王靜 李學(xué)濤 袁子民

摘要：目的 建立β-欖香烯納米聚合物膠束包封率和載藥量的RP-HPLC測(cè)定方法，并對(duì)其釋藥性進(jìn)行考察。方法 以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）為載體材料制備載藥膠束，采用石油醚萃取法測(cè)定包封率和載藥量，采用透析法對(duì)其釋藥性進(jìn)行研究。結(jié)果 所制備的β-欖香烯納米聚合物膠束平均包封率為89.47%，平均載藥量為8.33%，體外釋藥緩慢。結(jié)論 包封率和載藥量的測(cè)定簡便、準(zhǔn)確，所制得的膠束具有緩釋作用。

關(guān)鍵詞：β-欖香烯納米聚合物膠束；包封率；載藥量；釋藥性

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.023

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）02-0091-03

欖香烯是臨床常用的中藥廣譜抗腫瘤藥物，該藥及其脂質(zhì)體注射液和口服乳制劑通過抗增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，在體外及臨床用于腦膠質(zhì)瘤治療方面取得了較好治療效果，但也存在一定不良反應(yīng)[1-3]。β-欖香烯是由欖香烯經(jīng)精餾后去除γ、δ-欖香烯異構(gòu)體，得到的抗癌單體有效成分[4]。為增加β-欖香烯對(duì)血腦屏障的透過性及其載藥制劑在腫瘤組織的通透和滯留增強(qiáng)效應(yīng)，本課題組以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG2000）為載體材料，將其制成抗腦膠質(zhì)瘤的新型腦靶向制劑，本研究對(duì)其包封率、載藥量進(jìn)行測(cè)定，并考察其體外釋藥性，為進(jìn)一步控制本品質(zhì)量、優(yōu)化制備工藝及其應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公

司），CENCO型渦旋儀（荷蘭Breda公司），RCZ-6B3型藥物溶出度儀（改裝為釋放溶出儀，上海黃海藥檢儀器有限公司），85-1型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所），透析袋（截留分子量8000～15 000，上海華藍(lán)生物科技有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）。

β-欖香烯原料藥（含量>98%，自制），β-欖香烯對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100268- 200401，供含量測(cè)定用），DSPE-PEG2000（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)20150922），甲醇為色譜純，其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 β-欖香烯納米聚合物膠束及空白膠束的制備

采用薄膜水化法制備。精密稱取處方量的DSPE-PEG2000載體材料100 mg、β-欖香烯原料藥10 mg，置于茄形瓶中，加10 mL甲醇溶解，搖勻，于35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空干燥除去甲醇，在茄形瓶底部及內(nèi)壁形成一層均勻的脂膜，加入pH 7.4磷酸鹽緩沖液5 mL，在40 ℃水浴中水化30 min，冷卻至室溫，經(jīng)0.2 ?m聚碳酸酯膜過濾，即得透明的β-欖香烯納米聚合物膠束（β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs）[5-6]。同法制備不加β-欖香烯原料藥的空白膠束。

2.2 包封率和載藥量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為DiamonsilTM C18（5 μm， 200 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為甲醇-水（95∶5），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長210 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取β-欖香烯對(duì)照品8.30 mg置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液制備及包封率、載藥量測(cè)定 精密量取β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs 1 mL置25 mL量瓶中，加入適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得載藥膠束供試品溶液，測(cè)定膠束中總的藥物量（W1）。同法制成空白膠束對(duì)照溶液。另精密量取β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs 1 mL于5 mL離心管中，加入石油醚（30～60 ℃）3 mL，搖勻，渦旋3 min，靜置，待分層后，棄去石油醚層，同法重復(fù)萃取1次，除去未包封的游離β-欖香烯。將下層膠束加入適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，測(cè)定石油醚萃取后包封的β-欖香烯藥物量（W2），計(jì)算包封率（EE），EE（%）=W2/W1×100%[5-6]。載藥量（DL）即膠束中單位質(zhì)量的DSPE-PEG2000可以包封的藥物，DL（%）=W2/W×100%，W為DSPE-PEG2000加入量。

2.2.4 空白干擾試驗(yàn) 精密吸取上述對(duì)照品溶液、載藥膠束供試品溶液、空白膠束溶液各10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果空白膠束對(duì)本品含量測(cè)定無干擾。色圖譜見圖1。

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.5 mL于10 mL量瓶中，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=4.129 9X+6.902 1，r=0.999 8。結(jié)果β-欖香烯濃度在8.3～207.5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一載藥膠束供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果表明，精密度良好，RSD=1.62%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一載藥膠束供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果β-欖香烯在10 h內(nèi)保持穩(wěn)定，RSD=1.72%。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一載藥膠束樣品各6份，分別按載藥膠束供試品溶液制備方法操作，精密吸取各供試品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果β-欖香烯平均含量為1.82 mg/mL，RSD=2.02%，表明重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取已知含量β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs溶液（1.82 mg/mL）0.5 mL共6份，置25 mL容量瓶中，分別精密加入β-欖香烯對(duì)照品溶液（0.83 mg/mL）1.0 mL，其余按載藥膠束供試品溶液制備方法及上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1，表明本法回收率良好。

2.3 體外釋藥研究

采用透析法考察載藥膠束的體外釋藥性。分別取載藥膠束溶液（1.82 mg/mL）及β-欖香烯原料藥溶液（1.80 mg/ mL）各2 mL，置預(yù)先處理好的透析袋中，兩端扎緊，固定于槳式攪拌器上，并將透析袋置于含pH 7.4磷酸鹽緩沖液（含0.5%十二烷基硫酸鈉）釋放介質(zhì)50 mL的燒杯中，于（37.0±0.5）℃恒溫水浴中振蕩（100 r/min），分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h 取樣1 mL，過0.45 μm微孔濾膜，并補(bǔ)充同溫等量釋放介質(zhì)。平行操作3份。樣品用0.45 μm 微孔濾膜過濾，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，取濾液進(jìn)樣20 μL測(cè)定，計(jì)算累積釋放率及3份樣品各點(diǎn)的平均值，并繪制釋藥曲線，結(jié)果見圖2。從圖2中可知，在pH 7.4磷酸鹽緩沖液釋放介質(zhì)中，β-欖香烯原料藥溶液24 h內(nèi)幾乎完全釋放，而載藥膠束僅釋放70%左右，且0～2 h屬于突釋，之后釋放緩慢，表明該膠束具有緩釋性能，利于使藥物到達(dá)病灶部位的靶組織[7-10]。

3 討論

膠束包封率測(cè)定方法主要有高速離心法、透析法、葡聚糖凝膠柱層析法等，但透析法、葡聚糖凝膠柱層析法時(shí)間較長、操作繁瑣，且β-欖香烯為揮發(fā)油，不溶于水，因此洗脫劑及透析介質(zhì)很難選擇。另外，高速離心法對(duì)難溶于水的固體藥物較為適合，不適合相對(duì)密度小于水的β-欖香烯。因此，本試驗(yàn)采用石油醚萃取法，除去未包封的游離藥物，方法簡便、快速、重復(fù)性好；同時(shí)對(duì)石油醚的萃取次數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果萃取2次基本提取完全。

體外釋藥研究多采用生物膜擴(kuò)散、透析袋法等技術(shù)。本試驗(yàn)采用透析法，該法簡單、易行。釋放介質(zhì)選用與人體血漿pH值相近pH 7.4磷酸鹽緩沖液，為增加β-欖香烯在水中的溶解度及達(dá)到漏槽條件，在釋放介質(zhì)中加入十二烷基硫酸鈉作為增溶劑。

為驗(yàn)證β-ELE-DSPE-PEG2000-PMs抗腦膠質(zhì)瘤作用的靶向性，后續(xù)研究還需通過與原料藥注射液對(duì)照，結(jié)合細(xì)胞毒試驗(yàn)、細(xì)胞凋亡試驗(yàn)、細(xì)胞攝取試驗(yàn)、動(dòng)物體內(nèi)的組織分布或活體成像技術(shù)驗(yàn)證其抗腦膠質(zhì)瘤的作用及靶向性。

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（收稿日期：2016-04-08）

（修回日期：2016-04-28；編輯：陳靜