亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        中藥活性成分對oxLDL誘導血管平滑肌細胞泡沫化的影響

        2017-03-04 02:11:55趙苗苗王海芳曹情雯趙向絨霍雪萍孫晶瑩王光華劉勤社
        關鍵詞:中藥

        趙苗苗,王海芳,曹情雯,趙向絨,霍雪萍,孫晶瑩,王光華,胡 軍,劉勤社,3

        中藥活性成分對oxLDL誘導血管平滑肌細胞泡沫化的影響

        趙苗苗1,王海芳1,曹情雯2,趙向絨1,霍雪萍1,孫晶瑩1,王光華1,胡 軍1,劉勤社1,3

        目的 探討中藥活性成分黃芪甲苷(Astragaloside IV,ASIV)、羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)和芍藥苷(paeoniflorin,PAE)對小鼠主動脈平滑肌細胞(ASMCs)泡沫化過程的影響,并探討其可能的分子機制。方法 體外培養(yǎng)小鼠ASMCs,并利用免疫熒光染色對其進行鑒定。利用氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和腫瘤壞死因α (TNFα) 誘導ASMCs泡沫化,并應用ASIV、HSYA和PAE進行干預,觀察其對泡沫細胞形成的影響,應用油紅O染色檢測細胞形態(tài)學改變、酶促比色法測定細胞內膽固醇含量變化;應用RT-PCR和Western blot方法檢測凝集素樣氧化型低密度脂蛋白1 (LOX-1 )表達的變化。結果 oxLDL (80 μg/mL) 和TNFα (30 ng/mL)聯用72 h可誘導ASMCs泡沫化,細胞內脂質顆粒明顯增多,細胞內膽固醇含量增加,LOX-1表達上調;ASIV、HSYA和PAE顯著抑制上述各過程。結論 ASIV、HSYA和PAE能夠抑制ASMCs泡沫化,抑制oxLDL誘導的LOX-1表達可能是其作用機制之一。

        主動脈平滑肌細胞;氧化型低密度脂蛋白;凝集素樣氧化型低密度脂蛋白1 ;黃芪甲苷;羥基紅花黃色素A;芍藥苷;泡沫化過程;小鼠

        動脈粥樣硬化(AS)是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的共同病理基礎,而心腦血管疾病已成為威脅人類健康的主要殺手[1]。AS發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)和主要的細胞學改變是氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)等脂類物質在內膜下不斷蓄積所導致的泡沫細胞形成。有證據表明,45%的泡沫細胞是平滑肌細胞表型,只有30%是巨噬細胞表型[2]?;钛z囊主要由黃芪、紅花和赤芍等12味中藥組成,臨床治療冠心病療效確切,能有效改善氣虛血瘀證,改善血脂和血液流變學變化。動物實驗表明其可減少AS 斑塊內巨噬細胞浸潤,降低斑塊內 TNFα 表達及血清 IL-6 的水平[3]。黃芪甲苷(ASIV)、羥基紅花黃色素(HSYA)和芍藥苷(PAE)分別是黃芪、紅花、赤芍中含量最高的有效活性成分,前期研究表明,這些物質能夠抑制體外細胞中腫瘤壞因子α(TNFα)激活的信號通路,發(fā)揮抗炎作用[4]。本研究通過體外培養(yǎng)主動脈平滑肌細胞(ASMCs)并誘導其泡沫化,觀察ASIV,HSYA和PAE對平滑肌泡沫細胞形成的直接影響,初步探討其分子機制。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 細胞系 小鼠ASMCs購自上海諾晨生物技術有限公司。

        1.1.2 試劑與藥物 TNFα購自美國Calbiochem公司;氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和油紅O購自上海魯汶公司;膽固醇測定試劑盒購自北京普利萊基因公司;RNA提取試劑盒購自TIANGEN BIOTECH;反轉錄及RT-PCR試劑盒購自TaKaRa;實驗所用一抗LOX-1、β-actin、-smooth muscle Actin(-SMA)購自Sigma公司。

        1.2 方法

        1.2.1 細胞培養(yǎng) ASMCs采用含有10% 胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液,37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

        1.2.2 免疫熒光染色鑒定 細胞接種在蓋片上,4%多聚甲醛固定;0.2% Triton X-100透化,5% BSA室溫封閉30 min,用1%BSA1∶50稀釋-抗孵育過夜,熒光二抗(1∶100)避光孵育30 min,熒光顯微鏡觀察拍照。

        1.2.3 油紅O染色 細胞培養(yǎng)于6孔板內,經處理后用PBS潤洗,4 %多聚甲醛固定15 min,油紅O染色液染色30 min,蘇木素復染。倒置顯微鏡下觀察并拍照,隨機選取5個區(qū)域進行拍照。

        1.2.4 細胞內總膽固醇含量測定 培養(yǎng)細胞用PBS洗滌去除殘存培養(yǎng)液,按比例每1×106個細胞加入100 μL 裂解液,混勻,靜置10 min;取180 μL測定工作溶液加入微板,加入30 μL空白對照溶液、標準品或待測樣品;37℃ 反應30 min;繪制標準曲線并計算總膽固醇濃度。

        1.2.5 Western blot法檢測凝集素樣氧化型低密度脂蛋白(LOX-1)蛋白表達 收集細胞裂解樣品,氨基黑法定量,SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉NC膜,5% 脫脂牛奶室溫封閉30 min,4℃一抗孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,ECL法發(fā)光。

        1.2.6 實時定量熒光RT-PCR 收集細胞,按說明書提取總RNA。以總RNA為模板反轉錄出cDNA鏈;采用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒以cDNA為模板進行PCR反應。引物:β-actin:正向引物 5′-TAGGCGGACTGTTACTGAGC-3′,反向引物5′-TGCTCCAACCAACTGCTGTC-3′; LOX-1正向引物5′- CCCTCCAAAGTCTCCCAACC-3′;反向引物5′-GCCTGCACTTGAGGAGGATT-3′。反應條件:95℃ 變性20 s,58℃ 退火30 s,72℃ 延伸45 s,設40個循環(huán)。以β-actin為內參基因,評價目的基因表達水平。

        2 結 果

        2.1 ASMCs鑒定(見圖1) 以抗-SMA抗體進行免疫熒光染色,結果如圖1a 所示,激光共聚焦顯微鏡下ASMCs呈現綠色熒光,陰性對照組(圖b,未加抗-SMA一抗)則未見熒光信號。

        注:a為ASMCs b為陰性對照組

        2.2 油紅O染色(見圖2) 對照組細胞內基本無紅色脂質顆粒,oxLDL誘導組及oxLDL+TNFα誘導組細胞內紅色脂質顆粒明顯增多,且oxLDL+TNFα誘導組更為顯著。與oxLDL+TNFα誘導組相比,TNFα+oxLDL+ASIV組,TNFα+oxLDL+HSYA組及TNFα+oxLDL+PAE組細胞內紅色脂質顆粒都有不同程度的減少。

        注:a為CN;b為oxLDL;c為oxLDL+TNFα;d為TNFα+oxLDL+ASIV;e為TNFα+oxLDL+HSYA;f為TNFα+oxLDL+PAE

        2.3 細胞內總膽固醇含量(見圖3) oxLDL誘導組及TNFα+oxLDL誘導組細胞內總膽固醇含量較對照組顯著升高,且TNFα+oxLDL誘導組升高更為顯著。與TNFα+oxLDL誘導組相比,ASIV,HSYA和PAE均可以降低細胞內總膽固醇含量(P<0.05)。

        2.4 藥物對oxLDL誘導LOX-1基因表達的影響(見圖4) 如圖4a所示,oxLDL可誘導LOX-1 mRNA表達上調,其作用在6 h時最為明顯,因此我們選取6 h 為oxLDL作用時間。如圖4b所示,ASIV、HSYA和PAE(濃度100 μM)均能夠顯著抑制LOX-1 mRNA的表達。

        圖3 藥物對細胞內總膽固醇含量的影響

        注:圖α為oxLDL誘導LOL-1mRNA表達的時效關系(*P<0.05 vs CN;**P<0.05 vs CN)。

        2.5 藥物對oxLDL誘導LOX-1蛋白表達的影響 圖5a所示,oxLDL可誘導LOX-1 蛋白表達上調,其作用在6 h~8 h時較明顯,選取6 h 為oxLDL作用時間。如圖5b所示,ASIV、HSYA和PAE(濃度100 μM)均能夠顯著抑制LOX-1 mRNA的表達。詳見圖5。

        注:圖a為oxLDL誘導LOX-1蛋白表達的時效關系;圖b為藥物對oxLDL誘導的LOX-1蛋白表達影響

        3 討 論

        AS是脂類物質在血管內膜下不斷蓄積所致的血管炎癥性反應[5],而泡沫細胞形成在AS的發(fā)生發(fā)展中扮演十分重要的作用,泡沫細胞形成有兩個主要生物學特征,包括細胞形態(tài)學改變,細胞圓形,體積較大,細胞質內脂類物質增多,或可形成脂滴;細胞內膽固醇含量增多[6-7]。這與油紅O染色及細胞內總膽固醇含量測定的結果相一致。

        黃芪是中藥臨床常用中藥之一,首載于《神農本草經》,具有“補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌”等功效,古之醫(yī)家認為“補脾胃之氣及胸中宗氣乃黃芪所長”[8],ASIV是黃芪中的主要活性成分,目前主要以其評判黃芪藥材的優(yōu)劣[9],現代藥理研究證實ASIV對心肌細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、腎臟、肺、腦、肝臟都具有一定的保護作用;紅花是傳統的活血化瘀類中藥,具有活血通經,化瘀止痛的功效。《本草綱目》記載其具有:“活血、潤燥、止痛、散腫、通經”的功效, HSYA作為中國藥典2010版規(guī)定的紅花最具代表性活性成分,是目前臨床用藥中為數不多的中藥注射劑之一[10],發(fā)展前景可觀。現代藥理研究證實其具有降膽固醇、降血壓、保護心肌細胞、抗腦血栓形成等作用;赤芍為毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根,具有清熱涼血、散瘀鎮(zhèn)痛之功效。唐宋之后漸有白芍、赤芍之分,《本草綱目》曰:“白補而收,赤散而瀉”。許文平等[11]研究發(fā)現芍藥苷可顯著抑制ApoE基因敲除小鼠血清TC、TG、LDL-C水平,降低主動脈各段斑塊面積/主動脈血管管腔面積比值,表明芍藥苷具有明顯的降脂及抑制動脈斑塊形成的作用。Li等[12]發(fā)現芍藥苷可以通過上調ABCA1及下調CD36的表達抑制巨噬細胞源性泡沫細胞形成。本研究證明:ASIV、HSYA和PAE 能夠在體外實驗中通過降低細胞內膽固醇含量而抑制ASMCs泡沫化進而發(fā)揮抗AS作用。

        LOX-1是近年來新發(fā)現的一類清道夫受體,在血管內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、泡沫細胞等均有表達,介導并參與oxLDL內吞和細胞內信號激活,促進AS的發(fā)生發(fā)展[13]。血管平滑肌細胞泡沫化與LOX-1的表達密切相關,ox-LDL可誘導血管平滑肌細胞的LOX-1表達上調,且高濃度oxLDL的誘導作用更強,提示LOX-1是結合或內吞oxLDL的重要受體[14]。本研究也證實:泡沫細胞形成后LOX-1基因及蛋白的表達均上調,且ASIV、HSYA和PAE可顯著抑制LOX-1基因及蛋白的表達。說明活血膠囊有效活性成分ASIV、HSYA和PAE抑制ASMCs泡沫化可能與LOX-1表達下調,脂類物質攝取減少相關。

        但影響LOX-1表達的具體途徑尚不確定,oxLDL誘導的ASMCs泡沫化可能還與負責膽固醇運輸(ABCA1)及酯化(ACAT1)的基因相關,泡沫細胞形成時, ABCA1表達升高,而ACAT1表達下降,后期實驗中,將繼續(xù)深入研究活血膠囊活性成分ASIV, HSYA和PAE抗血管平滑肌細胞泡沫化的機制,為中藥抗AS提供理論基礎。

        [1] Loper AD, Mather CD,Ezzati M,et al.Global and regional burden of disease and risk factors,2001:systematic analysis of population health date [J].Lancet,2006,367(9524):1747-1757.

        [2] Li BH, Yin YW,Liu Y,et al.TRPV1 activation impedes foam cell formation by inducing autophagy in oxLDL treated vascular smooth muscle cells[J].Cell Death Dis,2014,5(4):e1182.

        [3] 周潔, 劉勤社,張曉艷, 等.活血膠囊對家兔動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2011,22(5):528-531.

        [4] Liu QS, Wang HF,Sun AK,et al.A comparative study on inhibition of total astragalus saponins and astragaloside IV on TNFR1-mediated signaling pathways in arterial endothelial cells [J].PLoS One,2014,9(7):e101504.

        [5] Cai Y,Li JD,Yan C.Vinpocetine attenuates lipid accumulation and atherosclerosis formation[J]. Biochem Biophys Res Commum 434:439-443,2013.

        [6] 李全忠,楊永宗 易光輝. U937泡沫細胞模型的建立.中國動脈硬化雜志,1999,7(2):152-154.

        [7] Sano J,Shirakuras,Takuji,et al. Foam cells generated by a combination of hyperglycemia and hyperlipemia in rats [J].Pathol Int,2004,54(12):904-913.

        [8] 孟琮,吳家勝,馬越鳴,等.黃芪組分及主要成分保肝作用研究進展[J].中醫(yī)學,2016,5(2):63-70.

        [9] 段立軍,孫博航.黃芪甲苷的研究進展[J].沈陽藥科大學學報,2011,28(5):410-416.

        [10] 高海珣,楊秀芬.羥基紅花黃色素A藥理作用研究進展[J].亞太傳統醫(yī)藥,2015,11(19):41-44.

        [11] 許文平,高艷艷,孟笑瑋,等.芍藥苷對ApoE-/-小鼠血脂及動脈斑塊的影響[J].天津中醫(yī)藥大學學報,2014,33(4):210-212.

        [12] Li XY, Zhou YD, Lin XS et al. Paeonol suppresses lipid accumulation in macrophages via upregulation of the ATP-binding cassette transporter A1 and downregulation of cluster of differentiation 36[J]. International Jouranl of Oncology,2015,46:764-774.

        [13] 冉小麗,吳芹,石京山.等. 凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1在粥樣硬化中的作用. 中國藥理學與毒理學雜志,2013,12(1):865-871.

        [14] Xu S,Ogura S,Chen J,et al. LOX-1 in a therosclerosis:biologi-calfunctionsandp harm macological modifiers [J].Cell Mol Life Sci, 2013, 70(16): 2859-2872.

        (本文編輯王雅潔)

        國家自然科學基金常規(guī)面上項目(No.81573823);陜西省自然科學基金資助項目(No.2015 JM 8460)

        1.西安交通大學醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院陜西省人民醫(yī)院(西安 710061);2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院;3.陜西中醫(yī)藥大學

        劉勤社,E-mail:lqsspph@126.com

        R285.5

        A

        10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.014

        1672-1349(2017)03-0310-04

        2016-08-08)

        引用信息:趙苗苗,王海芳,曹情雯,等.中藥活性成分對oxLDL誘導血管平滑肌細胞泡沫化的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2017,15(3):310-313.

        猜你喜歡
        中藥
        中藥提取物或可用于治療肥胖
        中老年保健(2021年5期)2021-12-02 15:48:21
        中藥久煎不能代替二次煎煮
        中老年保健(2021年4期)2021-12-01 11:19:40
        您知道嗎,沉香也是一味中藥
        中老年保健(2021年4期)2021-08-22 07:08:32
        《中國現代中藥》簡介
        中醫(yī),不僅僅有中藥
        金橋(2020年7期)2020-08-13 03:07:00
        中藥的“人事檔案”
        《中國現代中藥》簡介
        中藥貼敷治療足跟痛
        中藥內外結合治療臁瘡56 例
        中藥也傷肝
        肝博士(2015年2期)2015-02-27 10:49:49
        日本精品少妇一区二区| 熟妇五十路六十路息与子| 国产成人国产在线观看| 天天爽天天爽天天爽| 亚洲公开免费在线视频| 亚洲av色香蕉一区二区三区软件| 我和隔壁的少妇人妻hd| 粉嫩虎白女毛片人体| 亚洲国产成人AV人片久久网站| 久久夜色精品国产九色| 中文字幕亚洲一区二区不下| 少妇夜夜春夜夜爽试看视频| 真实单亲乱l仑对白视频| 色欲AV无码久久精品有码| 风流少妇一区二区三区91| 日本亲近相奷中文字幕| 久久中文字幕无码专区| 天天干夜夜躁| 亚洲国产成人av毛片大全| 中文字幕日韩欧美一区二区三区 | 亚洲久悠悠色悠在线播放| 亚洲色成人网站www永久四虎| 国产午夜三级一区二区三| 亚洲中文欧美日韩在线| 少妇被猛烈进入中文字幕| 亚洲精品第一国产综合精品| 99久久免费看少妇高潮a片特黄| 婷婷激情五月综合在线观看| 97青草超碰久久国内精品91| 亚洲国产av无码专区亚洲av| 精品人无码一区二区三区 | 日韩免费无码一区二区三区 | 亚洲色婷婷一区二区三区| 狠狠躁夜夜躁AV网站中文字幕| 国产av精品久久一区二区| 亚洲色偷偷偷综合网| 精品香蕉久久久爽爽| 亚洲色图在线视频免费观看| 国产女主播一区二区三区| 丰满人妻被黑人猛烈进入| 亚洲视频高清|