(xué)方法，挖掘GBM預(yù)后相關(guān)的調(diào)控子網(wǎng)，并通過miRNA負(fù)向調(diào)控的基因集合在KEGG通路中的映射，分析miRNA對(duì)GBM患者預(yù)后的影響。通過MTT、AO/EB對(duì)GBM細(xì)胞系U87生存率以及表型進(jìn)行檢測(cè)。Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白以及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果 共識(shí)別30個(gè)GBM預(yù)后相關(guān)的miRNA，這些miRNA構(gòu)成的集合能夠?qū)⒏呱婧偷蜕娴腉BM患者區(qū)分成兩類。共14個(gè)miRNA出現(xiàn)在負(fù)向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。其中7個(gè)預(yù)后miRNA經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)為GBM抑制子。其余7個(gè)預(yù)后miRNA中，我們識(shí)別2個(gè)重要的風(fēng)險(xiǎn)性miRNA，即miR-204和miR-210，二者的表達(dá)可能會(huì)改變下游通路的活性，從而影響GBM患者預(yù)后。miR-204能影響U87細(xì)胞增殖，使促凋亡蛋白Bax蛋白的表達(dá)升高、抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào)，使RAP1蛋白表達(dá)升高。結(jié)論 MiR-204通過RAP1信號(hào)通路調(diào)節(jié)GBM U87的凋亡,這為微小RNA可成為臨床GBM患者的有效治療藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

微小RNA；共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)；GBM；凋亡

0 引言

膠質(zhì)瘤是高發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類腫瘤，在腦部腫瘤中病死率最高。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的平均生存期只有12～15個(gè)月，間變型膠質(zhì)瘤的平均生存期也只有2～5年[1]。目前，膠質(zhì)瘤最常見的治療方法為外科切除結(jié)合放療、化療，但該治療手段對(duì)于患者的長(zhǎng)期生存率并未見明顯改善[2]?；谀X膠質(zhì)瘤的高致死率及有效治療手段的局限[3]，科研工作者針對(duì)于這種高致死性腫瘤的內(nèi)在發(fā)病分子機(jī)制進(jìn)行研究，期望能夠找到一種更加安全、有效的治療方法[4]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類長(zhǎng)度約18～26 nt 的非編碼單鏈小分子RNA[5]。目前的研究顯示，miRNAs的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤的形成密切相關(guān)[6-8]，有望成為診斷及治療膠質(zhì)瘤的新的標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)，為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的思路[9]。本文基于生物信息學(xué)方法，篩選出miR-204，并證明miR-204對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用，揭示其機(jī)制,希望能通過此項(xiàng)研究揭示膠質(zhì)瘤的新的潛在的治療方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用材料 人GBM U87由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)外科王健饋贈(zèng),用DMEM F12 (含10%小牛血清) 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)?？笲cl-2、抗Bax以及ERK1/2，P38，JNK單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling)。

1.1.2 樣本匹配的miRNA和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù) 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載GBM level 3下的基因和miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。經(jīng)樣本匹配處理，miRNA和基因表達(dá)譜包含478例樣本(腫瘤468例，正常10例)，涉及534個(gè)miRNA和17 814個(gè)基因。

1.1.3 GBM樣本的生存數(shù)據(jù) GBM樣本的臨床數(shù)據(jù)同樣從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲取，其中包含患者的ID、生存時(shí)間及生存狀態(tài)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的癌癥miRNA數(shù)據(jù) 從OncomiRDB數(shù)據(jù)庫(kù)中提取有實(shí)驗(yàn)證實(shí)的GBM相關(guān)的miRNA，關(guān)鍵詞：“glioblastoma”、“glioblastoma multiforme”、“glioblastoma stem cells”、“glioma”、“glioma CD133+ cancer stem cells”、“glioma stem-like cell”、“glioma stem cells”和“glioma-initiating cells”。結(jié)果有69個(gè)miRNA與GBM相關(guān)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測(cè)定U87細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 將1×104/L的U87 細(xì)胞接種于96孔板中,貼壁培養(yǎng)24 h后,向培養(yǎng)細(xì)胞中加入miR-204,轉(zhuǎn)染48 h。每組設(shè)定6個(gè)平行孔,并設(shè)定空白對(duì)照。在吸光度(A490)檢測(cè)。

1.2.2 Western blot分析蛋白質(zhì)的提取 PBS漂洗各組細(xì)胞2次，4 ℃、5 000 r/min離心10 min。收集細(xì)胞，加入裂解液80 μL(RIPA∶蛋白酶抑制劑=1∶100)，冰上超聲(60 Hz)打碎，10 min/次，13 500 r/min離心15 min，吸上清。BCA法測(cè)蛋白濃度。80 μg總蛋白質(zhì)濃度在8%～10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至NC膜，然后將膜置于5% 脫脂奶粉中室溫封閉2 h后，PBS沖洗。加入Bcl-2、Bax一抗(1∶1 000)和RAP1(1∶500)4 ℃過夜。用PBS-T緩沖液洗膜3次，每次15 min，然后用紅外熒光標(biāo)記二抗(1∶10 000)，對(duì)膜室溫孵育1 h后，用PBS-T沖洗NC膜3次，每次10 min。利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對(duì)膜上蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建立 對(duì)表達(dá)譜上的任意miRNA與基因，計(jì)算其皮爾森相關(guān)系數(shù)(PCC),并且隨機(jī)擾動(dòng)表達(dá)譜上的miRNA與基因的標(biāo)簽100次，重新計(jì)算PCC，最終識(shí)別出顯著負(fù)相關(guān)miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系對(duì)。結(jié)果有4 476對(duì)miRNA-mRNA顯著負(fù)相關(guān)(PCC<-0.4且P-value<0.01)，其中包含89個(gè)miRNA，1 685個(gè)基因，見圖1。

圖1 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

1.2.4 單因素和多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析 單因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型用來評(píng)價(jià)單個(gè)miRNA的表達(dá)是否是影響GBM患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。Log rankP-value<0.05為該風(fēng)險(xiǎn)因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。若風(fēng)險(xiǎn)性比HR>1，該miRNA的表達(dá)是風(fēng)險(xiǎn)性因素，若HR<1，則是保護(hù)性因素。結(jié)果有10個(gè)保護(hù)性miRNA，20 個(gè)風(fēng)險(xiǎn)性miRNA，見表1。

多因素COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型用來評(píng)價(jià)多個(gè)miRNA的表達(dá)聯(lián)合對(duì)GBM患者預(yù)后的影響。結(jié)果這30個(gè)預(yù)后相關(guān)的miRNA產(chǎn)生的Log rankP-value=4.00×10-8，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5 K-M生存分析 K-M生存分析用來評(píng)價(jià)30個(gè)預(yù)后miRNA的表達(dá)是否能顯著地區(qū)分GBM患者的高低生存率。結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P-value=7.94×10-6，見圖2。

表1 對(duì)30個(gè)預(yù)后miRNA的單因素COX分析

圖2 預(yù)后miRNA集合的K-M生存分析

1.2.6 識(shí)別預(yù)后miRNA調(diào)控的下游通路 將30個(gè)預(yù)后相關(guān)的miRNA映射到調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，提取其一步鄰居來建立預(yù)后子網(wǎng)。結(jié)果子網(wǎng)包含414對(duì)miRNA-mRNA，其中有14個(gè)miRNA和269個(gè)基因，見圖3。其中7個(gè)miRNA已經(jīng)有oncomiRDB數(shù)據(jù)證實(shí)是GBM相關(guān)的miRNA，對(duì)于剩余的7個(gè)未被證實(shí)的miRNA，利用子網(wǎng)里其負(fù)向調(diào)控的基因集合來進(jìn)行KEGG通路映射。

圖3 預(yù)后miRNA集合調(diào)控子網(wǎng)

2 結(jié)果

2.1 基于miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)下的miRNA篩選 首先構(gòu)建miRNA-mRNA負(fù)向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將30個(gè)GBM預(yù)后相關(guān)的miRNA集合映射到網(wǎng)絡(luò)中，提取其一步鄰居來構(gòu)建預(yù)后子網(wǎng)。子網(wǎng)里14個(gè)miRNA中有7個(gè)是已知的GBM抑制子。在無實(shí)驗(yàn)證實(shí)的風(fēng)險(xiǎn)miRNA中，miR-204(HR=2.85；P-value=0.004)調(diào)控的47個(gè)基因映射出了RAP1信號(hào)通路，如圖4所示。miR-204下調(diào)的基因GF正好處于通路的起始位置，其表達(dá)能影響到通路的全局調(diào)控，即下游的細(xì)胞黏附、增殖、生存基因激活等，進(jìn)一步影響GBM患者的預(yù)后。

miRNA-210(HR=2.55；P-value=0.011)負(fù)調(diào)控25個(gè)基因，映射出cAMP信號(hào)通路?；騁PCR作為cAMP信號(hào)通路的開關(guān)之一，其活性影響通路中心PKA的表達(dá)，進(jìn)一步激發(fā)對(duì)下游細(xì)胞生存、增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞死亡等功能的影響(如圖5)，最終影響GBM患者的預(yù)后。

2.2 過表達(dá)miRNA-204對(duì)GBM U87細(xì)胞存活率的影響 將miRNA-204轉(zhuǎn)染到U87細(xì)胞中作用48 h后，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，U87的生長(zhǎng)受到抑制(P<0.05)，如圖6A。同時(shí)AO/EB的結(jié)果顯示，U87細(xì)胞發(fā)生凋亡(如圖6B)。

2.3 過表達(dá)miRNA-204對(duì)GBM U87細(xì)胞凋亡通路的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-204是否通過RAP1信號(hào)通路誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡，應(yīng)用Westernblot方法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bax，同時(shí)也檢測(cè) RAP1信號(hào)通路的相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果顯示，與Control組相比，miRNA-204作用48 h后，U87細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(n=3,P<0.05)，而Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(n=3,P<0.05)，見圖7A。而RAP1蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比明顯下調(diào)(n=3,P<0.05)，見圖7B。

圖4 miR-204負(fù)調(diào)控RAP1信號(hào)通路

圖5 miR-210負(fù)調(diào)控cAMP信號(hào)通路

3 討論

miRNA是一些5′端帶磷酸基團(tuán)、3′端帶羥基,長(zhǎng)度不大于22個(gè)核苷酸的非編碼調(diào)控RNA家族[10]。研究表明，人類超過1/3的基因都受miRNA的調(diào)控[11]。miRNA具有使細(xì)胞異常分化的能力,而細(xì)胞的異常分化是腫瘤形成的關(guān)鍵,因此，miRNA 的表達(dá)很可能意味著惡性腫瘤的發(fā)生[12]。在研究人類腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)化的過程中,miRNA 基因發(fā)揮了重要作用。

本文通過生物信息學(xué)方法建立了miRNA顯著負(fù)向調(diào)控的miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，由89個(gè)miRNA和1 685個(gè)基因產(chǎn)生的包含有4 476對(duì)miRNA-mRNA負(fù)向調(diào)控關(guān)系(P-value<0.01)。共識(shí)別了30個(gè)GBM預(yù)后相關(guān)的miRNA，進(jìn)一步將其映射到負(fù)向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)當(dāng)中，最后富集出mir-204與mir-210。筆者認(rèn)為這兩個(gè)miRNA與GBM的發(fā)生發(fā)展有著較大的相關(guān)性，但有文獻(xiàn)表明miRNA210已經(jīng)參與GBM[13]。因此，本研究選擇miR-204作為后續(xù)的研究對(duì)象。

圖6 miR-204對(duì)于U87細(xì)胞活性的改變

圖7 miR-204對(duì)Bax、Bcl-2(A)及RAP1(B)蛋白的影響(n=3)

為了驗(yàn)證miR-204是否通過RAP1信號(hào)通路參與了U87細(xì)胞的凋亡，本研究檢測(cè)了Bcl-2、Bax的變化以及RAP1信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，過表達(dá)miR-204能夠增加Bax/Bcl-2的比值[14-15]，而加入miR-204作用后，RAP1蛋白表達(dá)下調(diào)。表明miR-204通過抑制RAP1蛋白表達(dá)從而誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡，從而為miRNA對(duì)GBM的治療提供了理論依據(jù)，同時(shí)為臨床GBM 的治療提供了新的方法和思路。

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miRNA-204 induces apoptosis of glioblastoma multiforme by RAP1 signaling pathway

WANG Hong-cai,ZHAO Hong*

(Department of Neurology,the 4th Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150080,China)

Objective To explore the effects and mechanisms of dysregulated miRNA-204 on the apoptosis of GBM U87.Methods We downloaded miRNA and mRNA expression data at level 3 in TCGA database,and constructed a network based on the significant miRNA-mRNA negative regulatory relations.Through combining with single and multiple factor COX risk regression models and K-M survival analysis,we identified prognostic-related miRNA sets that could significantly distinguish survival levels of patients with GBM.Using bioinformatics methods,we explored the prognostic regulation of GBM.Finally,we analyzed the effects of miRNAs on patients′prognosis by mapping targeted gene set into KEGG pathway.The survival rate and phenotype of human GBM cell line U87 were detected by AO/EB and MTT.The expression of apoptosis-related proteins and the changes of MAPK signaling pathway related proteins were detected by Western blot.Results We identified 30 miRNA related to GBM prognosis,and these miRNA can be a collection which could divided these high survival and low survival of GBM patients into two classes.A total of 14 miRNA were in the negative regulation network.Among them 7 patients with prognosis miRNA were confirmed as a GBM inhibitor.In addition,we identified two important risk miRNA,miR-204 and miR-210,in the 7 unconfirmed prognostic miRNA,and the expression of the two might alter the activity of the downstream pathway,which affected the prognosis of patients with GBM.We found that miR-204 could affect the proliferation of U87 cells,increased expression of Pro apoptotic protein Bax protein,down-regulated expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 protein,and increased RAP1 protein expression.Conclusion MiR-204 affects the apoptosis of GBM U87 through regulating RAP1 signaling pathway.This may be an effective therapeutic drug for the treatment of patients with GBM.

miRNA;Co-expression network;GBM;Apoptosis[1]

2016-04-19

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱 150080

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201702003