文德鑒 涂星 胡澤華 黃瓊 朱敏英 劉芬 周國麗

摘要：目的 建立紫丁香苷、異嗪皮啶HPLC同步檢測方法，考察接骨膏粉末用白醋、蜂蜜和凡士林為基質(zhì)調(diào)敷時的體外透皮吸收特性，探討土家族常用藥膏基質(zhì)的作用。方法 以離體大鼠腹部皮膚為透皮屏障，采用改良Franz擴散池模擬體外透皮吸收實驗，用HPLC測定接收液中紫丁香苷、異嗪皮啶的含量，建立經(jīng)皮吸收方程，計算累積滲透量、滲透速率等相關(guān)參數(shù)。結(jié)果 采用Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動相為乙腈-0.1%磷酸（20∶80），流速1.0 mL/min，檢測波長265 nm，紫丁香苷回歸方程A=10 686.454 6C+1565.778 8（r=1.000 0），異嗪皮啶回歸方程A=12 297.305 4C-5913.729 9（r=0.999 9）。以白醋、蜂蜜和凡士林為基質(zhì)調(diào)敷接骨膏粉末及不添加基質(zhì)時，紫丁香苷的穩(wěn)態(tài)透皮速率分別為7.549 2、4.580 3、3.890 8、5.378 4 ?g·cm-2·h-1，累積透過百分率分別為25.66%、16.11%、13.73%、18.78%；異嗪皮啶的穩(wěn)態(tài)透皮速率分別為2.536 9、1.941 8、1.178 2、2.293 6 ?g·cm-2·h-1，累積透過百分率分別為47.04%、35.06%、22.11%、41.11%。結(jié)論 以白醋為基質(zhì)，有利于促進接骨膏粉末中藥效成分的經(jīng)皮吸收；以蜂蜜和凡士林為基質(zhì)，會阻滯接骨膏粉末中藥效成分的經(jīng)皮吸收，但可作為緩釋基質(zhì)使用。

關(guān)鍵詞：蜂蜜；白醋；凡士林；接骨膏；紫丁香苷；異嗪皮啶；經(jīng)皮吸收

接骨膏[1]（鄂藥制字[2001]第MZ02-014號），為湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院于20世紀(jì)70年代初期開發(fā)的一種外用膏劑，處方來源于土家族民間流傳甚廣的“封刀接骨法”，原始方法是在四肢閉合性骨折手法復(fù)位后將活公雞搗爛與土家族藥物刺五加、刺老苞和獨正桿配伍加工制成糊膏狀，外敷跌打損傷的患處并固定。主治四肢骨折、跌打損傷（軟組織損傷）、風(fēng)濕疼痛等病癥，有接筋續(xù)骨、療傷止痛、活血化瘀等功效，研究表明該藥對骨折的愈合、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和膝骨關(guān)節(jié)炎骨髓水腫等均具有較好的治療效果[2-7]。該制劑中刺五加為主藥，其主要有效成分為紫丁香苷和異嗪皮啶等。本研究采用蜂蜜、凡士林、白醋作為基質(zhì)調(diào)和接骨膏，以離體大鼠腹部皮膚為透皮屏障，采用改良Franz擴散池模擬體外透皮吸收實驗，考察不同基質(zhì)調(diào)敷接骨膏的經(jīng)皮吸收藥動學(xué)特征，為其制劑改良和臨床運用提供參考。

1 儀器、試藥與動物

Syncronis C18色譜柱（美國Thermo公司），V6A-02型Franz擴散池（接收池面積8 mL，通透面積1 cm2，美國Perme Gear公司），SC-15智能恒溫槽（寧波新芝生物科技股份有限公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），BAS224S電子分析天平（德國賽多利斯公司），Centrifuge 5810R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），KQ-600GVDV型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

刺五加、刺老苞、獨正桿，自采，經(jīng)湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院朱敏英副教授鑒定，分別為五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr. Et Maxim.）Harms的干燥根狀莖、五加科植物黃毛楤木Aralia decaisneana Hance的根、葡萄科植物刺葡萄Vitis davidii Foex的根；凡士林（藥用輔料），南昌白云藥業(yè)有限公司；蜂蜜（藥用輔料），江山市蜂農(nóng)世家保健品有限公司；白醋，山西省太谷縣雙太釀造有限公司；紫丁香苷對照品（批號111574-201504）、異嗪皮啶（批號110837-201507），中國食品藥品檢定研究院；乙腈，美國默克公司；其他試劑均為分析純。

SPF級SD大鼠，雌雄不限，5～6周齡，體質(zhì)量（150±20）g，湖北省實驗動物研究中心，動物許可證號SCXK（鄂）2015-0018。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫丁香苷、異嗪皮啶含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱：Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（20∶80）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：265 nm；進樣量：10 ?L。分別取200 ?g/mL紫丁香苷對照品溶液，100 ?g/mL異嗪皮啶對照品溶液，含紫丁香苷、異嗪皮啶分別為200、100 ?g/mL的混合對照品及陰性對照溶液（流動相）按上述色譜條件進樣，結(jié)果見圖1。由圖可見，紫丁香苷的保留時間為10.02 min，異嗪皮啶的保留時間為25.38 min，分離度良好，流動相對樣品無明顯干擾，理論塔板數(shù)以異嗪皮啶計不少于3000。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取50、100、250、500、5000 ?L混合對照品溶液，分別置5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列濃度對照品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定紫丁香苷和異嗪皮啶的峰面積。以對照品溶液中待測成分濃度為橫坐標(biāo)，吸收峰面積為縱坐標(biāo)，計算線性回歸方程。結(jié)果紫丁香苷的回歸方程為A=10 686.454 6C+1565.778 8，r=1.000 0；異嗪皮啶的回歸方程為A=12 297.305 4C-5913.729 9，r=0.999 9。結(jié)果表明，紫丁香苷在2～200 ?g/mL、異嗪皮啶在1～100 ?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗 分別精密吸取混合對照品溶液50、250、5000 ?L，置5 mL容量瓶中，按“2.1.1”項下色譜條件，于1 d內(nèi)重復(fù)進樣5次，測定紫丁香苷和異嗪皮啶的峰面積，計算其日內(nèi)精密度；于5 d內(nèi)每日進樣3次，測定紫丁香苷和異嗪皮啶的峰面積，計算其日間精密度。結(jié)果紫丁香苷、異嗪皮啶日內(nèi)峰面積RSD分別為1.06%、0.98%，日間峰面積RSD分別為2.11%、1.76%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 分別精密吸取混合對照品溶液50、250、5000 ?L，置5 mL容量瓶中，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣3次，測定紫丁香苷和異嗪皮啶的平均峰面積，結(jié)果RSD分別為1.89%、1.25%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗 精密吸取不同基質(zhì)24 h的透皮樣品溶液0.25 mL，分別精密加入0.25 mL混合對照品溶液，置5 mL容量瓶中，混合均勻后用0.22 ?m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定紫丁香苷和異嗪皮啶的含量，計算回收率。結(jié)果無基質(zhì)和以蜂蜜、凡士林、白醋作為基質(zhì)調(diào)敷的接骨膏中紫丁香苷的回收率RSD分別為2.47%、2.64%、4.65%、1.53%，異嗪皮啶的回收率RSD分別為3.40%、1.82%、4.65%、2.13%。各組RSD均低于5%，表明本方法的回收率符合生物樣品的分析要求。

2.2 接骨膏經(jīng)皮吸收藥動學(xué)特性研究

2.2.1 樣品的制備 分別取刺五加、刺老苞和獨正桿粉碎過120目篩，按處方比例混合制成接骨膏粉末。取2 g置于具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，用甲醇補足減失的質(zhì)量，過濾，濾液過0.22 ?m微孔濾膜，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結(jié)果其中含紫丁香苷685.640 4 ?g/g，異嗪皮啶125.951 5 ?g/g。精密稱取3份接骨膏粉末1.00 g，置小燒杯中，分別精密加入蜂蜜、凡士林和白醋3.0 mL，攪拌均勻調(diào)成糊狀，即得供試樣品。

2.2.2 離體大鼠皮膚的制備 參照文獻[8-9]，取SD大鼠，10%水合氯醛0.30 g/kg腹腔注射麻醉，用剃須刀剃去大鼠鎖骨至腹部的毛，再用30 ℃的6%Na2S溶液輕輕擦拭，脫去短絨毛。放回鼠籠正常飼養(yǎng)3 d，脫頸椎處死，剪下腹部皮膚，用載玻片輕輕刮除皮下組織，用生理鹽水漂洗干凈，選擇對光透視無穿孔和皮膚角質(zhì)層完整的皮膚展開并潤濕后置于玻璃板上，覆蓋保鮮膜，置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 體外透皮吸收試驗 參照文獻[8-9]，剪取合適大?。ㄓ行つw面積為1 cm2），固定于供體池和接收池之間，使角質(zhì)層面向供體池，接收池中注入20%乙醇-生理鹽水溶液，放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，排盡接收池中的氣泡，使接收液液面與皮膚層完全接觸。設(shè)定磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為500 r/min，水浴溫度（32±0.25）℃。啟動水泵平衡0.5 h后，分別取以蜂蜜、白醋、凡士林調(diào)和的接骨膏粉末均勻敷于供體池皮膚表面，另取1份接骨膏粉末以1 mL水?dāng)嚢柰ǚ笥诠w池皮膚表面作為對照，于0.5、2、4、6、8、10、12、24 h分別取樣1 mL，并補充32 ℃等量的新鮮接收液。所取樣品液過0.22 ?m微孔濾膜，即得透皮吸收液樣品。全部實驗結(jié)束后，取下皮膚，用新鮮接收液清洗表面殘留物，濾紙吸干水分，剪碎后加入甲醇5 mL超聲提取2次，每次40 min，合并濾液，3000 r/min離心15 min，取上清液，用0.22 ?m微孔濾膜過濾，即得皮膚滯留樣品。所有樣品均按“2.1.1”項下色譜條件進樣（色譜圖見圖2），每份重復(fù)5次，以紫丁香苷和異嗪皮啶的平均峰面積計算含量，并得出接骨膏經(jīng)皮吸收藥動學(xué)參數(shù)。

累積滲透量 Q_n=（VC_n+∑_（i=1）^（n-1）?C_i V_i）/A

穩(wěn)態(tài)透皮速率 J=1/3600×dQ/dt

皮膚滯留量 Qs=VC/A

其中，A為有效擴散面積（1 cm2），V為接收液總體積（8 mL），Cn為第n次取樣時接收液中藥物質(zhì)量濃度，Ci為第i次取樣時接收液中藥物質(zhì)量濃度，Vi為取樣量（1 mL）。以Qn對取樣時間作曲線，進行線性擬合，計算回歸方程，其直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率J，直線與橫軸的交點為時滯tlag。結(jié)果見表1、圖3、圖4。

可見，不同基質(zhì)調(diào)敷接骨膏粉末中紫丁香苷和異嗪皮啶經(jīng)皮吸收過程的線性規(guī)律較明顯，透皮速率恒定，符合零級模型；且不加基質(zhì)的接骨膏粉末中紫丁香苷和異嗪皮啶的透皮速率和累積透過百分率均較高。無論是以紫丁香苷還是以異嗪皮啶為考察指標(biāo)，其透皮速率和累積滲透百分率均為白醋>無基質(zhì)>蜂蜜>凡士林，提示若以白醋為基質(zhì)可促進接骨膏中主要藥效成分紫丁香苷和異嗪皮啶的經(jīng)皮吸收，以蜂蜜或凡士林為基質(zhì)可達到緩釋藥效成分的目的。

3 討論

3.1 紫丁香苷和異嗪皮啶含量測定方法的選擇

《中華人民共和國藥典》中刺五加的質(zhì)量控制以異嗪皮啶為定性指標(biāo)，以紫丁香苷為定量指標(biāo)，相關(guān)文獻也對這2個指標(biāo)的檢測進行了報道。隆穎等[10]以Diamomsil C18（200 mm×4.6 mm，5 ?m）為色譜柱，甲醇-水（20∶80）為流動相，流速1.0 mL/min，采用265、344 nm雙波長可對紫丁香苷和異嗪皮啶進行檢測。張崇禧等[11]采用ODS-C18色譜柱，乙腈-水（20∶80）流動相、流速1.0 mL/min、265 nm波長測定紫丁香苷，乙腈-甲醇-水-冰醋酸（17∶3∶80∶1）流動相、流速1.0 mL/min、344 nm波長測定異嗪皮啶。

本研究發(fā)現(xiàn)，紫丁香苷在220、265 nm波長處有最大吸收，異嗪皮啶在210、344 nm波長處有最大吸收，綜合考慮最終采用Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），乙腈-0.1%磷酸（20∶80）為流動相，1.0 mL/min流速，在265 nm波長處檢測紫丁香苷和異嗪皮啶，線性關(guān)系、精密度、加樣回收率等均較好，簡化了紫丁香苷和異嗪皮啶的同步檢測方法。

3.2 土家族常用藥膏基質(zhì)及其作用機制

土家族常用的藥膏基質(zhì)包括蜂蜜、白醋、蜂蠟、面糊、凡士林、松香、桐油等，由于皮膚刺激性和不利于保存等因素，目前最常用的主要是蜂蜜、白醋、凡士林和蜂蠟。

現(xiàn)代研究表明，凡士林流變學(xué)特性屬于膨脹流動，具有一定的觸變性，可起到緩釋藥物的作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，以凡士林作為基質(zhì)調(diào)敷接骨膏時其有效成分紫丁香苷和異嗪皮啶的透皮速率和累積滲透量均顯著降低，與報道相符。

目前尚無研究表明白醋有促進藥物經(jīng)皮滲透的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，以白醋作為基質(zhì)調(diào)敷接骨膏粉末時可顯著增加紫丁香苷和異嗪皮啶的透皮速率和累積滲透量，其原因可能是接骨膏粉末中紫丁香苷和異嗪皮啶與醋酸形成鹽類，使藥物易于透過皮膚[13]。

現(xiàn)代研究表明，蜂蜜作為一種高度復(fù)雜的糖類飽和溶液，還富含蛋白質(zhì)、酸類化合物、酶類化合物、維生素和礦物質(zhì)，具有保肝、緩瀉、抗菌、加速創(chuàng)面修復(fù)、滋補強壯和促進組織再生的作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，以蜂蜜作為基質(zhì)調(diào)敷接骨膏時，其有效成分紫丁香苷和異嗪皮啶的經(jīng)皮吸收速率和累積滲透量均顯著降低，其原因可能與蜂蜜的黏性導(dǎo)致藥物在皮膚的滯留時間延長有關(guān)。該結(jié)果與羅躍龍等[16]報道的蜂蜜可促進藥物經(jīng)角膜滲透不一致，可能與給藥部位不一致及蜂蜜來源不同有關(guān)。

此外，刺五加具有益氣健脾、補腎安神功效，用于脾肺氣虛、體虛乏力、食欲不振、肺腎兩虛、久咳虛喘，腎虛腰膝酸痛，心脾不足、失眠多夢等，通常內(nèi)服使用。土家族醫(yī)藥中稱刺五加為刺拐棒、坎拐棒子、一百針等，多外用治療筋骨損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，刺五加中主要藥效成分紫丁香苷和異嗪皮啶可經(jīng)過皮膚吸收，為其外用給藥途經(jīng)的合理性提供了參考。

土家常用藥膏基質(zhì)蜂蜜、白醋和凡士林如何影響接骨膏的經(jīng)皮吸收，其作用機制與哪些因素有關(guān)，還有待進一步研究。

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（收稿日期：2016-03-16）

（修回日期：2016-04-20；編輯：陳靜）