付 虹，戎有和

HDL對3T3-L1細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響及其機制研究

付 虹1，戎有和2*

目的 探討HDL對3T3-L1細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響及其機制。方法 通過對3T3-L1成纖維細胞的分化，培養(yǎng)符合實驗要求的3T3-L1脂肪細胞。通過葡萄糖消耗實驗和3H標記的2-脫氧葡萄糖的攝取實驗，研究HDL對葡萄糖轉(zhuǎn)運的影響，應用RT-PCR和Western blot探討其機制。結(jié)果 HDL可以促進3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運和攝取。3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的轉(zhuǎn)運和攝取過程中，蛋白在RNA轉(zhuǎn)錄水平上沒有增加，而是發(fā)生了AKT、AMPK蛋白的磷酸化。結(jié)論 HDL促進3T3-L1脂肪細胞對葡萄糖的攝取是通過AKT和AMPK兩種途徑來實現(xiàn)的。

高密度脂蛋白；3T3-L1細胞；葡萄糖轉(zhuǎn)運；胰島素抵抗

0 引言

胰島素抵抗是一個慢性非特異性炎癥持續(xù)過程[1-2]，是糖尿病、血脂異常和肥胖癥等代謝性疾病共同的生理病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對葡萄糖的利用障礙[3-4]。高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)降低是很多代謝性疾病的共同特征，有研究證實，在脂肪組織和細胞中，HDL通過調(diào)節(jié)膽固醇的轉(zhuǎn)運來發(fā)揮其抗炎作用[5]。1984年，有學者提出，升高HDL能夠使低HDL的患者受益。之后的相關(guān)研究表明，直接給予HDL的效果最明顯。本文采用3T3-L1細胞作為工具細胞，研究外源性給予HDL后對糖代謝的影響并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1小鼠成纖維細胞購自上海中科院研究所細胞庫。

1.2 試劑和藥品 HDL購自美國Calbiochem公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、地塞米松、胰島素購自Sigma公司；葡萄糖測定試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司；Triton-X100購自上海翔升生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)購自美國Clark公司；IR-β抗體、IRS-1抗體、磷酸化IRS-1抗體、AKT抗體、磷酸化AKT抗體、AMPK抗體、磷酸化AMPK抗體、β-actin抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司；磷酸化IR-β抗體購自英國Abcam公司；多克隆GLUT4抗體購自美國Chemicon公司。辣根過氧化物酶標記二抗由Bioward公司提供；PCR引物由上海Invitrigen公司合成，Trizol、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自美國Invitrigen公司，其余PT-PCR所需試劑購自美國Promega公司；PCR Marker由廣東東盛生物科技有限公司提供；瓊脂糖由Bioscience chemie公司提供；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 Mastercycler gradient 5331 PCR儀、生物分光光度計，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；水平電泳儀、電泳槽、垂直電泳儀、電泳槽，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司產(chǎn)品；Biofuge fresco低溫離心機，德國Heraeus公司產(chǎn)品；WH-2微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；EC-5型恒溫水浴儀，德國Julabo公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 3T3-L1細胞的培養(yǎng)和分化 3T3-L1成纖維細胞為梭形，胞漿內(nèi)無脂滴，培養(yǎng)基為高糖DMEM (10%胎牛血清，1%鏈霉素-青霉素的雙抗)置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2天更換培養(yǎng)基1次，至細胞單層融合達80%以上時，可進行傳代培養(yǎng)。用胰蛋白酶1 mL消化細胞1 min，待細胞變圓并從瓶壁上脫落，立即加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。調(diào)節(jié)細胞濃度為2×105個/mL，接種于24孔板或6孔板中培養(yǎng)。待細胞長滿融合后2 d，加入含1 mg/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX、0.25 mmol/L地塞米松的高糖DMEM (含10%胎牛血清)進行分化。2 d后，給予含10 mg/L胰島素的高糖DMEM (含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)2 d。此后給予高糖DMEM(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)。至第8天，95%以上3T3-L1細胞形態(tài)變成近圓形，胞漿內(nèi)充滿脂滴，分化成為成熟的脂肪細胞。整個分化過程需要8～12 d。

2.2 分化后3T3-L1細胞的形態(tài)和鑒別 分化后的3T3-L1細胞在光鏡下可見圓形脂滴，油紅O染色可以確定分化后的3T3-L1細胞是脂肪細胞。

采用油紅O染色法進行脂肪細胞的鑒定，具體方法如下：①將爬有已分化好的脂肪細胞玻片從培養(yǎng)板中取出，用PBS充分洗滌；②10%福爾馬林固定10 min；③PBS漂洗3次；④油紅O染液中浸20 min；⑤PBS漂洗4次；⑥60%乙醇漂洗；三蒸水漂洗后，晾干，置于光鏡下觀察，脂肪細胞中的脂滴呈亮紅色。

2.3 實驗分組 采用傳代10代以內(nèi)的分化后的3T3-L1脂肪細胞。分為4組：①正常組(Normal)；②高密度脂蛋白組(HDL組)；③胰島素組(Insulin組)；④胰島素+高密度脂蛋白組(Insulin+HDL組)。HDL給藥劑量通過做濃度梯度后確定。給藥時間參照文獻。

2.4 給藥 實驗采用分化后較好的3T3-L1脂肪細胞。細胞給藥前，加入無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，使細胞生長同步進入休止期。然后按照分組要求給藥。

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2.5 葡萄糖消耗量 饑餓24 h后，四組細胞分別給予不同濃度的HDL (0、1、10、100 μg/mL)孵育1 h，取細胞培養(yǎng)液上清，測定其吸光度值；1%Triton-X100裂解細胞，用Bradford法測定蛋白濃度。由此確定HDL的最佳濃度是100 μg/mL。同時，結(jié)果顯示，HDL可以增加分化后3T3-L1細胞對葡萄糖的消耗，且差異有統(tǒng)計學意義。

2.63H標記的2-脫氧葡萄糖的攝取實驗 將分化后的3T3-L1脂肪細胞分組給藥，在含0.1% BSA的低糖DMEM中培養(yǎng)24 h，取上清待測。用含0.1% BSA的KRH緩沖液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，分別加入HDL和胰島素作用30 min，然后加入3H標記的2-脫氧葡萄糖0.5 μCi/mL培養(yǎng)30 min，處理后的細胞用KRH洗滌2次，取上清液用液體閃爍儀記錄放射強度(Counts per minute，CPM)。

2.7 RT-PCR給藥處理后的細胞 PBS洗滌3次后，加入1 mL Trizol (Invitrogen)，反復吹打，將其轉(zhuǎn)移至EP管中。按照RNA提取說明書提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄過程：采用Invitrogen公司M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，并按照試劑盒說明書進行總cDNA的合成。PCR反應采用Taq DNA聚合酶(Promega)。

在Genbank中查找到小鼠的葡萄糖轉(zhuǎn)運體1 (GLUT1)的mRNA序列[基因收錄號(NM_011400)]，該基因全長2 573 bp；小鼠的葡萄糖轉(zhuǎn)運體4 (GLUT4)的mRNA序列[基因收錄號(NM_009204)]，該基因全長2 822 bp；小鼠的胰島素受體(IR)的mRNA序列[基因收錄號(NM_010568)]，該基因全長9 357 bp；小鼠胰島素受體底物-1(IRS-1)在Genbank中的mRNA序列[基因收錄號(NM_010570)]，該基因全長9 163 bp。交于公司合成引物供實驗使用。引物序列如下：

GLUT1ForwardATGGAACCACCGCTACReverseTAAGGATGCCAACGACGLUT4ForwardCCGAAAGAGTCTAAAGCGReverseGAGCCACGGTCATCAAGIRForwardTCCGCCGCTCCTATReverseCAGAGTTTCGGGTTGTAATIRSForwardGGATCGTCAATAGCGTAAReverseGCTTGGCACAATGTAGAA

按圖1篩選結(jié)果。以上引物的最佳退火溫度分別為55.7、56.6、52.5、51.5 ℃。

RT-PCR反應產(chǎn)物半定量分析：配制2%的瓊脂糖凝膠，用溴化乙錠染色，然后取5 μL PCR產(chǎn)物上樣，100 V恒壓電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察，計算目的條帶和內(nèi)參GAPDH的灰度比值。

2.8 Western blot 給藥后各組分別用胰酶消化細胞，收集，用RIPA裂解細胞，提取細胞的總蛋白并用Bradford法測定其各組濃度。之后按以下步驟檢測p-IR-β蛋白、p-IRS-1蛋白、p-AKT蛋白和p-AMPK蛋白的表達。①灌膠、上樣：其中分離膠10%，濃縮膠5%；②SDS-PAGE電泳：先恒壓85 V、20 min，待樣品全部進入分離膠后改為恒壓110 V、2 h；③轉(zhuǎn)膜：PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜條件為4 ℃，恒壓110 V，2 h；④封閉：用5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉2 h，封閉液用TBST (50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.05% Tween 20)配制；⑤一抗結(jié)合：TBST 稀釋一抗(p-IR-β抗體滴度為1∶1 000，p-IRS-1抗體滴度1∶1 000，p-AKT抗體滴度為1∶1 000，p-AMPK抗體滴度為1∶1 000，β-actin 抗體滴度為1∶200)，4 ℃過夜;⑥洗膜：TBST 漂洗3次，5 min/次；⑦二抗結(jié)合：TBST 稀釋二抗，室溫孵育2 h；⑧洗膜：TBST 漂洗4次，10 min/次；⑨顯色：使用化學發(fā)光顯色試劑進行顯色，用成像系統(tǒng)儀器觀察拍照。

3 實驗結(jié)果

3.1 已分化3T3-L1細胞圖像 按照實驗方法中的步驟對3T3-L1成纖維細胞進行分化，8～12 d后,在倒置顯微鏡下放大100倍，觀察已分化好的3T3-L1脂肪細胞，結(jié)果見圖2。倒置顯微鏡下觀察可見，3T3-L1前脂肪細胞已經(jīng)完全分化為成熟的脂肪細胞，細胞形態(tài)變成圓形或類圓形，體積變大，胞漿中可見大量透亮的、大小不等的脂滴。多數(shù)小脂滴融合成大脂滴，并將胞核推向一側(cè)，形成典型的“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)。

圖2 已分化3T3-L1細胞圖像(100×)

3.2 油紅O染色的分化后3T3-L1細胞圖像 按照實驗方法中的步驟，對已分化的3T3-L1脂肪細胞進行油紅O染色，確定細胞內(nèi)含有大量的脂滴是符合實驗要求的脂肪細胞。由圖3可見，油紅O染色法對成熟的3T3-L1脂肪細胞進行特異性染色，胞漿中可見大量的染成橙紅色的脂肪顆粒。

圖3 油紅O染色的分化后3T3-L1細胞圖像(100×)

3.3 葡萄糖試劑盒測定葡萄糖消耗 給予不同濃度HDL (100、10、1 μg/mL)，用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖消耗量，提示100 μg/mL HDL才能明顯促進脂肪細胞對葡萄糖的消耗，其濃度過小時，與Normal組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此，在后續(xù)的實驗中，HDL的劑量均為100 μg/mL。結(jié)果見圖4。

由圖5可見，HDL (100 μg/mL)組和Insulin (100 nmol/L)促進葡萄糖消耗的能力相當，而 HDL (100 μg/mL)+Insulin (100 nmol/L)組促進葡萄糖消耗的能力強于HDL組或Insulin組。提示HDL和Insulin可能存在協(xié)同作用。

圖4 各組葡萄糖消耗量比較(n>3)

圖5 各組葡萄糖消耗量比較(n>3)

3.43H標記的2-脫氧葡萄糖顯示的葡萄糖攝取 HDL (100 μg/mL)能夠促進3T3-L1脂肪細胞對放射性標記的2-脫氧葡萄糖的攝取，與陽性對照組Insulin (100 nmol/L)攝取能力相當，同時，HDL (100 μg/mL)+Insulin (100 nmol/L)組可能通過協(xié)同作用促進葡萄糖的攝取。見圖6。

圖6 各組細胞葡萄糖攝取量比較(n>3)

3.5 PT-PCR檢測和葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)的2個蛋白(GLUT1、GLUT4)及IR-β、IRS-1在RNA水平上的表達 實驗均采用5～10代分化狀態(tài)良好的3T3-L1細胞，饑餓24 h后，分為空白組和給藥組HDL (100 μg/mL)，孵育4 h，收集細胞，提取RNA。通過RT-PCR法測定給予HDL 4 h后GLUT1、GLUT4、IR-β、IRS-1各蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，HDL組和Normal組比較，脂肪細胞內(nèi)與葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)的轉(zhuǎn)運體和蛋白在RNA水平上沒有增加。見圖7。

圖7 兩組GLUT1、GLUT4、IR-β、IRS-1蛋白mRNA含量比較(n>3)

3.6 Western blot法檢測胰島素信號途徑中蛋白(IR-β、IRS-1)及其下游AKT蛋白的磷酸化情況 給藥后10 min收集各實驗組細胞。各轉(zhuǎn)運體和蛋白在RNA轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有增加，說明蛋白水平不會增加。因此，筆者檢測與葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的磷酸化情況。結(jié)果顯示，HDL組、Insulin組和HDL+Insulin組各蛋白的磷酸化程度均明顯超過Normal組。見圖8～圖10。

圖8 各組IR-β蛋白磷酸化變化(n>3)

3.7 Western blot法檢測AMPK蛋白磷酸化情況 HDL組、Insulin組和HDL+Insulin組均出現(xiàn)了AMPK的磷酸化過程，與Normal組比較差異有統(tǒng)計學意義。見圖11。

圖9 各組IRS-1蛋白磷酸化變化(n>3)

圖10 各組AKT蛋白磷酸化變化(n>3)

圖11 各組AMPK蛋白磷酸化變化(n>3)

4 討論

胰島素可以促進葡萄糖攝取，因此，本研究采用胰島素作為陽性對照組。結(jié)果顯示，HDL可以濃度依賴性地促進葡萄糖攝取，且HDL濃度為100 μg/mL時對葡萄糖的消耗最大，與10 μg/mL和1 μg/mL比較，差異有統(tǒng)計學意義。因此，后續(xù)實驗中HDL的給藥濃度為100 μg/mL。分組實驗顯示，HDL組、Insulin組、HDL+Insulin組對葡萄糖的消耗量均明顯高于空白組。隨后，3H-2-脫氧葡萄糖攝取實驗也得到相同的結(jié)論。同時，HDL+Insulin組對葡萄糖的消耗和攝取都明顯高于HDL組或Insulin組，說明HDL與Insulin可能存在協(xié)同作用，與文獻報道[6]一致。

RT-PCR研究顯示，給予HDL后，轉(zhuǎn)運葡萄糖的2個主要轉(zhuǎn)運體(GLUT1、GLUT4)和經(jīng)典的胰島素信號途徑中IR-β、IRS-1的RNA轉(zhuǎn)錄并沒有增加，說明HDL促進葡萄糖消耗和攝取并不是因為轉(zhuǎn)運蛋白生成的增加所致，推測其原因可能是蛋白磷酸化。Western blot結(jié)果顯示，在HDL促進葡萄糖轉(zhuǎn)運的過程中，IR-β、IRS-1、AKT、AMPK蛋白均發(fā)生磷酸化，與對照組相比有顯著性差異，表明HDL通過引起蛋白磷酸化通路，而實現(xiàn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運過程。

胰島素信號途徑是目前公認的胰島素促進葡萄糖攝取的信號途徑。胰島素與IR-а結(jié)合，激活β亞基的酪氨酸活性。IR-β亞基酪氨酸激酶磷酸化IRS-1蛋白，介導PI3K的P85亞基、生長因子受體結(jié)合蛋白-2(Grb-2)、Syp、SHC、Crk、Nck等一系列蛋白[7-9]。而IRS-1通過PI3K途徑來調(diào)節(jié)AKT蛋白[6,8]。AKT作為胰島素信號途徑中的下游分子，參與調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、蛋白合成、細胞存活等生物過程。另外，AKT還影響了一系列的生物學過程，包括代謝、細胞周期的調(diào)節(jié)和凋亡[10-11]。胰島素激活的AKT可以刺激脂肪細胞中葡萄糖的攝取[12-14]。此外，普遍的觀點認為，胰島素可通過胰島素信號途徑、AMPK信號途徑促進葡萄糖的攝取。有報道，在外周脂肪組織或C2C12肌細胞中，胰島素刺激可以激活PI3K/AKT和AMPK途徑[12,15]，促進葡萄糖的轉(zhuǎn)運。本研究中，HDL組、Insulin組、HDL+Insulin組IR-β酪氨酸1146位點、IRS-1絲氨酸307位點、AKT的絲氨酸473位點均出現(xiàn)明顯磷酸化，與Normal組相比有顯著差異。因此，我們認為，胰島素信號途徑參與了HDL對葡萄糖轉(zhuǎn)運的促進過程。

AMPK廣泛存在于哺乳動物的骨骼肌、肝臟、胰腺和脂肪組織中，一直被認為是調(diào)控葡萄糖和脂質(zhì)代謝的能量感受器[16-17]。AMPK是一個由α、β、γ 3個亞基構(gòu)成的異三聚體，α亞基起催化作用，β、γ亞基在維持三聚體穩(wěn)定性和作用底物特異性方面起重要作用[18-19]。AMPK-α亞基的蘇氨酸172位點磷酸化是其激活的必要條件。有研究表明，AMPK在骨骼肌的能量代謝調(diào)節(jié)中起重要作用[20]。有報道，機械刺激和電刺激均可以增加肌肉細胞內(nèi)的AMPK的活性，增加葡萄糖的攝取[21-25]。AMPK可能通過胰島素信號途徑來增加肌肉組織和小鼠的C2C12肌細胞葡萄糖的攝取[26-27]。在3T3-L1細胞中，激活AMPK也可以促進葡萄糖的轉(zhuǎn)運[28]。在內(nèi)皮細胞，給予外源性HDL誘導的NOS和NO合成也是通過激活AMPK途徑來實現(xiàn)的[29-30]。近年來，AMPK作為潛在的緩解組織胰島素抵抗的靶點，引起了人們的重視。有報道，AMPK激活在誘導脂肪因子分泌中起重要的調(diào)節(jié)作用[31-32]。本研究顯示，在3T3-L1細胞中，給予HDL后，AMPK明顯磷酸化而被激活。結(jié)果表明，HDL通過胰島素信號途徑和AMPK信號途徑促進葡萄糖的轉(zhuǎn)運。

本實驗在文獻支持的基礎(chǔ)上進行研究，通過3T3-L1細胞證實HDL促進葡萄糖轉(zhuǎn)運和攝取，既闡明了現(xiàn)象，又探索了部分機制。同時，我們還有進行進一步研究的空間和需求，有待于在不同的細胞中證實此結(jié)論，并探索更多的作用機制來闡明這一現(xiàn)象。

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Effect and mechanism of HDL on glucose transport in 3T3-L1 cells

FU Hong1,RONG You-he2*

(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China;2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of HDL on glucose transport in 3T3-L1 cells.Methods 3T3-L1 cells were cultured and induced to differentiation and maturation.The effect of HDL on glucose transport was studied by glucose consumption test and [3H]-2-deoxyglucose glucose uptake experiment.The mechanism of the effect was explored by Western blot and RT-PCR experiment.Results HDL can promote glucose transport and uptake in 3T3-L1 cells.In this process,the protein did not increase at the RNA transcriptional level,but the phosphorylation of AKT and AMPK proteins appeared.Conclusion HDL stimulates glucose uptake in 3T3-L1 cells,involving PI3K/AKT and AMPK signaling pathways.

HDL;3T3-L1 cell;Glucose transport;Insulin resistance

2016-07-26

1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學，南京 210029

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201702002