邵 穎，趙彩鳳，邵 賽，張樂(lè)平

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南省農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心，生物輻照技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

微生物絮凝劑γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展

邵 穎，趙彩鳳，邵 賽，張樂(lè)平

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院核農(nóng)學(xué)與航天育種研究所，湖南省農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心，生物輻照技術(shù)湖南省工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由L-谷氨酸或D-谷氨酸通過(guò)肽鍵結(jié)合形成的一種多肽高分子，具有良好的水溶性、生物相容性、水解性、生物可降解性、無(wú)毒等優(yōu)良特性。文章綜述了微生物合成γ-PGA生產(chǎn)工藝，如生產(chǎn)菌株、培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵工藝和固定化技術(shù)等，介紹了γ-PGA在廢水處理方面的應(yīng)用，并指出了其發(fā)展方向。

γ-聚谷氨酸；生物合成；廢水；應(yīng)用；綜述

微生物絮凝劑（Microbial flocculants，簡(jiǎn)稱MBF）是利用生物技術(shù)，從微生物菌體或其分泌物中提取、純化而獲得的一種安全、高效，且能生物降解的新型水處理絮凝劑[1]。MBF可以克服無(wú)機(jī)高分子和合成有機(jī)高分子絮凝劑本身固有的安全和環(huán)境污染方面的缺陷，易于生物降解、無(wú)毒、無(wú)二次污染。生物絮凝劑已應(yīng)用于紙漿廢水、染料廢水處理、污泥脫水及發(fā)酵菌體去除[1-2]等領(lǐng)域。MBF活性成分有糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素、DNA以及具有絮凝活性的菌體等[3]。目前，MBF存在價(jià)格昂貴、絮凝活性不高、投加量大等缺點(diǎn)，其工業(yè)化應(yīng)用不多。

γ-聚谷氨酸（γ-Polyglutamic acid，γ-PGA）是一種由芽孢桿菌（主要為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）合成的細(xì)胞外水溶性氨基酸聚合物。γ-PGA由L-谷氨酸和D-谷氨酸單體通過(guò)α-氨基和γ-羧基形成肽鍵之后生成的線型同聚酰胺，分子量一般在100～1 000 kDa[4]。γ-PGA分子中每個(gè)重復(fù)單元的α碳原子上連有一個(gè)羧基，可在分子內(nèi)和分子間形成氫鍵。γ-PGA是一種陰離子聚合氨基酸，其二級(jí)結(jié)構(gòu)在不同pH和離子強(qiáng)度下呈現(xiàn)不同構(gòu)象[5]。γ-PGA分子中富含-COOH、-CO-、-NH-等多種活性基團(tuán)，電荷密度高，分子量較大且呈線性，具有良好的絮凝活性。目前，高生產(chǎn)成本（高原料成本與復(fù)雜的分離純化工藝），低產(chǎn)量是制約γ-PGA工業(yè)化應(yīng)用的重要因素。

γ-PGA具有優(yōu)良的成膜性、成纖維性、阻氧性、粘結(jié)性、可塑性、吸水性和生物可降解性等特性，使其具有成膜、增稠、乳化、凝膠、保溫、助溶、粘結(jié)和緩釋等功能[4,6]，在水處理、醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。本文主要對(duì)微生物絮凝劑γ-聚谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)工藝及在廢水處理方面的應(yīng)用、國(guó)內(nèi)外發(fā)展動(dòng)態(tài)及研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 γ-PGA的發(fā)酵生產(chǎn)工藝

1.1 γ-PGA生產(chǎn)菌株

γ-PGA生產(chǎn)菌株主要為芽孢桿菌。根據(jù)合成γ-PGA過(guò)程中是否需要谷氨酸將其分為谷氨酸依賴型和谷氨酸非依賴型γ-PGA生產(chǎn)菌。非依賴型γ-PGA生產(chǎn)菌由于培養(yǎng)基不需要提供谷氨酸，原料成本較低，但是γ-PGA產(chǎn)量一般較低（10 g/L左右）。谷氨酸依賴型γ-PGA生產(chǎn)菌產(chǎn)量較高（大于20 g/L），但原料成本較高[7-9]。

1.2 優(yōu)化培養(yǎng)

碳源、金屬離子、前體物質(zhì)、微量元素、生物素等對(duì)不同菌株的產(chǎn)量存在很大差異。培養(yǎng)基組成和含量，溫度、pH、供氧等發(fā)酵條件對(duì)γ-PGA產(chǎn)量和分子量大小和分布影響較大。

多篇報(bào)道采用響應(yīng)面法（RSM）或正交設(shè)計(jì)（PB設(shè)計(jì)）法對(duì)γ-PGA發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。Chen等[10]采用RSM對(duì)Bacillus subtilis CCTCC202048固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，γ-PGA產(chǎn)量為4.7%（w/w）。Soliman等[11]采用PB設(shè)計(jì)對(duì)谷氨酸非依賴菌Bacillus sp. SBA-26培養(yǎng)基成分的15個(gè)變量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K2HPO4、KH2PO4、(NH4)2SO4和酪蛋白水解物是影響γ-PGA產(chǎn)量的主要組分，在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，γ-PGA最大產(chǎn)量為33.5 g/L。Yong等[9]采用RSM優(yōu)化B. amyloliquefaciens C1固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，γ-PGA最大產(chǎn)量達(dá)4.37%。Bajaj等[8]采用因子分析法、PB設(shè)計(jì)和RSM等多種方法對(duì)B. licheniformis NCIM 2324生產(chǎn)γ-PGA培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，產(chǎn)量從5.27 g/L提高到26.12 g/L。Shi等[9]采用RSM優(yōu)化B. subtilis ZJU-7培養(yǎng)基組分，γ-PGA產(chǎn)量提高了1倍，達(dá)58.2 g/L?？梢?，通過(guò)統(tǒng)計(jì)法可以使γ-PGA產(chǎn)量不同程度提高，同時(shí)減少工作量。

1.3 發(fā)酵工藝

在高黏性產(chǎn)物好氧發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，提高溶氧和氧傳質(zhì)效率對(duì)于提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量和生產(chǎn)速率非常關(guān)鍵。目前，提高溶氧的技術(shù)有微孔曝氣技術(shù)、膜生物反應(yīng)器等[12]。在γ-PGA生物發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，由于其高粘度特性，導(dǎo)致中后期發(fā)酵液粘度較大，嚴(yán)重影響混合、傳氧和傳質(zhì)過(guò)程，進(jìn)而影響γ-PGA產(chǎn)量、分子量大小和分子量分布等[13]。Bajaj等[14]研究表明，高轉(zhuǎn)速和高通氣量可促進(jìn)B. licheniformis NCIM 2324生長(zhǎng)，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速低于750 r/min時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速增加而增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速為750 r/min，通氣量1 vvm時(shí)，γ-PGA最大產(chǎn)量為46.34 g/L。Cromwick等[8]研究了曝氣和pH等因素對(duì)B. licheniformis ATCC 9945A分批發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA產(chǎn)量影響，結(jié)果表明，在最適pH 6.5條件下，攪拌速率從250 r/min提高到800 r/ min，曝氣量從0.5 L/min增大到2.0 L/min，γ-PGA產(chǎn)量從6.3 g/L增加到23 g/L，盡管如此，局部溶氧限制仍不可避免。符爽等[15]采用離心式纖維床生物反應(yīng)器（Centrifugal Fibrous-Bed Bioreactor，CFBB）生產(chǎn)γ-PGA，以強(qiáng)化傳質(zhì)及傳氧過(guò)程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CFBB中發(fā)酵液的最高黏度為4 000 mPa·s，低于攪拌釜式發(fā)酵罐，低粘度有利于氧傳質(zhì)，可連續(xù)生產(chǎn)γ-PGA。

1.4 固定化菌生產(chǎn)γ-PGA

細(xì)胞固定化技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的重復(fù)利用，有利于產(chǎn)品的分離純化，簡(jiǎn)化后處理工藝，縮短生產(chǎn)周期，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)或半連續(xù)生產(chǎn)，從而降低發(fā)酵成本。采用固定化細(xì)胞發(fā)酵，可以得到含菌量很少甚至不含菌體的發(fā)酵液。易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物分離與發(fā)酵耦合，減少菌體分離成本，促進(jìn)工業(yè)化應(yīng)用[15]。在高粘性黃原膠、魯蘭多糖等胞外多糖發(fā)酵生產(chǎn)中，固定化細(xì)胞研究較多，這對(duì)高粘性的γ-PGA生產(chǎn)同樣適用[16-17]。Hsu等[16]利用棉纖維固定化Xanthomonas campestris細(xì)胞生產(chǎn)黃原膠，產(chǎn)量為游離細(xì)胞的2倍。West等[17]利用殼聚糖微球固定化Aureobasidium pullulans ATCC 201253生產(chǎn)普魯蘭多糖，應(yīng)用1%殼聚糖小球固定化菌株重復(fù)生產(chǎn)2批次，第2批次產(chǎn)量（5.0 g/L）為第1批次（3.1 g/L）的1.6倍。Zhang等[13]利用聚氨酯泡沫固定化X. campestris CGMCC 1.1781固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠，黃原膠產(chǎn)量為42.62 g/L，約為深層通氣發(fā)酵產(chǎn)量的2倍。在γ-PGA微生物合成研究中，關(guān)于細(xì)胞固定化報(bào)道較少。Berekaa等[18]研究了包埋法和吸附法固定化B. lichenniformis strain-R生產(chǎn)γ-PGA，結(jié)果表明吸附法優(yōu)于包埋法，最適固定化載體為海綿。以海綿固定化細(xì)胞strain-R，在柱式滴流床反應(yīng)器進(jìn)行批次半連續(xù)生產(chǎn)γ-PGA，第3批次γ-PGA產(chǎn)量最大，為55.5 g/L，第4批次γ-PGA產(chǎn)量略微下降。

2 γ-PGA廢水處理方面的應(yīng)用

γ-PGA為線型聚陰離子高分子，具有水溶性聚羧酸的性質(zhì)，有強(qiáng)吸水性和金屬螯合性，可用作絮凝劑[19]。作為一種新型微生物絮凝劑，γ-PGA具有生物可降解性、水溶性、無(wú)毒和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，在水處理方面應(yīng)用前景廣闊[20]。

在γ-PGA絮凝活性研究方面，Yokio等[21]考察了Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等金屬離子作為γ-PGA助凝劑對(duì)高嶺土懸浮液的絮凝活性影響，結(jié)果表明，Ca2+對(duì)γ-PGA助凝效果最佳，最適pH為4。Shih等[41]也考察了金屬離子和pH對(duì)絮凝活性的影響，發(fā)現(xiàn)Ca2+為最佳助凝離子，最佳絮凝pH為中性。Bajaj等[23]采用響應(yīng)面法對(duì)B. subtilis R 23生產(chǎn)的γ-PGA最佳絮凝條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最佳條件下，絮凝活性達(dá)到最大30.32±1.4 1/OD。Wu等[3]對(duì)B. subtilis DYU1發(fā)酵產(chǎn)物（主要成分為γ-PGA）的絮凝性能進(jìn)行了研究，對(duì)γ-PGA絮凝高嶺土的機(jī)理進(jìn)行了初步推測(cè)，但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不充分。Taniguchi等[24]對(duì)γ-PGA進(jìn)行了交聯(lián)改性，并研究了其物理化學(xué)性能及其對(duì)高嶺土的絮凝活性。采用改性γ-PGA和無(wú)機(jī)絮凝劑聚合氯化鋁復(fù)配使用，絮凝活性顯著提高。

在廢水脫色方面，Inbaraj等[25]研究γ-PGA包裹的磁性納米顆粒對(duì)亞甲基藍(lán)染料吸附特性，最大吸附容量達(dá)78.67 mg/g。Inbaraj等[26]研究了γ-PGA對(duì)陽(yáng)離子型染料堿性藍(lán)9（BB9）和堿性品綠4（BG4）的吸附，飽和吸附量分別為352.76和293.32 mg/g。Deng等[2]利用Aspergillus parasiticus產(chǎn)生的絮凝劑對(duì)8種染料進(jìn)行了處理，對(duì)活性藍(lán)4和酸性黃25的處理效率分別達(dá)到了92.4%和92.9%。

工農(nóng)業(yè)廢水、城市生活污水及各種采礦廢水均含有大量的金屬離子，這些重金屬通過(guò)食物鏈生物富集，嚴(yán)重威脅生物和人體健康。目前應(yīng)用的廢水處理方法分為化學(xué)法、物理法和生物法。利用微生物絮凝劑對(duì)廢水中的重金屬進(jìn)行處理，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。在重金屬去除方面，Mark等[27]研究發(fā)現(xiàn)，B. licheniformis ATCC 9945生產(chǎn)的γ-PGA對(duì)Cu2+有很強(qiáng)的吸附能力和吸附容量，可用于除去廢水中的重金屬離子，用于回收金屬和減少環(huán)境污染等。徐虹等[28]研究發(fā)現(xiàn)γ-PGA能有效降低電鍍廢水中Cr3+、Ni2+等金屬離子濃度。Inbaraj等[29]研究發(fā)現(xiàn)γ-PGA吸附汞（Ⅱ）為放熱自發(fā)的反應(yīng)，吸附動(dòng)力學(xué)符合準(zhǔn)二級(jí)，5 min吸附量可達(dá)80 mg/L。Yao等[30]應(yīng)用Bacillus subtilis NX-2所產(chǎn)的γ-PGA吸附電鍍廢水中微量重金屬離子，Cr（Ⅲ）從3.07 mg/L降至0.15 mg/L，Ni（Ⅱ）從9.46 mg/L降至1.01 mg/L，達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。

3 展 望

γ-PGA從原材料、生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品性能均能實(shí)現(xiàn)真正意義上的“綠色”，具有廣闊的發(fā)展前景和巨大的開發(fā)潛力。然而，亟需解決的是如何降低生產(chǎn)成本和控制產(chǎn)物結(jié)構(gòu)（L-/D-單體比例）、分子量等。根據(jù)國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀，筆者認(rèn)為γ-PGA的研究方向?qū)⒅饕性谝韵聝蓚€(gè)方面[31]：一方面繼續(xù)尋找能夠利用廉價(jià)的原料高效高產(chǎn)γ-PGA的優(yōu)良菌株，尤其是谷氨酸非依賴性合成菌，如采取與谷氨酸生產(chǎn)菌共混發(fā)酵法，或利用煙草葉肉細(xì)胞、谷氨酸棒桿菌作為宿主實(shí)現(xiàn)γ-PGA合成酶表達(dá)，降低生產(chǎn)成本；另一方面致力于對(duì)γ-PGA合成工藝及合成機(jī)制的探討。發(fā)酵液粘度隨γ-PGA濃度增加而增大。高粘性引起的傳氧和傳質(zhì)限制是導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)量低的重要影響因素之一。因此，高效、低能耗曝氣方式的研究將有效的提高γ-PGA的產(chǎn)量。同時(shí)通過(guò)染色體融合、合成酶表面修飾、基因剪切等生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面深入研究，結(jié)合基因和蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)、模擬基因表達(dá)和酶系催化，實(shí)現(xiàn)γ-PGA的體外合成控制，為γ-PGA大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：夏亞男）

Research Progress on Production and Application of Bioflocculantγ-Polyglutamic Acid

SHAO Ying，ZHAO Cai-feng，SHAO Sai，ZHANG Le-ping
（1. Institute of Nuclear Agricultural Science and Space Mutation Breeding, Hunan Academy of Agriculture Sciences, Hunan province Engineering Technology Research Center of Agricultural Biological Irradiation, Hunan province Biological Irradiation Techonology Engineering Research Center, Changsha 410125, PRC）

γ-polyglutamic acid is a polypeptide composed of L-glutamic acid or D-glutamic acid by peptide bond formation. γ-PGA is a promising environmental friendly material with outstanding water solubility, biocompatibility, hydrolysis, biodegradability and nontoxic. This paper reviews the microbial synthesis of γ-PGA production processes, such as the production of strains, medium optimization, fermentation technology and immobilization technology. Meanwhile, it focuses on the application of γ-PGA in wastewater treatment, and points out the development direction in the future.

γ-polyglutamic acid; biosynthesis; wasterwater; application; review

X703.5

：A

：1006-060X（2017）08-0123-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.008.032

2017-06-06

湖南省農(nóng)業(yè)生物輻照工程技術(shù)研究中心科學(xué)基金開放項(xiàng)目（2016KF002）；湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2016QN09）；湖南省環(huán)境保護(hù)廳科研課題（湘財(cái)建指〔2016〕59號(hào)）

邵 穎（1965-），女，湖南湘陰縣人，副研究員，主要從事核輻射與環(huán)保新材料研究。

邵 賽