朱慧敏，王晉

（1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第三附屬醫(yī)院，河南 漯河 462000；2.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462000）

基因CKLFSF8轉(zhuǎn)染對腫瘤細(xì)胞EGFR表達(dá)的影響

朱慧敏1，王晉2

（1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第三附屬醫(yī)院，河南 漯河 462000；2.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462000）

目的研究趨化因子CKLFSF8對BGC823腫瘤細(xì)胞表皮生長因子受體（EGFR）的影響。方法用帶有綠色熒光蛋白的目的基因檢測脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染率，然后將目的基因CKLFSF8轉(zhuǎn)染BGC823腫瘤細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)分為對照組和空白對照組。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測腫瘤細(xì)胞EGFR的表達(dá)。結(jié)果目的基因CKLFSF8轉(zhuǎn)染BGC823腫瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測腫瘤細(xì)胞EGFR，結(jié)果顯示CKLFSF8基因轉(zhuǎn)染BGC823腫瘤細(xì)胞EGFR表達(dá)的陽性率比較，轉(zhuǎn)染前后陽性率分別為（95.0±3.58）%和（68.9±3.89）%，兩者相比有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論基因CKLFSF8抑制BGC823腫瘤細(xì)胞EGFR的表達(dá)。

CKLFSF8；腫瘤細(xì)胞；EGFR

趨化因子是一組具有趨化活性的小分子蛋白質(zhì)，在免疫防御過程中發(fā)揮重要作用，并可參與免疫病理損傷[1]。同時(shí)，研究[2]表明，趨化因子與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)。趨化素樣因子超家族成員8（chemokine-like factor super family,CKLFSF8）是新近發(fā)現(xiàn)的新型人類趨化因子[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞體內(nèi)基本都有該趨化因子的表達(dá)，在肺臟、肝臟和胰腺細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)，但是CKLFSF8在某些腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中也有表達(dá)的，然而關(guān)CKLFSF8對胃癌細(xì)胞表皮生長因子影響的研究尚未見到報(bào)道。為了探討趨化因子CKLFSF8在胃癌中的發(fā)生發(fā)展作用，我們實(shí)驗(yàn)室選擇胃癌細(xì)胞株BGC823為實(shí)驗(yàn)研究對象，觀察新型細(xì)胞因子CKLFSF8對胃癌細(xì)胞株BGC823表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞株BGC823由鄭州大學(xué)干細(xì)胞研究中心提供。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體TM2000購自Invitrogen公司，山羊抗人EGFR試劑盒購自森斯科公司，免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒購自森斯科公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng) 將腫瘤細(xì)胞BGC823接種于含15%的小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到90%以上時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶37oC消化細(xì)胞1 min，接種密度為1×106個(gè)/mL，細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。以帶綠色熒光蛋白的質(zhì)粒Pegfp-CKLFSF8轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞系檢測轉(zhuǎn)染率。用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的熒光蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染48 h，取出3組細(xì)胞爬片，用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測EGFR的表達(dá)情況。依次在標(biāo)本片上滴加1:500稀釋的山羊抗人EGFR抗體，PBS沖洗后，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗山羊二抗，DAB顯色，計(jì)算EGFR陽性表達(dá)率，陽性率=（陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌腫瘤細(xì)胞結(jié)果 胃癌腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)，傳至三代的BGC823細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)，大小均勻，形態(tài)規(guī)則。

2.2 基因轉(zhuǎn)染后對腫瘤細(xì)胞EGFR表達(dá)的影響 基因CKLFSF8轉(zhuǎn)染前，EGFR具有較高表達(dá)率，大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜是呈現(xiàn)棕黃色，陽性率為（95.0±3.58）%。而轉(zhuǎn)染基因CKLFSF8后EGFR的表達(dá)率有所降低，只有少量細(xì)胞的細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色，陽性率為（68.9±3.89）%，兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討論

趨化因子是一小分子結(jié)構(gòu)相似的家族蛋白質(zhì)，它有四個(gè)位置保守的半胱氨酸殘基以保證其三級結(jié)構(gòu)。根據(jù)其氨基酸序列可分為CXC（α）、CC（β）、C（δ）和CX3C（γ）4個(gè)亞家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸?；駽KLFSF8是由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心最新發(fā)現(xiàn)的新型人類趨化因子?；駽KLFSF8位于第3號染色體（3p23）上，其cDNA全長1185 bp，其中第295 816位核苷酸編碼173個(gè)氨基酸組成的CKLFSF8蛋白分子。在該實(shí)驗(yàn)研究中，將基因CKLFSF8轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞BGC823細(xì)胞中，觀察對腫瘤細(xì)胞BGC823的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖被明顯抑制，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。可見，基因CKLFSF8抑制BGC823腫瘤細(xì)胞EGFR的表達(dá)。

[1]Tanaka T,Bai Z,Srinoulprasert Y,et al.Chemokines in tumor progression and metastasis [J].Cancer Sci,2005,96(6):317-322.

[2]Koizumi K,Hojo S,Akashi T,et al.Chemokine receptors in cancer metastasis and cancer cell-derived chemokines in host immune response [J].Cancer Sci,2007,98(11): 1652-1658.

[3]Murooka TT,Ward SE,Fish EN.Chemokines and cancer [J].Int J Cancer,2004,119(45): 53.