張 彥 夏慧敏

精準醫(yī)學在兒外科出生缺陷疾病譜中的應用

張 彥 夏慧敏

精準醫(yī)學是以個性化醫(yī)療為基礎，隨著全基因組測序技術及生物信息學的交叉應用而發(fā)展起來的新興醫(yī)學模式。復雜遺傳病的不同臨床表型都是個體基因組、轉錄組或表觀遺傳學因素等綜合作用的結果。精準醫(yī)學根據(jù)導致疾病的潛在遺傳因子對疾病進行診斷和分類，而非傳統(tǒng)的根據(jù)癥狀和體征對疾病分類的方法，從而出現(xiàn)了罹患同種疾病的“個性化差異”模式。精準醫(yī)學的重要內容是基因的檢測，通過先進的基因檢測技術，如全基因組測序、外顯子測序和轉錄組測序等，發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生相關的致病基因。因此，基因測序是精準醫(yī)學的基礎和靈魂。

一、DNA測序技術的發(fā)展及新一代測序技術的興起

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是遺傳信息的基本載體，決定了生命的延續(xù)、個體生存，甚至物種的進化。新一代測序技術（Next Generation Sequencing，NGS）應運而生，高通量，測序速度快，成本低，生成海量數(shù)據(jù)。這些優(yōu)勢使得NGS近年來被廣泛運用在基礎生物醫(yī)學研究領域，對一種疾病不同狀態(tài)和過程進行精確亞分類，精確尋找疾病的原因和治療的靶點，并為解釋疾病的發(fā)病機制開辟了新路徑。伴隨測序技術的發(fā)展，測序技術的突破不僅推動了生物學的發(fā)展，還使得那些在基礎生物學研究領域取得的成果，能夠成功運用于臨床，并將在疾病的預防控制，快速臨床診斷，個性化治療等方面起到重要的作用。

二、兒外科常見出生缺陷精準醫(yī)療的應用進展我國在出生缺陷的診療研究上有了一定的進展。近年來迅速發(fā)展起來的基因診斷技術，在出生缺陷與遺傳病檢測領域獲得廣泛應用。

1.先天性心臟病：先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是引起我國新生兒死亡的主要原因之一［1］。其病因復雜，絕大多數(shù)是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果。部分CHD臨床亞型與染色體異常有關，如22q11缺失、21號染色體三倍型等［2］。此外，迄今為止超過50個基因與CHD密切相關。CHD相關突變大部分落在一小組發(fā)育基因（例如NKX2－5，GATA4，和NOTCH1）［2］。小鼠模型研究表明，超過500種基因可誘發(fā)心臟缺陷?？上攵祟怌HD致病基因廣泛存在。

我國目前對胎兒染色體非整倍體異常篩查的技術成熟度較高［3］，仍有較大部分CHD病人無法做到產(chǎn)前診斷。隨著測序技術的飛速發(fā)展，從全基因組遺傳變異層面，國內外在CHD遺傳致病位點有大量前期研究，如MTHFR c.677 C＞T、c.1298 A＞C、MTRR c.66 A＞G等被證實［4］。Zaidi等［5］利用362例復雜CHD病人和264例對照，通過全基因組測序技術證實了一系列與His3Lys4甲基化密切相關的新發(fā)突變。Turki等［6］利用外顯子測序檢測了13個胎兒心臟結構異常（AVSD）核心家系和112個散發(fā)對照，證實了高保守性NR2F2多個罕見錯義突變，小鼠模型證實NR2F2與心臟發(fā)育過程的動脈生成有關；后續(xù)收集CHD家系證實了NR2F2區(qū)域更多的結構變異。盡管有上述各項成功的案例，并不是所有研究都能成功找到致病基因。Arrington等［7］采集有明確的常染色體顯性遺傳模式的11個不同CHD臨床表型患者的四代家系，利用全外顯子組測序技術挖掘其致病基因；然而出人意料的是，不同臨床亞型的家族成員并未確認共同的致病位點。Martin等［8］利用全外顯子測序技術檢測共17人的先天性兩葉型主動脈瓣（BAV）大家系，其中BAV病例3例，其他心血管畸形3例；然而并未有明確的致病變異確證。

上述案例顯示僅有部分病例符合孟德爾遺傳規(guī)律。遺傳變異的頻率和變異對疾病表型的貢獻度或外顯率成正比，高頻率的遺傳變異的效應值（odds ratio，OR）較低，因此對表型的貢獻度或外顯率（penetrance）較小；低頻率的遺傳變異的效應值較高，因此對疾病的貢獻度或外顯率較大［10］。因此，國內外研究人員一致認為除致病突變以外，針對不同CHD臨床亞型存在一系列效應值中等的易感變異。2013年Cordell等［9］利用全基因組基因分型技術，基于835例法洛四聯(lián)癥患者和5 159例健康對照證實12q24和13q32為遺傳易感基因；同年，Cordell等［10］利用相同的技術，基于1 995例復雜CHD患者（主要涵蓋中隔、梗阻性和紫紺型缺陷）挖掘遺傳易感基因，遺憾的是當各種臨床亞型混在一起，并未有任何易感基因證實；而進一步按臨床亞型聚類分析研究確證4p16與繼發(fā)孔型房間隔缺損（ASD）易感，且在后續(xù)417例ASD病人和2 520例對照中進一步得到驗證。

上述多個研究表明CHD不同臨床表型的遺傳機制確有不同，在后續(xù)研究中需進一步細化臨床表型，相互佐證又相互區(qū)別地對待才能從中抽絲剝繭，確認真正的致病遺傳機制。故而在后續(xù)臨床轉化研究中，應以臨床標本為本，進一步細化研究。

本中心側重于收集有明顯臨床特征的復雜型且預后較差的CHD病患，擬建立長期隨訪隊列，對不同臨床亞型的CHD進行聚類分析，利用NGS，包括全基因組甲基化測序、轉錄組測序等挖掘致病因素和潛在治療的靶點；并進一步根據(jù)預后個體差異，建立不同的預警、治療方案對疾病進行有效診斷和干預。本中心科研人員前期利用新生兒心胸外科部分復雜CHD患者的共同臨床特征：胸腺切除展開研究，回顧胸腺切除后對患兒免疫系統(tǒng)的影響，對術后不同時間段的病人進行外周血免疫細胞分選，選擇恢復期特異富集免疫細胞，利用全基因組甲基化測序技術確定CpG點甲基化與基因表達調控的關系，擬建立疾病特有的甲基化圖譜或生物標記物。并進一步在免疫細胞衰老程度、胸腺切除病人特異性標記物篩查等方向展開多方面探討。希望能從契合臨床的視角為CHD的研究添磚加瓦。

2.消化道畸形：消化道畸形是新生兒期常見的畸形之一，常見病種包括：食管閉鎖、肥厚性幽門狹窄、腸閉鎖、先天性巨結腸、肛門閉鎖、膽總管囊腫、膽道閉鎖等。國外統(tǒng)計其發(fā)生率約為3‰，國內新生兒科統(tǒng)計約占同期住院新生兒的1‰。在臨床診療技術得到大力發(fā)展的同時，科學家們仍繼續(xù)在基礎研究方面探索該類疾病的病因及發(fā)病機制，并尋求更先進可靠的診療方法。

以先天性巨結腸（Hirschsprung disease，HSCR）為例，其是新生兒期低位腸梗阻常見原因之一。普遍認為遺傳因素在先天性巨結腸的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵的作用。目前發(fā)現(xiàn)RET內多個位點突變可以解釋約30%～50%的家族性和20%的散發(fā)性先天性巨結腸發(fā)病原因。然而，目前發(fā)現(xiàn)先天性巨結腸的突變位點在不同家系中極為分散，無熱點區(qū)域存在，極少數(shù)為大片段缺失，多為點突變，錯義，無義，移碼突變［11－17］。已知RET有4種配體，分別是膠質細胞系源神經(jīng) 營養(yǎng)因子（GDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白（NRTN）、artemin（ARTN）、persephin（PSPN），它們與GDNF家族受體結合后與RET結合形成復合物，激活RET信號通路。該通路對于腸神經(jīng)系統(tǒng)的分化、發(fā)育和成熟至關重要［18］。GDNF突變常見于綜合征型先天性巨結腸，突變率為0.9%～5.5%。目前已經(jīng)檢測到多個功能突變與先天性巨結腸相關［19］。NRTN亦發(fā)現(xiàn)有限的功能突變與先天性巨結腸相關［20，21］。

然而上述配體發(fā)現(xiàn)均存在外顯率較低的現(xiàn)象，且往往與RET的功能突變分離。上述突變可能與RET的突變存在相互作用，能夠影響先天性巨結腸的臨床癥狀，而與其發(fā)病本身相關性較低。

雖然RET信號通路被廣泛認為是與先天性巨結腸發(fā)病最為密切的通路，然而由于先天性巨結腸發(fā)病率較低，已知致病突變多來源于獨立家系報道，針對該通路中的致病遺傳突變尚未有系統(tǒng)性的群體研究，缺乏系統(tǒng)性的篩查總結指導臨床診斷、治療。隨著高通量基因分型技術的廣泛應用，全基因組關聯(lián)分析（GWAS）被逐漸運用在包括先天性巨結腸在內的各種復雜疾病易感基因的發(fā)掘。2008年Garcia-Barcelo等首次證實NRG1為先天性巨結腸的易感基因［22］；2012年Tang等發(fā)現(xiàn)NRG3中11個新發(fā)結構突變被證實與先天性巨結腸相關［23］。證實在先天性巨結腸散發(fā)病例存在較家系中發(fā)現(xiàn)的罕見突變而言外顯率較低的易感基因。2014年，Kim等又提出了SLC6A20、RPRA、ABCC9等多個潛在易感基因［24］。2016年，相同的研究團隊基于SLC6A20的潛在易感位點進行精細定位提出SLC6A20多個潛在易感位點［25］。

雖然分子遺傳學取得了如上述巨大進展，但仍不能完全解釋先天性巨結腸的起因，術后提示尚有多種未發(fā)現(xiàn)的遺傳因素。特別是基于不同人群中的群體遺傳易感機制篩查，寥寥無幾，故而有待后續(xù)挖掘。但具體如何利用致病基因指導臨床診斷、治療，尚未有定論。本中心兒外科科研人員基于已知、新證、潛在先天性巨結腸遺傳致病基因或區(qū)域，利用目標區(qū)域測序技術構建遺傳診斷數(shù)據(jù)庫；針對已知的致病突變攜帶者，我們準備根據(jù)其所攜帶的致病突變劃分類型進而進行更深入的致病基因遺傳機制研究；針對攜帶未知致病突變的樣本，我們將在后續(xù)挖掘全新致病基因中進一步篩選。此外，基于單中心收集巨結腸家系樣本組，利用全基因組測序技術挖掘新發(fā)突變、罕見突變，證實全新先天性巨結腸遺傳基因?；谏鲜龉ぷ?，圍繞已知致病基因和全新挖掘出的致病基因，擬制備先天性巨結腸遺傳診斷芯片，為臨床診斷提供更為有效的證據(jù)，并為針對先天性巨結腸病人的個性化醫(yī)療提供助益。

三、出生缺陷隊列的建立及生物標本的存儲

誠然，基于先天性心臟病、先天性巨結腸本中心展開了一系列遺傳機制的臨床轉化研究。但出生缺陷的預防、診斷和治療依然面臨諸多挑戰(zhàn)。眾所周知，出生缺陷的發(fā)生是一個動態(tài)的過程，在此期間發(fā)生的許多獨立事件都可能是致病的協(xié)同作用。單純針對某一時間點的臨床樣本進行后續(xù)研究可能會有失偏頗。而隊列研究可觀察多個因素的多種臨床效應，這正是隊列法不可取代的用途，為疾病個體的精準化醫(yī)療提供了更為詳實的病程記錄。本中心基于先天性心臟病、先天性巨結腸已有前期研究基礎的疾病建立大樣本出生缺陷隊列。目前已建立前瞻性出生隊列公共平臺［26］，隊列中健康人群的已逐步生成多組學數(shù)據(jù)，包括基因組、轉錄組、蛋白組、代謝組和腸道菌群的宏基因組數(shù)據(jù)，可以綜合、立體、量化反映個體健康狀態(tài)，也可以成為各類疾病研究無可替代的黃金對照。給疾病的發(fā)生發(fā)展提供了重要的溯源研究資源，也為系統(tǒng)地、多時點地描述疾病的發(fā)展提供了可能，同時通過將生物樣本庫中的組學信息與流行病學數(shù)據(jù)、電子病歷系統(tǒng)進行整合匹配，為先天性心臟病、先天性巨結腸提供更細致的定義疾病分類，更深入的闡釋發(fā)病原因和更準確的預測疾病風險或治療效果。

而如此大規(guī)模各異生物標本的儲存是所有臨床研究的根本和重中之重。標本類型包括全血、血清、血漿、單個核細胞、疾病組織、糞便等。本中心前期建立了生物樣品采集、處理、貯存和解凍的標準化操作規(guī)程，為本項目的生物樣本采集、貯存和管理提供基礎。對臨床生物資源庫的出入庫流程、樣本捐獻者的準備、臨床樣本的采集與運輸、處理過程進行控制，以保證樣本的合理合法使用、樣本質量的穩(wěn)定性和有效性，更好地為科學研究提供準確、可靠的樣本儲備。本中心基于5年來出生隊列的建立總結了如下幾條執(zhí)行標準，以資借鑒。①設立臨床生物資源庫倫理委員會和臨床生物資源庫科學技術委員會，負責入庫項目的審批。②醫(yī)護人員和實驗室人員指導樣本捐獻者如何正確留取樣本。③門診采血人員和病房護理人員負責臨床樣本的采集，特殊樣本由臨床醫(yī)生采集。④樣本運送人員負責按時按標準運送樣本。⑤臨床生物資源庫工作人員負責核收樣本捐獻人員簽署的《知情同意書》并掃描存檔，定期檢查，如發(fā)現(xiàn)缺漏應及時與入庫申請者溝通反饋。⑥臨床生物資源庫工作人員負責樣本核收和出入庫。

此外，出生缺陷隊列的臨床資料采集也是后續(xù)大數(shù)據(jù)分析重要的參考因素；而臨床數(shù)據(jù)采集主要通過本中心的臨床大數(shù)據(jù)中心集成分散存儲在不同診療系統(tǒng)中的臨床表型、實驗室檢測、影像學檢查、診療記錄數(shù)據(jù)的遷移集成，清洗轉換，元數(shù)據(jù)抽取，實現(xiàn)異構整合；利用海量數(shù)據(jù)統(tǒng)一存儲模型，搭建高性能、高可靠、易擴展、易使用的專病主題數(shù)據(jù)倉庫，作為后續(xù)研究的數(shù)據(jù)庫基礎?；诔錾毕輰２≈黝}數(shù)據(jù)倉庫及臨床指南、專家共識、標準等已有的知識型文本，分別通過文本實體識別及語義提取、生物醫(yī)學數(shù)據(jù)挖掘技術成功構建出生缺陷醫(yī)學知識網(wǎng)絡和知識圖譜；并通過進一步集成利用深層索引、相關性挖掘、重要性標注、新穎度分析等挖掘工具，實現(xiàn)了出生缺陷精準醫(yī)學知識的抽提、注釋、聚類、關聯(lián)及分析，構建出生缺陷相關精準醫(yī)學知識庫。有助于更深入地詮釋重大出生缺陷發(fā)生的遺傳背景，闡述基因調控和功能改變在重大出生缺陷發(fā)生發(fā)展中的作用，加速認識遺傳、環(huán)境、遺傳－環(huán)境交互作用對重大出生缺陷發(fā)生的關鍵作用，從而采取有針對性的預防措施，為出生缺陷防控尤其是出生缺陷一級預防提供更新的思路。

四、展望

精準醫(yī)療是以個體化醫(yī)療為基礎，伴隨著基因組測序技術快速進步，以及生物信息與大數(shù)據(jù)科學的交叉應用而發(fā)展起來的。近年來，二代測序技術由于其快速發(fā)展和成本的降低，正在占據(jù)越來越多的市場份額。通過新一代測序生成不同層面的遺傳數(shù)據(jù)、結合臨床表型對解析不同出生缺陷個體都具有重要作用，它將大大促進我們對出生缺陷疾病譜的遺傳發(fā)病機制的理解。對于每一個患者家庭也是福音，它將能以每一個家庭為單位，鑒定其家族性的致病基因，為優(yōu)生優(yōu)育提供導向。而在人群層面上，對于出生缺陷疾病譜的進一步理解，能夠切實指導臨床治療，為特異的靶向藥物提供可能。然而以CHD為例，僅考慮遺傳因素，僅能解釋8%左右的發(fā)病原因；大部分原因是在一定的遺傳背景下結合環(huán)境因素最終致病。故而發(fā)病機制的復雜性和不確定性限制了對其風險預測、以及臨床輕重癥預警及個體精準化治療的實施。當前急需對CHD特征進行系統(tǒng)、長期跟蹤，利用母嬰和出生隊列尋找與疾病發(fā)病風險以及個體差異相關的遺傳、表觀遺傳和環(huán)境影響因素，并通過形成預防和診療指南的形式，提高新生兒和兒童的生活質量，節(jié)約社會醫(yī)療成本。

此外，完善的隊列后續(xù)追蹤研究可以為疾病預后整合個體的遺傳數(shù)據(jù)提供指南。以先天性巨結腸為例，手術治療雖能挽救患者的生命，但術后長期存在明顯的并發(fā)癥。超過50%的短段型先天性巨結腸患者術后長期存在便秘、大便失禁和小腸結腸炎等。長段型的患者長期預后則更差，大便失禁、反復發(fā)作的小腸結腸炎、代謝紊亂、發(fā)育遲緩等發(fā)生率更高，約20%需要行永久性回腸造瘺術。我們前期已基于遺傳數(shù)據(jù)證實術后腸炎特異性遺傳變異（未發(fā)表數(shù)據(jù)），基于隊列的長期隨訪，相信能夠對先天性巨結腸術后恢復的臨床指導有部分助益；能為不同臨床表型提出遺傳標記物，乃至靶向藥物?？偠灾?，精準醫(yī)學要求既要了解疾病的本質，即遺傳變異，又要在結合不同個體生活環(huán)境、自然屬性的基礎上，實現(xiàn)個體化及疾病針對性的治療。這一切都依賴于人類基因組不同層面上的研究。在過去的十年間，疾病個體的遺傳背景研究的重要性越來越受到人們重視，相信在未來，對于疾病本身的精準醫(yī)學解析一定能為醫(yī)生提供更好的預防、診斷和治療依據(jù)。

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2017—07—08）

（本文編輯：王愛蓮）

10.3969／j.issn.1671—6353.2017.04.004.

10.3969／j.issn.1671－6353.2017.04.004

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心（廣東省廣州市，510623）

夏慧敏，Email：huiminxia＠hotmail.com

本文引用格式：張彥，夏慧敏.精準醫(yī)學在兒外科出生缺陷疾病譜中的應用研究［J］.臨床小兒外科雜志，2017，16（4）：2017，16（4）：324—327.

Citing this article as：Citing this article as：Zhang Y，Xia HM.Applications of precision medicine in birth defect disease spectrum of pediatric surgery［J］.J Clin Ped Sur，2017，16（4）：324—327.DOI：10.3969／j.issn.1671—6353. 2017.04.004.