陳飛宇 李澎 甘加寬 張安娜 任鈞國 劉建勛

摘要：目的 觀察樺木酸（betulinic acid，BA）對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞增殖的影響，并從細(xì)胞生長周期和細(xì)胞凋亡兩方面初步探討其抗肝癌的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞并證明其自我更新能力。CCK-8法檢測40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L BA作用人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞24、48 h的細(xì)胞活力；40、20、10、5 μmol/L BA作用人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞48 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 BA對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并呈一定的量-效關(guān)系；BA能明顯影響腫瘤干細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡，40 μmol/L BA明顯阻滯細(xì)胞周期于S期，且細(xì)胞凋亡率達(dá)到10.86%。結(jié)論 BA對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，其可能通過影響腫瘤干細(xì)胞周期及誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：樺木酸；石見穿；人肝癌HepG2細(xì)胞；腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）02-0060-05

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是緊隨肺癌、胃癌、食管癌之后的發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤。最新數(shù)據(jù)顯示，肝癌在60歲以下的男性中屬發(fā)病率最高和死亡率最高的癌癥[1]。由于肝癌的高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移率和化療抗藥性，治療效果并不樂觀。近年來，越來越多的學(xué)者認(rèn)為徹底治愈腫瘤的有效療

法除針對腫瘤組織中的大部分腫瘤細(xì)胞，更重要的是靶向其中的腫瘤干細(xì)胞[2-3]。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）是腫瘤組織中存在的極小部分細(xì)胞，通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)受到細(xì)胞因子等影響時(shí)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這均源于CSC擁有很強(qiáng)的自我更新及增殖分化的能力。我們前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠為模型進(jìn)行體內(nèi)篩選，發(fā)現(xiàn)中藥石見穿具有較好的抗腫瘤作用[4-5]，進(jìn)一步對石見穿進(jìn)行化學(xué)成分分析，發(fā)現(xiàn)樺木酸（betulinic acid，BA）為石見穿發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效成分之一。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察BA對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞增殖的影響，并從細(xì)胞生長周期和細(xì)胞凋亡兩方面初步探討其抗肝癌的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞株，中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號(hào)TCHu72。

1.2 主要試劑與儀器

BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普藥業(yè)），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培養(yǎng)基（Gibco），肝素（Sigma），B27神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑（Gibco），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，Acro Biosystem），成纖維細(xì)胞生長因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青鏈霉素混合液（Solarbio），磷酸鹽緩沖液（HyClone），0.25%胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），無酚紅DMEM（Macgene），CCK-8試劑盒（Dojindo），細(xì)胞周期試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)ITC Annexin V凋亡試劑盒（BD）。MCO175型CO2培養(yǎng)箱（德國Galaxy公司），TH-200型顯微鏡（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶標(biāo)儀（美國Biotek公司），IEC-CL31R型離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司），NAVISO型流式細(xì)胞儀（美國Bechman Coulter公司），JCSO344型高壓蒸汽滅菌鍋（日本Hirayama公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[6-7]進(jìn)行無血清培養(yǎng)基的制備及人肝癌HepG2腫瘤球干細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代。

2.1.1 無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基制備 在DMEM/F12培養(yǎng)基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。

2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 正常培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞，胰酶消化無血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，稀釋為2×103/mL，2.5 mL/孔，則5×103/孔接種于低吸附6孔板。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 d后可觀察到有懸浮細(xì)胞球形成。每3 d半量換液。

2.1.3 細(xì)胞傳代 當(dāng)細(xì)胞形成懸浮細(xì)胞球（約6 d），進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將含細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞收集于離心管中，800 r/min離心5 min，1 mL胰酶替代物TrypLE Express消化，加胰酶時(shí)吹打幾下稍等片刻，即可加PBS稀釋，離心洗滌2～3次后無血清培養(yǎng)基重懸，再取適量加無血清培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)。

2.2 分組和給藥

正常組：DMEM培養(yǎng)基；對照組：DMEM培養(yǎng)基（含0.01%DMSO）；5-FU組：10 μg/mL 5-FU；BA各劑量組：DMSO為溶劑制備40 mmol/L BA，實(shí)驗(yàn)過程中以1000倍培養(yǎng)液稀釋為40 μmol/L，同時(shí)等比對倍稀釋分別得到濃度為20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的BA培養(yǎng)液。

2.3 細(xì)胞自我更新能力驗(yàn)證

收集腫瘤干細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基稀釋為每毫升500個(gè)。在低吸附96孔板上每孔加入150 μL無血清培養(yǎng)基，并將稀釋好的腫瘤干細(xì)胞2 μL/孔加入96孔板。鏡下觀察，選取有且僅有1個(gè)細(xì)胞的孔每日拍照記錄。

2.4 細(xì)胞增殖檢測

將對數(shù)生長期的人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞制成1×108/L的細(xì)胞懸液，接種于低吸附96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換不含細(xì)胞因子的DMEM/F12培養(yǎng)基同步化使細(xì)胞處于G0期，24 h后分組處理，分別培養(yǎng)于BA濃度為40、20、10、5 μmol/L的無血清培養(yǎng)基中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后棄上清液，PBS沖洗1遍后每孔加入配制好的CCK-8試劑120 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。將顯色完成的液體轉(zhuǎn)移至正常96孔板中，于酶標(biāo)儀波長490 nm處檢測吸光度（OD）值。計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（對照孔OD值-給藥孔OD值）÷對照孔OD值×100%。

2.5 細(xì)胞周期檢測

將人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞用胰酶替代物消化，無血清培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)，稀釋為5×103/mL，3 mL/孔接種于6孔板中。待細(xì)胞穩(wěn)定成球，將各孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500 r/min離心5～10 min，吸棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗1遍，加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行同步化。24 h后按上述方法離心，吸棄無血清培養(yǎng)基，按照分組給藥。藥物作用48 h后，將各組細(xì)胞培養(yǎng)液收集到離心管中。1000×g離心3～5 min，沉淀細(xì)胞。吸除上清，加入約1 mL冰浴預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。再次離心沉淀細(xì)胞，棄上清，加入1 mL冰浴預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打均勻，4 ℃固定，過夜。離心，沉淀細(xì)胞，棄上清液，用1 mL冰浴PBS沖洗1遍。每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞，37 ℃避光溫浴30 min，24 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測。

2.6 細(xì)胞凋亡檢測

將人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞用胰酶替代物消化，無血清培養(yǎng)液重懸，計(jì)數(shù)，稀釋為5×103/mL，3 mL/孔接種于6孔板中。待細(xì)胞穩(wěn)定成球，將各孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500 r/min離心5～10 min，吸棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗1遍，加入無血清培養(yǎng)基進(jìn)行同步化。24 h后按上述方法離心，吸棄無血清培養(yǎng)基，按照分組給藥。藥物作用48 h后，將各組細(xì)胞培養(yǎng)液收集到離心管中，1500 r/min離心5～10 min，吸棄上清液，加入1 mL冰浴預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次。用1×Binding Buffer緩沖液制成1×106/mL的懸液，吸取上述懸液100 μL至Falcon試管，加入FITC Annexin V和碘化丙啶染料，輕輕渦旋，室溫避光放置15 min后，分別加入1×Binding Buffer緩沖液400 μL，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測，嚴(yán)格按照凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，各組數(shù)據(jù)通過正態(tài)性分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，組間比較采用方差分析或者非參數(shù)檢驗(yàn)法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞自我更新能力

選取有且僅有1個(gè)細(xì)胞的孔連續(xù)觀察，第6日可看到細(xì)胞增殖，第8日細(xì)胞增殖數(shù)目明顯增多。結(jié)果見圖1。

5 討論

BA是一種五環(huán)三萜類化合物，最早發(fā)現(xiàn)于樺木屬植物白樺的樹皮中。研究發(fā)現(xiàn)，BA具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等多種藥理活性[8]，其中抗腫瘤是該化學(xué)成分的主要藥理作用。20世紀(jì)90年代，科學(xué)家對2500種植物提取物進(jìn)行抗癌活性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BA對人黑色素瘤具有選擇性的抗癌活性[9]，隨后在乳腺癌、腦癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、白血病等常見腫瘤中均驗(yàn)證了BA的抗腫瘤作用[10]。與BA對多種腫瘤具有潛在毒性不同的是，非腫瘤細(xì)胞及正常組織對BA有相對抵抗性[11]。 目前關(guān)于BA的抗腫瘤作用及機(jī)制已進(jìn)行了許多研究，但有關(guān)該化學(xué)成分對肝癌的作用研究至今還未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察對無血清培養(yǎng)的人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力進(jìn)行了驗(yàn)證。其次，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BA作用48 h后，對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞增殖活力抑制作用增強(qiáng)，并呈明顯的量-效關(guān)系。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，BA對HepG2細(xì)胞的IC50為19.68 μmol/L，而該實(shí)驗(yàn)中BA作用于HepG2干細(xì)胞48 h的IC50為18.30 μmol/L，表明BA在抑制HepG2干細(xì)胞與HepG2細(xì)胞的增殖活力上效果相似。我們通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，高濃度BA（40 μmol/L）能抑制HepG2腫瘤干細(xì)胞從S期進(jìn)入G2/M期，將其阻滯于S期，表明高濃度BA通過抑制DNA的合成抑制HepG2細(xì)胞的生長。而5-FU則是將HepG2干細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期來抑制細(xì)胞增殖，表明BA與5-FU對HepG2干細(xì)胞具有不同的作用途徑，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞凋亡是正常的生理過程，此過程中，細(xì)胞膜保持完整，胞內(nèi)物質(zhì)不釋放出胞外，不引發(fā)胞外組織的炎性反應(yīng)[12]。有研究表明，BA通過誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮其抗腫瘤作用。蔣孟軍等[13]認(rèn)為，BA能夠體外抑制胰腺癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chakraborty B等[14]也發(fā)現(xiàn)，BA衍生物是人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，BA可明顯誘導(dǎo)HepG2腫瘤干細(xì)胞凋亡，且具有明顯的濃度依賴性。40 μmol/L BA作用于HepG2細(xì)胞后，其凋亡率可達(dá)10.86%，可見BA的抗腫瘤作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期之間有許多潛在的關(guān)系，通常細(xì)胞先被阻滯于細(xì)胞的某一周期，然后誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，目前很多腫瘤化療藥物正是通過細(xì)胞周期阻滯來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。蔣孟軍等[13]研究表明，BA將胰腺癌細(xì)胞阻滯于G0期來誘導(dǎo)其凋亡。Foo J B等[15]發(fā)現(xiàn)，BA作為黃花第倫桃二氯甲烷提取物的主要成分，通過p53/p21通路將乳腺癌MCF-7細(xì)胞阻滯于G0/G1期。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低濃度BA（5～20 μmol/L）幾乎對細(xì)胞周期沒有影響，而對HepG2細(xì)胞的凋亡率作用顯著，可見BA對HepG2腫瘤干細(xì)胞的凋亡與周期阻斷并無特定聯(lián)系。高濃度處理的細(xì)胞被阻滯于S期，說明BA通過S期阻斷而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能是BA誘導(dǎo)HepG2腫瘤干細(xì)胞凋亡作用途徑的一部分，而低濃度BA誘導(dǎo)凋亡的作用方式并未通過細(xì)胞周期阻滯實(shí)現(xiàn)，這與高濃度BA誘導(dǎo)凋亡的途徑不同。因此，BA誘導(dǎo)HepG2干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡可能是多途徑的復(fù)雜過程，BA對人肝癌HepG2腫瘤干細(xì)胞的增殖抑制作用仍有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2016-04-20）

（修回日期：2016-05-05；編輯：華強(qiáng)）