趙 敏,唐詩邈,劉冬妍
·論著·
高氧環(huán)境下ROS對腸上皮細(xì)胞表達(dá)TNF-α和HIF-1-α的影響
趙 敏,唐詩邈,劉冬妍*
目的 探討長時間高氧治療對機體造成嚴(yán)重不良反應(yīng)的原因。方法 用不同濃度的H2O2(100、200、400 μM)和85%的高氧對腸上皮細(xì)胞干預(yù)24 h后,采用免疫組織化學(xué)方法檢測高氧對TNF-α和HIF-1-α的影響。結(jié)果 與對照組相比,高氧組和各H2O2組TNF-α和HIF-1-α表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),并且高氧組明顯高于H2O2組。結(jié)論 高氧環(huán)境中腸上皮細(xì)胞的損傷伴隨著ROS的增加,因此認(rèn)為在高氧環(huán)境中ROS對腸道損傷發(fā)揮著重要作用。
高氧;活性氧;過氧化氫;TNF-α;HIF-1-α
高氧是治療一些新生兒疾病必不可少的治療措施,但是長時間的高氧治療可能會對新生兒機體器官產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性作用。在正常情況下,體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的生成和清除維持著動態(tài)平衡,ROS過量對機體器官產(chǎn)生損傷。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì),作為一種促炎細(xì)胞因子,能夠在高氧狀態(tài)下介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[1]。低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor-1-α,HIF-1-α)在修復(fù)缺氧誘導(dǎo)基因和細(xì)胞氧環(huán)境中起著關(guān)鍵作用,并反映一些關(guān)于缺氧誘導(dǎo)和氧化應(yīng)激方面的信息[2]。本研究觀察了高氧及H2O2處理后的Caco-2細(xì)胞表達(dá)TNF-α和HIF-1-α的變化,探討ROS是否為高氧對腸道損傷的主要因素。
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞 人類結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。
1.1.2 主要試劑與儀器 SeriesⅡ 3110 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)、倒置顯微鏡(北京欣惠澤奧科技有限公司)、ST 16離心機(德國Thermo公司)。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國HyClone公司);胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗(中國Genview公司);青霉素-鏈霉素(美國Biological Industries公司);過氧化氫(上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司);鼠SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉生物科技有限公司);抗TNF-α、HIF-1-α抗體(英國Abcam公司)。
1.2 實驗方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Caco-2細(xì)胞置于含有10% 胎牛血清、1% 谷氨酰胺和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中,在37 ℃、5% 的CO2孵箱中培養(yǎng),生長達(dá)80%融合時,消化傳代。
1.2.2 實驗分組 將細(xì)胞(1×106cells/mL)接種到六孔板中的蓋玻片上培養(yǎng),達(dá)到融合狀態(tài)后,分別加入不同濃度的H2O2(100、200、400 μM)處理24 h,或85%高氧孵育24 h,對照組在正常孵箱中培養(yǎng),不施加任何處理因素。
1.2.3 免疫組化檢測ROS對Caco-2細(xì)胞的影響 細(xì)胞經(jīng)4%的多聚甲醛、3% 的H2O2和山羊血清處理后,用鼠抗人TNF-α、HIF-1-α(1∶2 000)抗體4 ℃孵育過夜,然后用山羊抗小鼠抗體和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃孵育,蘇木素復(fù)染,陰性對照組使用PBS替代抗體。圖像分析軟件Image J掃描計算平均吸光度值。
2.1 ROS對TNF-α表達(dá)的影響 陰性對照組中,沒有陽性細(xì)胞染色。對照組細(xì)胞染色呈淺黃色,實驗組細(xì)胞呈黃或棕褐色(圖1A),即被100 μM H2O2處理的細(xì)胞TNF-α染色呈黃色,被200 μM H2O2、400 μM H2O2和高氧處理的細(xì)胞,TNF-α染色呈棕色或棕褐色。被高氧處理的Caco-2 細(xì)胞TNF-α的表達(dá)明顯高于對照組和H2O2組(P<0.001) (圖1B)。
2.2 高氧環(huán)境下ROS對HIF-1-α蛋白表達(dá)的影響 高氧和H2O2處理后,HIF-1-α免疫組化染色結(jié)果如圖2。對照組HIF-1-α蛋白有少量的表達(dá),主要集中于細(xì)胞漿。而實驗組中,HIF-1-α蛋白表達(dá)均有陽性結(jié)果,細(xì)胞漿呈黃或棕褐色,隨著H2O2濃度的增加以及在高氧中HIF-1-α陽性細(xì)胞數(shù)越來越多,細(xì)胞漿染色越來越明顯。高氧組的HIF-1-α表達(dá)明顯高于其他組(P<0.001) (圖2B)。
圖1 H2O2及高氧對Caco-2細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響(n=6)
圖2 H2O2及高氧對Caco-2細(xì)胞HIF-1-α表達(dá)的影響(n=6)
細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)是決定細(xì)胞生長狀態(tài)的一個關(guān)鍵因素[3]。氧化應(yīng)激是一種特殊的細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài),能夠產(chǎn)生氧自由基等物質(zhì)[4]。細(xì)胞內(nèi)ROS的平衡在防止病理狀態(tài)的改變和促進細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起著重要的作用[5-6]。一方面,ROS能夠活化細(xì)胞信號分子[7],調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞功能,包括氧化還原反應(yīng)中的能量代謝,應(yīng)激反應(yīng)和生長信號[8]。另一方面,ROS調(diào)控著細(xì)胞的生長和死亡[9]。過多生成的ROS以氧化應(yīng)激的形式減弱細(xì)胞自身的抗氧化能力,進而導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞損害[10]。
ROS在線粒體中產(chǎn)生,主要包括氧離子和H2O2[11]。H2O2是有氧代謝主要的副產(chǎn)品[12],可以顯著降低超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和脂肪酶的活性[13]。同時,H2O2影響許多細(xì)胞內(nèi)信號通路,調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號蛋白的活性,通過激活蛋白酪氨酸激酶促進酪氨酸磷酸化[14]。因此,我們研究了不同濃度的H2O2對腸上皮細(xì)胞的影響。有文獻報道,高氧能夠引起抗氧化反應(yīng),促進機體產(chǎn)生更多的ROS,增加ROS的抗氧化反應(yīng)和抗氧化蛋白的表達(dá)[15-17],同時,過多的ROS也能導(dǎo)致危重患者器官的損傷[18]。
炎癥反應(yīng)時,ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[19]。TNF-α主要是由單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。當(dāng)腸道黏膜屏障受損時,腸道黏膜Th1細(xì)胞因子如TNF-α和白介素-1可以刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS。TNF-α通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞損傷,進而增加腸道炎癥和損傷[20-21]。TNF-α在腸上皮細(xì)胞的高表達(dá)暗示其可能是腸道損傷的指示因子[20]。本研究結(jié)果顯示,100 μM H2O2處理后,Caco-2 細(xì)胞TNF-α表達(dá)明顯高于對照組和各H2O2組,充分證明了H2O2和高氧能夠誘導(dǎo)TNF-α的表達(dá),進而導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞的損傷。
在細(xì)胞質(zhì)中,TNF-α能夠激活NF-κB信號通路[22]。NF-κB也能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和上皮細(xì)胞損傷或死亡[23]。一個完整的NF-κB通路需要有適當(dāng)?shù)难鹾团潴w介導(dǎo)的 HIF的激活[24]。HIF-1-α與炎癥性腸病的發(fā)病機制高度相關(guān),并且HIF-1-α在免疫細(xì)胞中的作用越來越重要[25]。本研究結(jié)果顯示,隨著H2O2濃度的增加,HIF-1-α陽性結(jié)果也越來越明顯,高氧組HIF-1-α的表達(dá)明顯高于其他組,充分證明了在高氧環(huán)境中ROS誘導(dǎo)TNF-α和HIF-1-α的表達(dá)顯著增加。ROS在體外能明顯抑制腸上皮細(xì)胞的生長,誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和死亡,其對腸上皮細(xì)胞損傷的程度隨著濃度的增加而升高,表明高氧環(huán)境中腸上皮細(xì)胞的損傷伴隨著ROS的增加,ROS在高氧狀態(tài)下對腸上皮細(xì)胞損傷發(fā)揮著重要作用。
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Influence of ROS on intestinal epithelium TNF-α and HIF-1-α during hyperoxia
ZHAO Min,TANG Shi-miao,LIU Dong-yan*
(Medical Research Center,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)
Objective To explore the reason of severe adverse effects by prolonged hyperoxia treatment.Methods The intestinal epithelium cells were treated with different concentrations of H2O2(100,200,400 μM)and 85% oxygen for 24 h.The expression levels of TNF-α and HIF-1-α were detected by immunohistochemistry.Results Compared with control group,the expression levels of TNF-α and HIF-1-α were significantly increased in hyperoxia group and H2O2groups,and the expression levels of TNF-α and HIF-1-α were higher in hyperoxia group than those in H2O2groups (P<0.05).Conclusion The injury of intestinal epithelial cells in hyperoxia environment is accompanied by ROS increase.So we make a conclusion that ROS plays an important role in intestinal injury in hyperoxia environment.
Hyperoxia;ROS;H2O2;TNF-α;HIF-1-α
2016-10-27
中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心,沈陽110004
國家自然科學(xué)基金(30871158、81170604);遼寧省教育廳科學(xué)計劃研究項目(LK201620);盛京自由研究者基金
10.14053/j.cnki.ppcr.201702001
*通信作者