翁 燕，劉麗娜，周小燕，諶杰亮

建立UPLC法測定復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)中氨基酸的含量

翁 燕1，劉麗娜2，周小燕2，諶杰亮3

目的 通過優(yōu)化色譜條件建立UPLC法測定復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)中氨基酸的含量。方法 以9種氨基酸對照為外標(biāo)物，異硫氰酸苯酯為柱前衍生劑，采用ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱,流動(dòng)相A為0.1 mol/L的醋酸鈉溶液(用冰醋酸調(diào)整pH至6.50)-乙腈(93∶7)，流動(dòng)相B為乙腈-水(4∶1)，檢測波長254 nm，流速為0.45 mL/min，柱溫36 ℃。結(jié)果 復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)中9種氨基酸出峰時(shí)間與對照品出峰時(shí)間一致，其他物質(zhì)無干擾；儀器精密度RSD為0.5%～1.2%，中間精密度RSD為1.3%～1.9%；各氨基酸的溶液濃度與其峰面積線性關(guān)系良好(r≥0.999)，溶液穩(wěn)定性RSD為0.6%～1.8%，各氨基酸的平均回收率在95.0%～105.0%之間。含量測定方法比對實(shí)驗(yàn)中UPLC法與HPLC法分析結(jié)果無明顯差異，分析速度明顯提高。結(jié)論 建立的UPLC法高效，快速，靈敏，準(zhǔn)確，可用于測定復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)中氨基酸的含量。

異硫氰酸苯酯；復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)；UPLC；氨基酸；方法學(xué)驗(yàn)證

0 引言

氨基酸(Amino acid)是含氨基和羧基的有機(jī)化合物的統(tǒng)稱，是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的基本單位。氨基酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健、飼料、化妝品、農(nóng)藥、制革、科學(xué)研究等領(lǐng)域[1]。

現(xiàn)今復(fù)方制劑種類雖多，但復(fù)方氨基酸膠囊種類屈指可數(shù)。復(fù)方氨基酸膠囊(8-11)由8種必需氨基酸、11種維生素和5-羥基鄰氨基苯甲酸鹽組成的復(fù)方制劑。含各種氨基酸應(yīng)為標(biāo)示量的80.0%～120.0%[2]。復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)為9種氨基酸與5種維生素制成的復(fù)方制劑，含異亮氨酸、亮氨酸、鹽酸賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸精氨酸均應(yīng)為標(biāo)示量的80.0%～120.0%。本文研究對象為復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)。在復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，氨基酸含量測定是必檢項(xiàng)目。目前采用HPLC檢測方法，出現(xiàn)了異亮氨酸及亮氨酸分離度達(dá)不到要求、樣品分析時(shí)間長等問題。本實(shí)驗(yàn)通過建立UPLC的方法來解決樣品分析時(shí)間長的問題；同時(shí)調(diào)整梯度條件，以提高異亮氨酸和亮氨酸的分離度。

氨基酸的分析方法主要有茚三酮柱后衍生化法，異硫氰酸苯酯(PITC)柱前離線衍生化法，鄰苯二甲醛-9-芴甲基氯甲酸酯(OPA-FMOC)柱前在線衍生化法，2,4-二硝基氟苯(DNFB)柱前離線衍生化法[3-7]等；實(shí)驗(yàn)室常用的含量測定方法主要為紫外可見分光光度法[3-4]，高效液相色譜法[8]。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件，本實(shí)驗(yàn)采用異硫氰酸苯酯(PITC)柱前離線衍生化法、超高效液相色譜(UPLC)法測定復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)中氨基酸含量，力求建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的UPLC分析方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UPLC(ACQUITY UPLC H-Class，沃特斯中國有限公司)，電子分析天平(XS105，梅特勒-托利多中國有限公司)，水浴鍋(DK-S22，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，烘箱(DHG-9067A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥 復(fù)方氨基酸膠囊(批號：07221、01151、03231，南京圣和藥業(yè))；精氨酸對照品(批號：140685-201003)、蘇氨酸對照品(批號：140682-200401)、纈氨酸對照品(批號：140681-200401)、甲硫氨酸對照品(批號：140684-200401)、異亮氨酸對照品(批號：140683-200401)、亮氨酸對照品(批號：140687-200401)、苯丙氨酸對照品(批號：140676-200405)、色氨酸對照品(99.8%，批號：140686-200802)、鹽酸賴氨酸對照品(批號：140673-201006)，均購于中國藥品生物制品檢驗(yàn)所，供含量測定用；鹽酸精氨酸原料藥(批號：SYJS140501)、纈氨酸原料藥(批號：ATHR140702)、甲硫氨酸原料藥(批號：AVAI140101)、異亮氨酸原料藥(批號：2013091708)、亮氨酸原料藥(批號：APAE14030)、苯丙氨酸原料藥(批號：ALEU131221)、色氨酸原料藥(批號：107-1404020)、鹽酸賴氨酸原料藥(批號：1031408012)，均購于天津天安藥業(yè)股份有限公司，供藥用；異硫氰酸苯酯(AR，≥98.0%，C1326045，Aladdin Industry corporation)；三乙胺(≥99.0%，批號：F20111102)、冰醋酸(AR，≥99.5%，批號：14102712292)、無水乙酸鈉(AR，≥99.0%，批號：12110711921)，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷(色譜純，≥95.0%，批號：O9RM1H，Honeywell)，乙腈(色譜純，批號：OBDA1H，Honeywell)。

2 UPLC法的建立過程

2.1 色譜條件的摸索 ACQUITY UPLC方法轉(zhuǎn)換器(從HPLC至UPLC)，如圖1、圖2。

圖1 HPLC與UPLC的色譜柱信息及HPLC的初始梯度

圖2 轉(zhuǎn)換后的流速、進(jìn)樣體積及洗脫梯度

實(shí)驗(yàn)操作中，按轉(zhuǎn)換后的流速、進(jìn)樣體積及梯度進(jìn)行樣品分析，出現(xiàn)柱壓過高、異亮氨酸和亮氨酸分離度達(dá)不到要求等問題。洗脫梯度摸索過程見表1～表4，圖3。

表1 洗脫梯度1

表2 洗脫梯度2

表3 洗脫梯度3

表4 洗脫梯度4

圖3 洗脫梯度摸索試驗(yàn) UPLC色譜圖

注：A.洗脫梯度摸索1，B.洗脫梯度摸索2，C.洗脫梯度摸索3，D.洗脫梯度摸索4；1.精氨酸,2.蘇氨酸,3.纈氨酸,4.甲硫氨酸,5.異亮氨酸,6.亮氨酸,7.苯丙氨酸,8.色氨酸,9.鹽酸賴氨酸

2.2 色譜條件的確定 總結(jié)比較上述4個(gè)不同梯度洗脫及其色譜圖，確立的最終色譜條件如下：色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；檢測波長：254 nm；柱溫：36 ℃；進(jìn)樣量：0.4 μL；流速：0.45 mL/min；流動(dòng)相A：0.1 mol/L醋酸鈉溶液(用冰醋酸調(diào)整pH至6.50)-乙腈(93∶7)，流動(dòng)相B：乙腈-水(4∶1)；梯度洗脫程序見表4。

3 方法與結(jié)果

3.1 溶液配制方法

3.1.1 對照品儲備液的制備 精密稱取精氨酸對照品約60.0 mg、蘇氨酸對照品75.0 mg、纈氨酸對照品112.5 mg、甲硫氨酸對照品112.5 mg、異亮氨酸對照品112.5 mg、亮氨酸對照品127.5 mg、苯丙氨酸對照品75.0 mg、色氨酸對照品37.5 mg、鹽酸賴氨酸對照品140.6 mg，分別置于50 mL容量瓶中，加水適量，超聲30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得上述9種氨基酸對照品儲備液。

3.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取相應(yīng)的氨基酸對照品適量(相當(dāng)于異亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.1.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物中的白色、紅色、咖啡色顆粒，研細(xì)，精密稱取適量(相當(dāng)于異亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水，超聲30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.1.4 柱前衍生 取對照品溶液和供試品溶液各2 mL，先加衍生劑A(0.1 mol/L的異硫氰酸苯酯乙腈溶液)1 mL，再加入衍生劑B(1.0 mol/L的三乙胺乙腈溶液)1 mL，搖勻，靜置1 h后，加正己烷4 mL，充分振搖，放置使分層，吸取下層溶液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜濾得衍生后溶液。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 專屬性 氨基酸對照品溶液的制備：分別精密移取9種氨基酸對照品儲備液0.13 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得：精氨酸對照品、蘇氨酸對照品、纈氨酸對照品、甲硫氨酸對照品、異亮氨酸對照品、亮氨酸對照品、苯丙氨酸對照品、色氨酸對照品、鹽酸賴氨酸對照品。空白輔料溶液的制備：精密稱取輔料適量(相當(dāng)于異亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。取空白輔料溶液、空白溶劑(水)、供試品、上述9種氨基酸對照，按“3.1.4”項(xiàng)衍生方法處理得衍生后溶液，分別取衍生后溶液0.4 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖如圖4～圖7。

圖5 樣品UPLC色譜圖

圖6 空白溶劑UPLC色譜圖

圖7 精氨酸對照品UPLC色譜圖

結(jié)論：供試品溶液主峰(以精氨酸為例)的保留時(shí)間與對照品溶液主峰一致；溶劑(水)、空白輔料對氨基酸出峰無干擾，專屬性符合規(guī)定。

3.2.2 精密度 儀器精密度：取氨基酸對照品溶液，按“3.1.4”項(xiàng)衍生方法處理得衍生后溶液，分別取衍生后溶液0.4 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積與保留時(shí)間，求RSD%(峰面積RSD≤2.0%，保留時(shí)間RSD≤1.5%)。測定結(jié)果表明，各氨基酸峰面積的RSD為0.5%～1.2%，保留時(shí)間RSD為0.5%～0.9%，儀器精密度符合規(guī)定。中間精密度:兩名分析人員分別對同一批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)。記錄9種氨基酸的峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算兩人含量、保留時(shí)間的RSD(含量RSD≤2.0%，保留時(shí)間RSD≤1.5%)。兩位分析人員測定結(jié)果表明，各氨基酸含量的RSD為1.3%～1.9%，保留時(shí)間RSD為0.7%～1.1%，中間精密度符合規(guī)定。

3.2.3 線性關(guān)系 以“3.1.2”項(xiàng)中對照品溶液的濃度為100%濃度，分別精密移取“3.1.1”項(xiàng)中精氨酸對照品儲備液2.0、2.7、3.0、3.3、3.7、4.0、5.0 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀釋為對照品濃度為60%、80%、90%、100%、110%、120%、150%的溶液，按“3.1.4”項(xiàng)衍生方法處理得衍生后溶液，分別取衍生后溶液0.4 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得線性回歸方程和線性系數(shù)(相對系數(shù)r≥0.999)。結(jié)果如表5。

表5 線性回歸方程

從上述結(jié)果可看出，9種氨基酸在各自的濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r=0.999，說明在設(shè)定濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系符合規(guī)定。

3.2.4 溶液穩(wěn)定性 取供試品溶液，按“3.1.4”項(xiàng)衍生方法處理得衍生后溶液，分別在0、1、2、4、8、12，18、24 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣1次，計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)峰面積的RSD(可接受標(biāo)準(zhǔn)：RSD%≤2.0%)。測定結(jié)果表明，樣品中9種氨基酸的峰面積RSD為0.6%～1.8%,說明測定溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.5 加樣回收率 對照品溶液的制備：精密稱取相應(yīng)的氨基酸對照品適量(相當(dāng)于異亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。以“3.1.2”項(xiàng)中對照品溶液的濃度為100%濃度。80%濃度溶液的制備：精密稱取精氨酸原料藥(相當(dāng)于異亮氨酸12 mg)約8.0 mg及輔料各約53.70 mg，各3份，分別置于3個(gè)100 mL容量瓶中，用適量水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成3份80%濃度的溶液。同法，配制得到蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鹽酸賴氨酸的80%濃度的溶液。同法，配制得到各氨基酸的100%、120%濃度樣品。

對照品溶液及80%、100%、120%濃度溶液按“3.1.4”項(xiàng)衍生方法處理得衍生后溶液，分別取衍生后溶液0.4 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算結(jié)果：精氨酸9份平均回收率與RSD分別為：99.10%，1.50%；蘇氨酸9份平均回收率與RSD分別為：102.70%，1.10%；纈氨酸9份平均回收率與RSD分別為：101.70%，1.50%；甲硫氨酸9份平均回收率與RSD分別為：103.20%，0.80%；異亮氨酸9份平均回收率與RSD分別為：102.50%，0.20%；亮氨酸9份平均回收率與RSD分別為：104.90%，0.80%；苯丙氨酸9份平均回收率與RSD分別為：103.2%，1.6%；色氨酸9份平均回收率與RSD分別為：102.70%，1.70%；鹽酸賴氨酸9份平均回收率與RSD分別為：101.10%，1.80%。

結(jié)論：樣品溶液中每種氨基酸各濃度平均回收率都在99.1%～104.9%范圍內(nèi)，回收率RSD為0.2%～1.8%，因此加樣回收率符合規(guī)定。

4 含量測定方法對比

4.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：254 nm；柱溫：36 ℃；進(jìn)樣量：4 μL；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相A：0.1 mol/L醋酸鈉溶液(用冰醋酸調(diào)整pH至6.50)-乙腈(93∶7)，流動(dòng)相B：乙腈-水(4∶1)；梯度洗脫程序見表6。

4.2 溶液配制

4.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取相應(yīng)的氨基酸對照品適量(相當(dāng)于異亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

表6 HPLC法梯度洗脫程序

4.2.2 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物中的白色、紅色、咖啡色顆粒，研細(xì)，精密稱取適量(相當(dāng)于異亮氨酸15 mg)，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

4.3 試驗(yàn)過程 分別依據(jù)上述HPLC法及“2.2”項(xiàng)中UPLC法的色譜條件，各取對照品溶液分別進(jìn)樣3針，記錄每種氨基酸面積。樣品溶液配制2份平行樣，共進(jìn)樣3針。計(jì)算校正因子，樣品含量應(yīng)該為標(biāo)示量的85.0%～115.0%。

4.4 測定結(jié)果 見表7。

表7 UPLC和HPLC法含量測定結(jié)果對比

F檢驗(yàn)結(jié)果為0.19～0.71，即F

5 討論

以上方法學(xué)考察項(xiàng)目的各個(gè)結(jié)果均在可接受標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。結(jié)果顯示，用UPLC法、HPLC法測定復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)中氨基酸的含量，結(jié)果均在90%～110%之間，兩種方法分析結(jié)果無明顯差異。因此，UPLC法可用于測定復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)中氨基酸的含量能提高分析速度，節(jié)約檢測成本。

采用HPLC法測定復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)中氨基酸的含量分析時(shí)間為40 min，然而采用建立的UPLC法測定，只需要10 min，節(jié)省了30 min。同時(shí)，本文通過實(shí)驗(yàn)摸索，對進(jìn)樣體積、二元梯度的時(shí)間以及比例等進(jìn)行了優(yōu)化，運(yùn)用優(yōu)化后的色譜條件使異亮氨酸和亮氨酸的分離度達(dá)到了要求，解決了采用HPLC法測定時(shí)存在的問題，也使異亮氨酸和亮氨酸的含量測定值更加準(zhǔn)確。且樣品分析時(shí)間縮短30 min，大大減少了溶劑的使用，降低了人工成本，節(jié)省了開支。

UPLC法建立的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，出現(xiàn)了同一樣品連續(xù)進(jìn)2針，氨基酸的峰面積有較大偏差的問題，經(jīng)過討論，通過延長洗柱塞桿的時(shí)間后，問題得到解決。因復(fù)方氨基酸膠囊(9-5)中含9種氨基酸及衍生方法的特殊性，對檢驗(yàn)人員的前處理提出更高的要求。

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Measuring the content of amino acid in compound amino acid capsules(9-5)by establishing the method of UPLC

WENG Yan1,LIU Li-na2,ZHOU Xiao-yan2,CHEN Jie-liang3

(1.Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210029,China;2.Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co.,Ltd.,Nanjing 210038,China;3.China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Objective Optimal method of UPLC was established to measure the content of amino acid in compound amino acid capsules by detailed investigation of Chromatographic parameters.Methods Nine kinds of amino acids were external standard,with phenyl isothiocyanate as the derivatization agent.Use ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm× 100 mm,1.7 μm) column.The mobile phase A was 0.1 mol/L sodium acetate solution (adjusted with acetic acid to pH 6.50 )-acetonitrile (93∶7);and acetonitrile-solution(4∶1) was the mobile phase B.The detection wavelength was 254 nm;the flow rate was 0.45 mL/min;the column temperature was 36 ℃.Results The peak time of nine kinds of amino acids in Compound amino acid capsule (9-5) was the same as that of reference substance.There was no interference for other ingredients.RSDof instrument precision was 0.5%～1.2%,and intermediate precisionRSDwas 1.3%～1.9%;there was a good linear relationship of nine kinds of amino acids in different concentrations (r≥0.999);the stability of solutionRSDwas 0.6%～1.8%;the average recovery of each kind of amino acid rate was 95.0%～105.0%.There was no obvious difference between the method of UPLC and HPLC based on the content determination.UPLC improved the speed of analysis significantly.Conclusion The method of UPLC can be used for measuring the content of amino acid in compound amino acid capsules(9-5),which is efficient and accurate.

Phenyl isothiocyanate；Compound amino acid capsules(9-5)；UPLC；Amino acid；Methodology validation

2016-06-26

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029；2.南京圣和藥業(yè)有限公司，南京 210038；3.中國藥科大學(xué)，南京 210009

10.14053/j.cnki.ppcr.201702021