戎靖楓，封 舟，劉 茜，周耀中，王 詠，方宏鈞，周 華

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

鹿紅方對心力衰竭大鼠過氧化物酶增殖物激活受體和心肌組織的影響

戎靖楓，封 舟，劉 茜，周耀中，王 詠，方宏鈞，周 華

目的 觀察鹿紅方對心力衰竭大鼠過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)和心肌組織的影響。方法 分離鹿紅方全方水煎液，用蒸餾水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇洗脫，得到4種提取液，分別成為A、B、C、D液，分組為A組、B組、AB組、C組、AC組、BC組、ABC組、D組、AD組、BD組、ABD組、CD組、ACD組、BCD組，共14組，第15組曲美他嗪，第16 組假手術(shù)組。分別給96只通過冠脈結(jié)扎法制備充血性心力衰竭成功的大鼠模型灌胃。應(yīng)用Western Blot檢測 (WB) 測定不同劑量的鹿紅方對心肌細(xì)胞PPARα蛋白表達(dá)的影響，對心肌組織進(jìn)行HE 、VG染色，觀察心肌細(xì)胞病理形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果 鹿紅方具有明顯上調(diào)PPARa的作用，可以讓無序的心肌纖維定向排列，使心衰心臟的心功能得以改善，對心衰病理改變有顯著降膠原纖維的作用，有顯著降低 PVCA的功效。結(jié)論 不同劑型鹿紅方藥物血清組都可通過上調(diào)PPARα的表達(dá)，發(fā)揮其改善心肌組織功能作用，表明鹿紅方是中醫(yī)藥治療心力衰竭的良好藥物。

心力衰竭；鹿紅方；過氧化物酶增殖物激活受體；心肌組織；心悸

心力衰竭是當(dāng)今臨床實踐中各種病因?qū)е氯祟愋呐K功能下降的一種復(fù)雜綜合征，也是各種心臟疾病的嚴(yán)重和終末階段。近年來，國民心臟疾病的發(fā)病率、死亡率上升勢頭明顯，現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)危害公眾健康的疾病之一[1]。心衰不僅對國民健康產(chǎn)生不良影響，也給社會公共衛(wèi)生事業(yè)的健康發(fā)展帶來了挑戰(zhàn)。

據(jù)不完全統(tǒng)計，2014年全球心力衰竭病人數(shù)量已高達(dá)1.2億，我國現(xiàn)有此類病病人2 997.1萬，已超過全世界總量的四分之一，有可能成為全球擁有心力衰竭病人人群最多的國家。另有研究表明[2]，我國心力衰竭病人平均發(fā)病年齡為66周歲，比歐美、日本等發(fā)達(dá)國家提早至少4歲，主要是因為我國現(xiàn)有醫(yī)療技術(shù)還很難控制好心衰危險的核心要素，如果不及時進(jìn)行診斷治療，影響心衰病人的藥物應(yīng)用依從性效果。

心衰與心肌能量代謝密切相關(guān)，心衰的基本病因是原發(fā)性心肌損害(包括代謝障礙)或心臟負(fù)荷過重。如果心衰是由于心肌組織損傷引起，其癥狀體征首先表現(xiàn)為瘀血證；由于舒張功能作用減退和心肌無力收縮等原因?qū)е卵翰荒芑亓鳎瑥牟C(jī)轉(zhuǎn)化角度可推測，由于“瘀血”可引起心脈受阻，這會造成體內(nèi)線粒體ATP銳減，根本原因是心肌組織細(xì)胞缺血缺氧而導(dǎo)致[3]，這也會產(chǎn)生心臟收縮跳動無力的氣虛，氣虛時心臟不能有效地推動血液流動，必然會引起血瘀或進(jìn)一步加重血瘀。據(jù)研究，過氧化物酶增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)是心肌代謝脂肪酸氧化酶基因主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[4]，不僅在正常的心肌代謝穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，而且它的信號改變和很多種疾病狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，因此，以PPAR作為阻止病理性心臟重構(gòu)的治療策略為目的[5]。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院專門研制了臨床特效經(jīng)驗方鹿紅方，它具有溫腎促陽、活血通絡(luò)和益氣強(qiáng)身的三種功效，特別是對心肌功能的恢復(fù)改善具有很好的促進(jìn)作用，為有效緩解心力衰竭癥狀、延緩心力衰竭進(jìn)程等[6]。本研究通過實驗數(shù)據(jù)來驗證鹿紅方對心力衰竭小鼠PPAR和心肌組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 雄性成年健康SD系，200 g±30 g，供貨方為上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。動物合格證號：SCXK( 滬) 2015-0016。

1.1.2 藥物 鹿紅方組成：鹿角、紅花、黃芪、桂枝、葶藶子、黨參。由深圳華潤制劑有限公司制作并提供中藥顆粒劑。

1.1.3 試劑和儀器 水平凝膠電泳系統(tǒng)Horizontal Gel、PCR儀Applied Biosystems ProFlexTM、一體化蛋白免疫印跡GE AWB、WB加速器SNAP i.d.。即時細(xì)胞分析儀ChemoNC-3000、倒置顯微鏡ECLIPSETS100、石蠟切片機(jī)Leica、相差顯微鏡DPH-200、ECLIPSE Ti

1.2 動物模型制備與分組 體內(nèi)實驗：大鼠心肌梗死造模方法參照J(rèn)ohns 和Olson 的方法并加以改進(jìn)[7]。用乙醚對實驗大鼠進(jìn)行麻醉，對其皮膚進(jìn)行消毒，術(shù)前心電圖也要做好記錄。在左側(cè)胸部心臟搏動最強(qiáng)處的上一肋間，刀切1.5 cm口，鈍性分離至胸壁。用剪刀捅胸腔，在上一肋骨與胸骨交界處剪斷，將心臟向左側(cè)破口處推擠，剪破心包膜后讓心臟復(fù)位，大鼠呼吸恢復(fù)正常后，將其心臟從胸腔中推擠出，左冠狀動脈前降支結(jié)扎必須在距動脈根部2 mm 處進(jìn)行。將心臟推回進(jìn)胸腔，并對開口的皮膚進(jìn)行縫合，動物穩(wěn)定后記錄標(biāo)準(zhǔn)

Ⅱ?qū)?lián)心電圖( 紙速50/s)，ST段弓背抬高示心肌梗死形成，表明順利完成結(jié)扎。術(shù)后給予青霉素4×104U，皮下注射，連續(xù)3 d。造模成功后共96 只大鼠，據(jù)計算機(jī)編制的隨機(jī)分配表及正交設(shè)計方法隨機(jī)分為16 組，每組6只。灌胃需要用5 mL/d的藥液進(jìn)行，空白組為第16組。術(shù)后給予青霉素4×104U，皮下注射，連續(xù)3 d。體外實驗：H9c2(2-1)大鼠的心肌細(xì)胞[8]，中國科學(xué)院細(xì)胞庫專門提供。

1.3 藥物干預(yù)方法 HP20型大孔吸附樹脂分離鹿紅方全方水煎液(濃度為2 g生藥/mL)，分別用95%乙醇洗脫、60%乙醇、30%乙醇和蒸餾水調(diào)配形成4 種提取液，分別簡稱為A：蒸洗液、B：30%液、C：60%液、D：95%液。揮盡回收乙醇后，以蒸餾水轉(zhuǎn)溶，調(diào)整體積(按比例折合含全方生藥12.5 g/mL)，罐封冷藏備用。各組藥液中適當(dāng)增添生理鹽水，并調(diào)配形成濃度為2 g生藥/mL的藥液。術(shù)后2周開始，分別以A、B、AB、C、AC、BC、ABC、D、AD、BD、ABD、CD、ACD、BCD給14組灌胃給藥，連續(xù)8 周。第15組曲美他嗪10 mg/(kg·d)連續(xù)8 周。假手術(shù)組是第16 組，每天用生理鹽水5 mL/d 進(jìn)行專門灌胃，時間確定為連續(xù)8 周。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 WB檢測 從組織中抽提蛋白，蛋白跑電泳，孵育目的體，顯色曝光。

1.4.2 病理分析 HE、VG染色：大鼠左室心肌標(biāo)本用10% 甲醛溶液進(jìn)行固定，并通過常規(guī)石蠟予以包埋，制備約0.4 μm 厚的連續(xù)石蠟切片，分別行快速VG染色、HE并觀察。計算膠原容積指數(shù)(ICVF)、血管周圍膠原面積/管腔面積比值(PVCA)。

2 結(jié) 果

2.1 WB檢測PPARα的相對表達(dá)量 第16組假手術(shù)組幾乎不表達(dá)PPARα，第5組的PPARα相對表達(dá)量0.32(見表1)，相對于第16組，PPARα的相對表達(dá)量(P< 0.05)，僅顯示有效，西藥組是第15組，該組表達(dá)量為21.87，效果最好。14組、12組、11組、10組、8組療效皆顯著，但總體療效都低于西藥組，且依次遞減。其余各組相比于療效顯著。

表1 WB檢測PPARα的相對表達(dá)量(±s)

2.2 Western blot實驗結(jié)果 (見圖1) 與假手術(shù)組相比，中藥組PPARa表達(dá)都有所增加，提示鹿紅方各劑型都可以提高PPARα的表達(dá)。H9C2大鼠心肌細(xì)胞PPARα蛋白表達(dá)會受到模型組的類別影響，從實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種劑型的鹿紅方藥物血清組對缺氧處理的H9C2 細(xì)胞會起到一定的保護(hù)作用，特別是都能增強(qiáng)H9C2細(xì)胞增殖活性，并可通過PPARα的表達(dá)上調(diào)，有效發(fā)揮其恢復(fù)和提升心肌組織功能作用，其中4組、6組、7組、14組、15組鹿紅方藥物血清組的功能作用最為明顯。該結(jié)果提示鹿紅方干預(yù)都具有明顯上調(diào)PPARa的作用。

圖1 Western blot實驗結(jié)果

2.3 假手術(shù)組和鹿紅方各組HE染色(見圖2) 第16組假手術(shù)組大鼠的心肌細(xì)胞邊界欠清，膠原纖維呈無序散亂纏繞狀，且有梗死透壁現(xiàn)象，空泡壞死面積大；中藥組的大鼠心肌纖維呈現(xiàn)束狀排列，心肌細(xì)胞、胞漿大小相對比較一致，形態(tài)規(guī)則，膠原纖維排列定向、緊密、整齊，基本無空泡，1組、2組、3組、6組邊緣有部分炎癥出現(xiàn)，成纖排列有序且基本無空泡炎癥。14組、12組、10組邊緣亦有炎癥出現(xiàn)，室壁中層有少量空泡，成纖排列基本有序；第15組西藥組部分空泡化及部分炎癥，成纖細(xì)胞排列較散亂，但排列比對照組稍緊密。鹿紅方讓無序的纖維定向排列，使心衰心臟的心功能得以改善。

圖2 大鼠心肌HE染色

2.4 病理組織VG染色(見圖3) 第1組、2組、6組、8組、10組紅色為膠原纖維，表明此處滲透性大。第15組、16組的空隙表明組織滲透性弱。第6、10組纖維化后VG染色明顯呈紅色，表示膠原纖維構(gòu)成的疤痕形成，可能是原來心肌纖維被膠原膠原纖維代替，呈紅色。

圖3 大鼠心肌VG染色

2.5 膠原容積指數(shù)(ICVF) 是反應(yīng)膠原纖維的量化指標(biāo)，中藥干預(yù)各組與假手術(shù)組比較，都有顯著減少，其中第2組5.218%與第8組的5.198%相接近(見表2)，較其余各組的膠原容積指數(shù)稍高。第15組西藥組ICVF為3.522%，療效最顯著。提示鹿紅方各劑型雖比西藥組略高，但膠原容積都明顯少于假手術(shù)組，證明鹿紅方對心衰病理改變有顯著降膠原纖維的作用。

表2 膠原容積指數(shù)(±s)

2.6 血管周圍膠原面積/管腔面積比值( PVCA) 第8組PVCA為4.94%，與假手術(shù)組比較，顯著減少，但高于其他治療組(見表3)。第11組PVCA3.644，療效等同于第15組西藥組(見表3)。說明鹿紅方干預(yù)組都有顯著降低 PVCA的功效，尤其是第11組，療效等同于西藥組。

表3 血管周圍膠原面積/管腔面積的比值(±s)

3 討 論

3.1 鹿紅方組方原則 鹿角、桂枝、黨參、黃芪、南葶藶子及紅花等中藥成分是鹿紅方的主要原料來源。精選這六種藥材，主要考慮到：鹿角，溫肝益腎、補(bǔ)行精血，上通于心；桂枝的功效一般是溫心通陽；黨參、黃芪，主要用來益氣扶正，共為君藥；葶藶子，則為瀉肺平喘為佐使藥，這六種藥材融合使用，可以更好地調(diào)補(bǔ)陰陽、益氣強(qiáng)心、活血通絡(luò)之功效；紅花，則可活血通經(jīng)、散瘀解毒，共為臣藥。這些知名藥材的融合使用，便可產(chǎn)生益氣強(qiáng)心、調(diào)補(bǔ)陰陽、活血通絡(luò)的功效。鹿紅方可以給予溫陽活血法，能更好地改善心衰癥狀及生化指標(biāo)，臨床上對心力衰竭合并心絞痛的病人進(jìn)行隨機(jī)跟蹤、比較、觀察發(fā)現(xiàn)，鹿紅方的綜合治療心衰疾病的效果特別明顯：該方中醫(yī)癥候改善總有效率、NYHA心功能分級改善總有效率、改善Lee心衰計分系統(tǒng)總有效率分別為82.8%、89.7%、55.0%，中醫(yī)證候療效高達(dá)80%。同時，也進(jìn)行了機(jī)制探討，均證實鹿紅方臨床上是治療充血性心力衰竭合并心絞痛中醫(yī)辨證為心腎陽虛兼有血瘀的一個安全、有效的中藥制劑。

3.2 PPAR作用機(jī)制 過氧化物酶體增殖物激活受體，是由Issemann和Green兩位英國科學(xué)家通過克隆小鼠肝臟而獲取的，實際上PPARs是一類核轉(zhuǎn)錄因子，配體PPARα主要是在線粒體豐富的腸細(xì)胞、腎近曲小管細(xì)胞、心肌細(xì)胞，以及肝細(xì)胞等諸多細(xì)胞中呈高水平表達(dá)[9]。PPARs主要是進(jìn)行調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、能量代謝、過氧化物酶體增殖和炎癥反應(yīng)等，這些變化主要存在于動脈粥樣硬化、高血壓、胰島素抵抗、糖尿病及腫瘤等常見疾病的病理過程中[10]。實驗表明，鹿紅方可以影響PPARα基因表達(dá)，輔助心肌細(xì)胞在體內(nèi)脂肪酸的活化、攝取、代謝等[11]。病理研究表明：鹿紅方使得心肌代謝基因表達(dá)的PPARα中間控制作用被激活，通過恢復(fù)PPARα活性而潛在保護(hù)心臟，用于心肌肥大和心衰的治療[12]。

根據(jù)上海曙光醫(yī)院周華教授多年的臨床實踐，結(jié)合中醫(yī)理論所蘊(yùn)含的“治心之所以治腎、而治腎之所以治心”理念，并在鞏固推廣多年臨床治療心力衰竭經(jīng)驗成果的基礎(chǔ)上，探索研制由鹿角、桂枝、黃芪、黨參、紅花和葶藶子等中藥材組成的特效藥方鹿紅方，兼具通絡(luò)活血、調(diào)和陰陽、補(bǔ)心溫腎等多重功效。研究證實，鹿紅方在標(biāo)本關(guān)系處理上，注重以益氣、扶正、治本為主，配以活血治標(biāo)為輔助；在調(diào)和陰陽上，特別注重平補(bǔ)陰陽，以補(bǔ)陽為主；在心腎關(guān)系處理上，尤其強(qiáng)調(diào)心腎融合、心本乎腎，以溫腎促強(qiáng)心。對于各單味藥的研究，據(jù)記載：鹿角通常用以補(bǔ)腎壯陽，雖具有補(bǔ)腦強(qiáng)心的效能，卻很少用來延緩心力衰竭等病癥；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床表明，鹿角可以更好地改善蛋白質(zhì)代謝障礙，加快能量代謝。黃芪可以促進(jìn)肌體發(fā)育生長，增強(qiáng)肌體活動能力。黨參可以減輕身體疲勞，改善睡眠食欲[13]。對于紅花，主要通過熱水來提取，這種提取物具有顯著地抗血凝的作用，且對活化某些凝血活酶時間起到很好效果，同時也對膠原誘導(dǎo)的血小板和二磷酸腺苷(ADP)的聚集起到很好的抑制作用，并促使纖維蛋白溶酶和尿激酶的纖溶作用得到進(jìn)一步加強(qiáng)[14]。這些中藥的醫(yī)療機(jī)制，有助于心力衰竭進(jìn)程進(jìn)行合理地調(diào)控和延緩，進(jìn)而逐步緩解心衰病人的心絞痛癥狀。

綜上所述，作為一種治療心衰病人的特殊中藥，鹿紅方不但可以緩解甚至在某些時刻阻斷病人心力衰竭進(jìn)程，適度減輕心絞痛等各種不良心臟病癥；如此，心衰病人不但可以增強(qiáng)參與心衰治療的信心，也可逐步提高治療的實效，同時病人的生活品質(zhì)也可得到很大提升。

因此，通過多年的探索研究提出，鹿紅方臨床實踐效果明顯，可以作為一種治療充血性心力衰竭的安全藥物，特別是在今后治療心衰病人的臨床中進(jìn)一步更大范圍的推廣。

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(本文編輯王雅潔)

Effect of Luhong Prescription on Peroxisome Proliferator-Activated Receptor and Myocardial Tissue in Mouse with Chronic Heart Failure

Rong Jinfeng，F(xiàn)eng Zhou，Liu Qian，Zhou Yaozhong，Wang Yong，F(xiàn)ang Hongjun，Zhou Hua

Shanghai Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai，China

Zhou Hua

Objective To observe the effects of Luhong prescription (LHP) on peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) and myocardium of mouse with congestive heart failure (CHF).Methods Separation water decocted solution of LHP was eluted with distilled water，30% ethanol and 60% ethanol，95% ethanol，extract，respectively，as a，B，C，D solution，grouped into A，B and AB，C，AC，BC and ABC，D，ad and BD，abd，CD，ACD，BCD in a total of 14 groups，group 15 (trimetazidine) and group 16 (sham operation group)，respectively.Ninety-six rat models of CHF were established by coronary artery ligation and administrated by intragastric administration.The protein expression of PPARα on cardiomyocyte was detected by western blot (WB).The pathological structure of myocardial tissue was observed by Haematoxylin-Eosin (HE) staining and Van Gieson (VG) staining.Results LuHong prescription can upregulate the function of PPARa obviously,it can make the muscle fiber orientation disordered,it can make the heart to improve the heart function of chronic heart failure.LuHong prescription can reduce collagen on the pathological changes of heart failure. LuHong prescription can reduce the efficacy of PVCA significantly.Conclusion LHP can upregulate the protein expression of PPARα on cardiomyocyte in rats with CHF.

Luhong prescription；heart failure；peroxisome proliferator activated receptor；myocardial tissue

國家自然基金面上項目(No.81373625)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(No.81303798)

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院(上海 201203)

周華，E-mail：zhouhuam@hotmail.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.010

1672-1349(2017)03-0293-05

2016-11-13)

引用信息：戎靖楓，封舟，劉茜，等.鹿紅方對心力衰竭大鼠過氧化物酶增殖物激活受體和心肌組織的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(3)：293-297.