崔新潔，夏瑾，邵鐵娟，何一中

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053

中藥抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜研究進展

崔新潔，夏瑾，邵鐵娟，何一中

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053

金黃色葡萄球菌是臨床感染最為常見的病原菌，抗生素濫用使細菌耐藥性增強，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是主要突變株。生物膜的產(chǎn)生進一步降低了抗生素對MRSA菌體的殺傷作用，使該療法受到更多限制。新的抗MRSA感染藥物亟待開發(fā)，中藥作為天然藥物受到更多關(guān)注，本文就近年來中藥抗MRSA生物膜的研究進行綜述，為新藥研發(fā)提供參考。

中藥；生物膜；金黃色葡萄球菌；綜述

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）自1961年首次從臨床分離以來，其耐藥性迅速在世界范圍內(nèi)傳播，成為嚴重威脅人類生命健康的多重耐藥性病原菌。Holland T L等[1]通過文獻研究認為，萬古霉素和達托霉素是目前治療MRSA感染的一線抗生素，而萬古霉素耐藥MRSA的分離使最后一道防線被瓦解[2]。MRSA抗生素耐藥機制復(fù)雜，主要包括自身基因的突變、外源基因的內(nèi)化以及抗生素外排泵系統(tǒng)等；自然條件下，在細菌生物被膜這樣一個有機體中通常含有多種細菌，這就使不同細菌間得以相互接觸，使其成為耐藥基因轉(zhuǎn)移的一個途徑。Wessam A等[3]通過對血管內(nèi)MRSA感染的研究發(fā)現(xiàn)亞萬古霉素抑菌濃度可以誘導(dǎo)MRSA生物被膜的形成，進而降低萬古霉素對MRSA菌體的殺菌作用。簡言之，生物被膜對抗生素具有極強的抗性，因此，對細菌生物被膜的清除應(yīng)該摒棄傳統(tǒng)的抗生素療法[4]。中藥藥源廣泛、不良反應(yīng)少且耐藥性低，具有獨特優(yōu)勢，從中藥中發(fā)掘新藥具有廣闊的前景。本文對近年來中藥抗MRSA生物膜的研究作一綜述。

1 研究方法

1.1 生物膜體外模型制備

生物膜是一個微生物聚集群體，細胞首先固著到基質(zhì)表面，或個體之間相互連接并固著，進而向胞外分泌多糖及蛋白等基質(zhì)成分并嵌入其中，在生長、基因表達和蛋白產(chǎn)物方面呈現(xiàn)不同于單個細胞的表型，結(jié)構(gòu)分析表明他們通常呈現(xiàn)柱子或蘑菇樣結(jié)構(gòu)[5]。生物膜體外模型的建立是研究生物膜的前提，生物膜的形成受到培養(yǎng)基成分、酸堿度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及細菌接種濃度等多方面的影響。綜合國內(nèi)外文獻中采用的方法，生物膜體外模型建立的方法主要有以下2種。

動態(tài)模型，是指在體外模擬醫(yī)用導(dǎo)管或水管通路中生物膜的形成，使貼壁微生物連續(xù)處于流動的培養(yǎng)基中，避免因封閉培養(yǎng)時間過長導(dǎo)致的營養(yǎng)條件變化，更接近真實的生物膜形成過程。多種裝置采用此種原理建立生物膜，Coenye T等[6]在其生物膜模型研究的文獻中對多種動態(tài)生物膜體外模型進行了闡述，如羅賓斯裝置（MRD）、CDC生物膜發(fā)生裝置等，本文以典型代表管路法和加爾卡里生物膜裝置（CBD）法為代表進行闡述。管路法是無菌條件下將一定濃度的菌液接種到載體中，載體通常是導(dǎo)尿管這樣的生物活性材料，待細菌貼壁后，通過蠕動泵將新鮮培養(yǎng)液持續(xù)不斷導(dǎo)入載體中，孔金艷等[7]在對內(nèi)鏡活檢管路中生物被膜去除的研究中采用了此種方法，Mirani Z A等[8]在研究苯唑西林對MRSA生物膜的研究中也采用此種方法成功建立MRSA生物膜；CBD是一種建立細菌生物膜的商品化裝置，用于檢測細菌生物膜對特定藥物的敏感性，該裝置包括2部分，上部是生物膜形成裝置，由含96個小柱的上蓋和對應(yīng)的96孔底板組成，下部是動力裝置，可以不斷搖動使上蓋小柱上的生物膜處于96孔底板的動態(tài)培養(yǎng)液中[9]。

靜態(tài)模型是一種封閉模型，是指在體外通過靜置培養(yǎng)的方法，使細菌粘附到特定載體上進而形成生物膜的方法，建模過程中沒有培養(yǎng)液的流進流出，因此培養(yǎng)環(huán)境時刻處于變化中，需要定時更換培養(yǎng)液。目前該種方法主要包括試管法、微孔板法、置片法等。試管法是1982年由Christensen G D等[10]設(shè)計的用于檢測生物膜形成的方法，將一定濃度和體積的菌液加入無菌試管中，經(jīng)過特定時間和條件的培養(yǎng)，在試管底部或培養(yǎng)基的表面形成生物膜，如Kaur D C等[11]對傷口感染中MRSA生物膜形成能力和抗生素敏感性的研究中采用了此種方法，該方法簡便靈活快捷，至今仍在生物膜研究中發(fā)揮作用；微孔板法是生物膜體外研究中最為常用的方法，將一定濃度的菌液接種到微孔板中（通常為96孔培養(yǎng)板），經(jīng)過特定時間的培養(yǎng)，在微孔板的底部和側(cè)壁會形成生物膜，去除上清培養(yǎng)液中的浮游細菌，即可對留在孔底與側(cè)壁的生物膜進行研究，如Murugan K等[12]對導(dǎo)尿管中細菌生物膜的研究中同時采用了試管法與微孔板法；置片法是在微孔板法的基礎(chǔ)上，預(yù)先在微孔板中（通常為6、12、24孔培養(yǎng)板）加入無菌硅膠或載玻片等載體，使生物膜在一定面積的載體上生長，成熟生物膜可隨內(nèi)置玻片從微孔板中取出，研究方法更為多樣，定量更為精確，如Pereira F D等[13]用質(zhì)譜法分析綠膿桿菌生物膜結(jié)構(gòu)時成功采用這種方法在蓋玻片表面建立生物膜。

1.2 生物膜模型檢測與評估

伴隨新技術(shù)的發(fā)展，生物膜檢測方法更加多樣化，目前檢測方法有活菌計數(shù)法、染色法、電鏡觀察法、激光共聚焦顯微鏡觀察法、分子生物學(xué)手段檢測生物膜基因等?；罹嫈?shù)法是對生物膜進行定量分析的簡便方法，以超聲震蕩等機械手段將生物膜從載體上剝離，通過平板計數(shù)法對生物膜內(nèi)的活菌進行計數(shù)；染色法利用生物膜成分能與特殊染料結(jié)合的原理對其進行定量，最常用的是結(jié)晶紫染色法，待生物膜形成之后，去除培養(yǎng)基和浮游狀態(tài)的細菌，風(fēng)干后用1％結(jié)晶紫染色20 min，棄去染色液并用無菌生理鹽水沖洗至無色，以95％乙醇脫色，用酶標儀測定吸光度；電鏡觀察法包括掃描電鏡和透射電鏡觀察法，主要對生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面特征進行表觀觀察，但是電鏡樣本的處理經(jīng)過脫水破壞了生物膜原始的結(jié)構(gòu)，因此這種方法在生物膜的研究中受到一定的限制；相比較而言，激光共聚焦顯微鏡樣本無需特殊處理，結(jié)合熒光染色法進行直接觀察，在生物膜研究中具有明顯的優(yōu)勢；生物膜形成相關(guān)基因（如icaRABCD基因）的檢測，包括PCR、RT-PCR等是分子生物學(xué)中常用的方法。實際研究中，通常采用多種方法結(jié)合對生物膜進行定性定量分析，如Neu T R等[14]觀察細菌生物膜結(jié)構(gòu)時采用了掃面電鏡和共聚焦顯微鏡觀察的方法；Soraya M O等[15]采用結(jié)晶紫染色法和基因檢測法來測定人血中分離的葡萄球菌生物膜對抗生素的敏感性。

2 研究進展

2.1 單味中藥提取物研究

地榆有涼血止血、清熱解毒、消腫斂瘡等功效，Chen X等[16]以奶牛乳腺炎中分離的MRSA作為供試菌株，研究了地榆乙醇提取物對該菌株的活性和生物膜形成能力的影響，通過激光共聚焦顯微鏡觀察到，實驗組與對照組相比，細菌生物膜結(jié)構(gòu)松散且生物膜含量明顯降低，揭示地榆乙醇提取物對MRSA生物膜具有明顯的抑制作用。鹽膚木，又稱五倍子樹，根、葉、花及果均可入藥，有清熱解毒、舒筋活絡(luò)、散瘀止血、澀腸止瀉之效，You Y O等[17]采用掃描電鏡和沙皇染色法研究了鹽膚木樹葉乙醇提取物對MRSA生物膜的作用，結(jié)果顯示高于0.05 mg/mL濃度即具有明顯的清除作用，并進一步通過RT-PCR檢測毒力相關(guān)基因mecA、agrA、sarA等，結(jié)果顯示具有明顯抑制毒力因子基因表達的作用，初步化學(xué)成分分析表明起作用的可能是酚類物質(zhì)。黃曉敏等[18]則研究了五倍子水提物對金黃色葡萄球菌生物膜的的影響，結(jié)果顯示五倍子水提物對膜內(nèi)細菌有一定的清除作用，2組實驗研究均揭示五倍子在抗金黃色葡萄球菌生物膜感染中的作用。鵝掌楸葉和樹皮可入藥，味辛、性溫，有祛風(fēng)除濕、散寒止咳的作用，Tan X等[19]采用結(jié)晶紫染色法研究了鵝掌楸的己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇5種提取物對MRSA生物膜的影響，結(jié)果顯示，二氯甲烷和己烷提取物對生物膜具有明顯的清除作用，其中二氯甲烷提取物是通過影響其群體感應(yīng)機制來影響生物膜形成的，為中藥提取物影響生物膜機制的研究提供了思路。甘草用于解毒、抗變態(tài)反應(yīng)，抗?jié)?、消炎，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型鏈球菌有明顯抑制作用，喻華英等[20]通過微孔板法獲得奶牛乳腺炎中分離的MRSA生物膜，并通過結(jié)晶紫染色法檢測了不同濃度的甘草提取物對生物膜的影響，結(jié)果顯示在低濃度時能促進生物膜的生長，高濃度時能抑制生物膜生長，提示甘草提取物中某些成分具有抑制生物膜形成的作用。蒲公英具有清熱解毒、消腫散結(jié)、抗病原微生物、提高免疫力、利膽保肝功效，霍佳楠等[21]通過掃描電鏡觀察和結(jié)晶紫染色法研究蒲公英水提物對金黃色葡萄球菌生物膜的影響，結(jié)果顯示蒲公英水提物不僅能夠抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，而且還對成熟的金黃色葡萄球菌生物膜具有消除作用，提示蒲公英水提物有預(yù)防金黃色葡萄球菌生物膜引起的慢性感染的作用。蜂膠具有抗菌消炎、促進組織再生、抗腫瘤、抗氧化和改善心血管功能，朱明等[22]以微孔板法建立金黃色葡萄球菌生物膜，檢測新疆黑蜂膠醇提物對其影響，結(jié)果顯示低濃度黑蜂膠提取物不僅對膜內(nèi)菌具有清除作用，而且具有清除成熟生物膜的能力，高濃度提取物殺菌效果與抗生素?zé)o異，提示黑蜂膠在生物膜防治中具有明顯的作用。

2.2 中成藥研究

痰熱清是用于治療發(fā)熱、咳嗽、咯痰不爽等上呼吸道感染的中成藥注射液。Wang Y等[23]發(fā)現(xiàn)與青霉素比較，痰熱清對金黃色葡萄球菌浮游菌的清除能力無明顯優(yōu)勢，但以結(jié)晶紫染色法和激光共聚焦顯微鏡研究痰熱清和青霉素作用前后其生物膜變化，發(fā)現(xiàn)痰熱清無論在抑制生物膜形成還是清除膜內(nèi)活菌的過程中都具有明顯優(yōu)勢，首次報道了痰熱清注射液的抗生物膜活性作用，為研究中成藥抑菌提供了依據(jù)。清開靈顆粒具有清熱解毒作用，含有金銀花等多種清熱成分，對上呼吸道感染有較好療效。李將等[24]采用結(jié)晶紫染色法測定清開靈顆粒對金黃色葡萄球菌生物膜的破壞作用，生物膜抑制實驗和破壞實驗表明在3.9～62.4 mg/mL濃度范圍內(nèi)清開靈顆粒具有良好的作用，且呈濃度依賴性，除此之外，韓雪等[25]采用微生物活性檢測試劑盒-水溶性四唑鹽染色、掃描電鏡及流式細胞儀動態(tài)觀察等方法研究了清開靈注射液對金黃色葡萄球菌細菌生物膜的影響，清開靈注射液既能抑制金黃色葡萄球菌細菌生物膜的形成又可破壞其成熟細菌生物膜，以上2組研究均提示清開靈的抗生物膜作用。連花清瘟膠囊在治療細菌性肺炎和急性上呼吸道感染中具有良好的效果。雷洪濤[26]等采用結(jié)晶紫染色法和微生物活性檢測法觀察連花清瘟膠囊和青霉素抗金黃色葡萄球菌生物膜的作用，用掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察藥物作用后的形態(tài)并測量厚度，結(jié)果顯示與對照組比較，連花清瘟膠囊組對金黃色葡萄球菌具有明顯的清除作用，而青霉素組對生物膜的清除效果不明顯。王藝竹等[27]亦對連花清瘟水提物作了類似研究，得出相同結(jié)論，提示在金黃色葡萄球菌生物膜抗感染中，中成藥具有開發(fā)價值。

2.3 中藥活性成分研究

穿心蓮有效成分-穿心蓮內(nèi)酯具有解熱抗炎抗病毒、保肝利膽、免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤等多種藥理作用。周薇等[28]采用結(jié)晶紫染色法和掃描電鏡觀察法，設(shè)立穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)組、慶大霉素干預(yù)組、聯(lián)合干預(yù)組研究作用前后金黃色葡萄球菌生物膜變化，穿心蓮內(nèi)酯對金黃色葡萄球菌生物膜無直接殺菌作用，但對生物膜具有良好抑制作用，與慶大霉素聯(lián)合應(yīng)用，具有協(xié)同抗生物膜作用。桂皮醛是中藥肉桂的中藥成分，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等多種作用，是較好的局部治療藥物。賈蓓蓓等[29]采用皮下羧甲基纖維素鈉（CMC）-囊袋法制備MRSA在大鼠體內(nèi)的生物膜模型，以生理鹽水設(shè)立對照組，桂皮醛給藥后以菌落計數(shù)法檢測結(jié)果，顯示桂皮醛對大鼠體內(nèi)MRSA生物膜具有明顯清除作用。桑螵蛸具有補腎固精、縮尿止帶的功效，臨床上多與其他中藥配伍作為利尿劑使用。王文東等[30]以微孔板法建立金黃色葡萄球菌生物膜體外模型，采用光學(xué)顯微鏡觀察法研究桑螵蛸揮發(fā)油對其作用，桑螵蛸揮發(fā)油提取物對金黃色葡萄球菌生物膜的形成有明顯抑制效應(yīng)。魚腥草素鈉是魚腥草揮發(fā)精油中主要成分魚腥草素（癸酸乙醛）和亞硫酸氫鈉的加成物，對革蘭陽性菌有較好的抗菌活性。史祺云等[31]以激光共聚焦顯微鏡法研究了魚腥草素鈉對金黃色葡萄球菌生物膜的清除能力，結(jié)果顯示其對浮游菌具有明顯的清除能力，而對成熟生物膜作用較小，在生物膜形成早期具有一定的抑制作用。黃瑩瑩等[32]研究發(fā)現(xiàn)黃芩素對金黃色葡萄球菌生物膜有破壞作用，聯(lián)合左氧氟沙星作用于金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌療效。研究表明，亞致死濃度的牛至精油可以削弱金黃色葡萄球菌的生物被膜形成，并進一步證實香芹酚能夠顯著降低聚苯乙烯表面的生物量和細菌黏附數(shù)[33-34]。

2.4 其他研究

除上述對中藥單體、中藥活性成份及中成藥在金黃色葡萄球菌生物膜清除中的研究外，相關(guān)研究還包括中藥復(fù)方以及中藥作為佐劑與抗生素聯(lián)合應(yīng)用的研究。黃曉敏等[35]在掃描電鏡下觀察到溪黃草復(fù)方對金黃色葡萄球菌生物膜具有清除作用；申鳳鴿等[36]采用激光共聚焦顯微鏡研究了駱駝蓬靈單獨及與洗必泰聯(lián)合對抗金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物膜，在生物膜試驗中具有協(xié)同抗生物膜和相加活性，為克服金黃色葡萄球菌耐藥提供了一個可供選擇的方法；張春雷等[37]采用微量棋盤稀釋法進行聯(lián)合抑菌試驗，以觀察五味消毒飲聯(lián)合紅霉素抗MRSA生物膜的做用，結(jié)果顯示五味消毒飲單獨對MRSA生物膜沒有明顯的抑菌作用，但其水煎液與紅霉素有較強的協(xié)同作用，并對MRSA生物膜有抑制作用。

3 結(jié)語

目前，中藥用于MRSA生物膜抑制的研究大都局限于現(xiàn)象的觀察，機理研究較為少見。已研究的中藥多數(shù)為清熱藥，而利水、解表等，其他類型中藥研究較為少見，并且尚無對常見中藥進行大量篩選的研究。選取大量中藥進行篩選，研究其活性成分及抑菌機理是今后金黃色葡萄球菌生物膜中藥抑制劑的研究方向之一。

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Research Progress in TCM Against Methicillin-resistant Staphylococcus Aureus Biofilms

CUI Xin-jie, XIA Jin, SHAO Tie-juan, HE Yi-zhong
(College of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Staphylococcus aureus is one of the most common clinical infectious pathogens, and abused antibiotics enhances its resistance. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is the major mutant strains. The generation of biofilm reduces the effects of antibiotics on Staphylococcus aureus, which makes the antibiotic therapy limited. New medicine need to be developed, and TCM as the natural medicine is becoming a hot spot. This article reviewed the research of TCM against MRSA biofilmsin recent years, and provided references for research and development of new medicine.

TCM; biofilm; Staphylococcus aureus; review

R285

A

1005-5304(2017)02-0132-05

2016-03-16）

（

2016-04-18；編輯：向宇雁）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研基金項目（JC201408）

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.035