李 霞，王 毅，魏譚軍，程闊菊

HPLC波長切換法同時測定理氣散結(jié)顆粒中4個成分的含量

李 霞，王 毅*，魏譚軍，程闊菊

目的 建立同時測定理氣散結(jié)顆粒中氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮的HPLC波長切換聯(lián)合梯度洗脫法。方法 采用Venusil MP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～15 min，12.0% A；15～31 min,12.0% A→26.0% A;31～39 min,26.0% A→40.0% A;39～45 min,40.0% A→12.0% A)，流速0.9 mL/min，波長切換(0～31 min，在230 nm波長下檢測氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷；31～45 min，在242 nm波長下檢測α-香附酮)，柱溫30 ℃，進樣量為20 μL。結(jié)果 氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮4個成分的質(zhì)量濃度分別在5.15～103.00 μg/mL(r=0.999 6)、8.99～179.80 μg/mL(r=0.999 5)、19.83～396.60 μg/mL(r=0.999 9)、6.35～127.00 μg/mL(r=0.999 3)呈良好線性關(guān)系；平均加樣回收率及相應(yīng)的RSD(n=6)分別為96.83%(0.93%)、97.85%(1.31%)、99.71%(0.80%)、98.77%(1.59%)。結(jié)論 所建立的方法靈敏度高、快速、專屬性好、準(zhǔn)確度高，為理氣散結(jié)顆粒的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

理氣散結(jié)顆粒；氧化芍藥苷；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；α-香附酮；波長切換；中成藥多組分測定

0 引言

理氣散結(jié)顆粒是我院的醫(yī)院制劑，該制劑由白芍、香附、柴胡、延胡索、甘草、青皮、蜂房、山慈菇、川芎和當(dāng)歸10味中藥材加工而成，具有理氣調(diào)血、散結(jié)止痛的功效。白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽，為方中君藥，其主要成分為氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷[1]；香附疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛，為方中臣藥，其主要成分為α-香附酮[1]。原標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了性狀及理化鑒別，無其他檢測項目，難以全面有效地控制本品的質(zhì)量。

本文對方中白芍的指標(biāo)性成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷，香附的指標(biāo)性成分α-香附酮采用HPLC波長切換聯(lián)合梯度洗脫法同時進行了測定，為有效控制理氣散結(jié)顆粒的質(zhì)量、確保臨床用藥的安全有效，提供了試驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1100系列四元梯度泵高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；BS224S電子天平(德國賽多利斯公司)；820HTS型超聲波清洗機(鄭州渤銳超聲波設(shè)備有限公司)。

氧化芍藥苷對照品(39011-91-1，純度98.0%)購于上海道壹生物科技有限公司；芍藥內(nèi)酯苷對照品(39011-90-0，含量98.0%)購于上海純優(yōu)生物科技有限公司；芍藥苷對照品(110736-201539，含量96.4%)、α-香附酮對照品(110748-201513，含量99.7%)均購于中國食品藥品檢定研究院；理氣散結(jié)顆粒(每袋裝15 g，批號：20151125、20151126、20151127)來源于達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Venusil MP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫[2-7](0～15 min，12.0% A；15～31 min,12.0% A→26.0% A;31～39 min,26.0% A→40.0% A;39～45 min,40.0% A→12.0% A)；0～31 min時在230 nm[8-10]波長下檢測氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷，31～45 min在242 nm[11]波長下檢測α-香附酮；流速：0.9 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮對照品各適量，分別置于20 mL量瓶中，用稀乙醇溶解并稀釋至刻度，即得各單一成分對照品儲備溶液(氧化芍藥苷0.515 mg/mL、芍藥內(nèi)酯苷0.899 mg/mL、芍藥苷1.983 mg/mL、α-香附酮0.635 mg/mL)。再分別依次量取上面的各對照品儲備液：2.0、5.0、5.0和1.0 mL，置于同一50 mL量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取理氣散結(jié)顆粒適量，取約4.0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入稀乙醇適量，超聲提取(超聲功率為240 W，頻率為40 kHz)30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按理氣散結(jié)顆粒的處方，分別制備不含白芍的陰性樣品和不含香附的陰性樣品，按“2.2.2”項的方法制成相應(yīng)的陰性樣品溶液。

2.3 專屬性考察 精密吸取“2.2.1”～“2.2.3”項制備的溶液各適量，按照“2.1”項色譜條件進行檢測。試驗結(jié)果顯示，各陰性樣品溶液的色譜圖中，在所測氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮4個成分對應(yīng)的位置無干擾，理論塔板數(shù)按芍藥苷計不低于2 500。色譜圖見圖1。

圖1 溶液色譜圖

2.4 線性范圍考察 分別精密吸取“2.2.1”項對照品儲備液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，將其置于10 mL量瓶中并用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得到一系列濃度的混合對照品溶液，按照上述測定方法進行測定，采用質(zhì)量濃度X作為橫坐標(biāo)，測得的峰面積Y作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程,見表1。

2.5 精密度考察 取混合對照品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮峰面積的RSD(n=6)分別為1.12%、1.05%、0.76%和1.33%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

表1 線性關(guān)系實驗結(jié)果

2.6 重復(fù)性考察 取理氣散結(jié)顆粒樣品(批號：20151125)6份，按“2.2.2”項制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項的色譜條件進行測定，分別計算氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮的含量，并計算所測組分含量的RSD，結(jié)果所測4個組分的RSD依次為1.62%、1.47%、1.39%和1.84%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察 取批號20151125的供試品溶液1份，在室溫下放置0、2、4、8、16、24 h來評價供試品溶液的穩(wěn)定性，按“2.1”項色譜條件測定，測定氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮的峰面積值，并求得氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮面積的RSD分別為1.08%、0.96%、0.82%和1.11%。結(jié)果顯示供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率考察 取批號20151125的理氣散結(jié)顆粒6份，每份約2.0 g，精密稱定，分別置不同的50 mL量瓶中，精密加入混合對照品溶液25 mL、稀乙醇20 mL，超聲提取(超聲功率為 240 W，頻率為 40 kHz)30 min，放冷，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為加樣回收樣品試液。按“2.1”項色譜條件及上述檢測方法，計算4個組分的回收率及RSD，結(jié)果氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮的平均加樣回收率分別為96.83%、97.85%、99.71%、98.77%，RSD分別為0.93%、1.31%、0.80%、1.59%。2.9 樣品測定 取3批理氣散結(jié)顆粒，按“2.2.2”項制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件下進樣測定，采用外標(biāo)法計算氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和α-香附酮的含量，結(jié)果見表2。

表2 含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

3.1 樣品提取方法的選擇 本試驗分別對樣品采用加熱回流、超聲提取方式，結(jié)果采用超聲提取效果較好，且方法簡便易行；又分別采用乙醇、稀乙醇作為提取溶劑，結(jié)果稀乙醇對所測4個成分綜合提取效率較高；最后對提取時間(20、30、40 min)進行了考察,最終確定樣品的最佳提取方法為稀乙醇超聲提取30 min。

3.2 流動相的選擇 本實驗同時考察了不同的流動相體系對所測各組分的分離度和峰形影響，考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液和乙腈-0.5%磷酸溶液的流動相體系，最終優(yōu)選了乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相體系。

3.3 小結(jié) 理氣散結(jié)顆粒原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅規(guī)定了性狀及理化鑒別，難以全面有效地控制本品的質(zhì)量，本文對方中君藥白芍的指標(biāo)性成分氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和臣藥香附的指標(biāo)性成分α-香附酮進行了同時測定，方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，對理氣散結(jié)顆粒及類似復(fù)方中成藥的質(zhì)量控制和臨床用藥安全有效提供了試驗依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015:105,258.

[2]李偉銘,趙月然,楊燕云,等.HPLC波長切換法同時測定白芍飲片中9個成分的含量[J].藥物分析雜志,2011,31(12):2208-2212.

[3]劉杰,許文,李煌,等.UPLC-MS/MS法同時測定白芍飲片中10種成分[J].藥物分析雜志,2015,35(4):635-643.

[4]劉金環(huán),楊玉琴,丁秦,等.HPLC法同時測定白芍藥材中芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的含量[J].河南中醫(yī),2013,33(10):1796-1797.

[5]盧君蓉,傅超美,周莉江,等.香附醋制前后香附烯酮,圓柚酮和α-香附酮的含量比較[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20(20):24-27.

[6]王雪婷,宋德成,翟靜,等.不同產(chǎn)地香附中α-香附酮含量測定[J].創(chuàng)新技術(shù),2013,1:28-29.

[7]陳艷紅,吳秋云,蔡佳仲.17批不同產(chǎn)地香附中有效成分的含量測定[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2010,17(11):41-42.

[8]歐金梅,金傳山,黃琪,等.HPLC法同時測定白芍總苷中4種單萜苷的含量[J].中藥材,2013,36(3):423-425.

[9]杜偉鋒,胡淑珍,吳芳,等.不同等級杭白芍中3個有效成分的考察[J].中成藥,2014,36(2):358-362.

[10]陸小云,楚楚,顏繼忠.超高效液相色譜法同時測定白芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量[J].中南藥學(xué),2012,10(2):1249-1252.

[11]季寧平,盧君蓉,盛菲亞,等.不同醋制方法對香附中指標(biāo)成分含量的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2015,21(7):5-7.

Simultaneous determination of 4 components in Liqi Sanjie Keli by HPLC wavelength switching method

LI Xia,WANG Yi*,WEI Tan-jun,CHENG Kuo-ju

(Dazhou Hospital of Integrated TCM & WM,Dazhou 635000,China)

Objective To develop a joint gradient elution HPLC wavelength switching method for determination of the content of oxypaeoniflorin,alibiflorin,paeoniflorin and α-cyperone in Liqi Sanjie Keli simultaneously.Methods The Venusil MP C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) chromatographic column was adopted;the mobile phase was acetonitrile (A)-0.1% phosphoric acid solution (B) with gradient elution(0～15 min,12.0% A;15～31 min,12.0% A→26.0% A;31～39 min,26.0% A→40.0% A;39～45 min,40.0% A→12.0% A),at a flow rate of 0.9 mL/min;the detection wavelengths were set at 230 nm in 0～31 min to determine oxypaeoniflorin,alibiflorin and paeoniflorin,and 242 nm in 31～45 min to determine α-cyperone;the column temperature was set at 30 ℃;sample quantity was 20 μL.Results The quality concentration of oxypaeoniflorin,alibiflorin,paeoniflorin and α-cyperone was in good linear relationship within 5.15～103.00 μg/mL (r=0.999 6),8.99～179.80 μg/mL (r=0.999 5),19.83～396.60 μg/mL (r=0.999 9) and 6.35～127.00 μg/mL(r=0.999 3) respectively.The average recoveries and the correspondingRSDwere 96.83%(0.93%),97.85%(1.31%),99.71%(0.80%) and 98.77%(1.59%),respectively.Conclusion The established method is highly sensitive and rapid with good specificity and high accuracy.It can be applied to the quality control of Liqi Sanjie Keli.

Liqi Sanjie Keli;Oxypaeoniflorin;Alibiflorin;Paeoniflorin;α-Cyperone;Wavelength switching;Multicomponent determination of Chinese patent drug

2016-06-22

四川省達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川 達州 635000

四川省科技支撐計劃項目(2014SZ0189)

10.14053/j.cnki.ppcr.201702023

*通信作者