吳海濱，楊 娟，黃 超，周杰瓏，吳培福

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224)

蛋源大腸埃希菌的分離鑒定及毒力基因和耐藥基因檢測(cè)

吳海濱，楊 娟，黃 超，周杰瓏，吳培福*

(西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224)

為了調(diào)查雞蛋中大腸埃希菌的感染情況，為生產(chǎn)實(shí)踐提供參考，從昆明市區(qū)雞蛋中分離出了3株大腸埃希菌，并對(duì)其毒力基因、耐藥基因、動(dòng)物致病性及藥物敏感性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，菌株KM1攜帶的毒力基因檢出率75%，耐藥基因檢出率77.3%；菌株KM2攜帶的毒力基因和耐藥基因檢出率居中；菌株KM3毒力基因檢出率91.7%，耐藥性基因檢出率50%。動(dòng)物毒力檢測(cè)結(jié)果KM1為不致病菌株，KM2為低致病菌株，KM3為中度致病菌株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松鈉敏感，對(duì)慶大霉素、氨芐西林等具有不同程度的耐藥性。中草藥對(duì)3株大腸埃希菌的抑制效果各有所不同，相比之下連翹與松針的效果較好。本試驗(yàn)為研究昆明市區(qū)雞蛋中大腸埃希菌污染與防控提供了理論依據(jù)。

蛋源大腸埃希菌；毒力基因；耐藥基因；中草藥

致病性大腸埃希菌可通過(guò)感染雞的卵巢、輸卵管或糞便等途徑而污染種蛋，并侵入種蛋內(nèi)繁殖，致使種蛋孵化率下降、死胚增多，弱雛、雛雞病死率增加等問(wèn)題，引發(fā)雛雞發(fā)生大腸桿菌感染，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，雞蛋大腸埃希菌污染具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，蛋源大腸埃希菌的致病性和人們的健康緊密相關(guān)，會(huì)對(duì)人體健康造成較大的危害[1]。研究表明，大腸埃希菌極易產(chǎn)生耐藥性[2]，且其耐藥譜越來(lái)越寬，對(duì)許多抗生素產(chǎn)生了耐藥性，甚至對(duì)未使用的新藥也有耐藥性。為此，分離鑒定蛋源大腸埃希菌，并對(duì)分離株的耐藥性、致病性及新型抗菌藥物篩選的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。統(tǒng)計(jì)表明，雞大腸桿菌病是云南省養(yǎng)雞業(yè)的頭號(hào)細(xì)菌病之一，而蛋源大腸埃希菌的研究文獻(xiàn)較少。本研究從昆明市及周邊地區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集雞蛋，并從中分離鑒定大腸埃希菌，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，為種雞場(chǎng)雞大腸桿菌感染的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞蛋 雞蛋80枚，購(gòu)自昆明市及周邊地區(qū)各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯(實(shí)驗(yàn)室配制)；伊紅美藍(lán)(EMB)培養(yǎng)基，青島科技園海博生物科技有限公司產(chǎn)品；MH肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 中草藥 大黃、黃柏、金銀花、連翹，購(gòu)自昆明市盤龍區(qū)社區(qū)醫(yī)院。松針采集于西南林業(yè)大學(xué)后山。

1.1.4 抗菌藥物 氨芐西林鈉、左氧氟沙星、頭孢曲松鈉、頭孢拉定、頭孢噻肟鈉、阿莫西林鈉舒巴坦、硫酸慶大霉素，均購(gòu)于云南宏源藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 接種培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[3-5]，在無(wú)菌條件下取蛋內(nèi)容物置于無(wú)菌50 mL離心管內(nèi)，混勻，而后吸取1 mL蛋液置于另一無(wú)菌離心管中，加入9 mL肉湯培養(yǎng)基稀釋，用漩渦混合器充分混勻，最后將稀釋蛋液用肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行10倍倍比稀釋至103，于37℃條件下培養(yǎng)48 h。將上述培養(yǎng)物接種于EMB瓊脂平板上，37℃倒置培養(yǎng)24 h～48 h，置-20℃保存可疑菌落，以待鑒定。

1.2.2 生化特性鑒定 采用常規(guī)技術(shù)來(lái)鑒定分離菌株，包括糖發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇)、吲哚試驗(yàn)、明膠試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、MR和VP試驗(yàn)。

1.2.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 將12只昆明小鼠隨機(jī)分成4組：A組、B組、C組和D組，每組3只。A組為對(duì)照組，通過(guò)腹腔接種0.2 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；B組、C組和D組分別接種0.2 mL的不同菌液(接種濃度為107CFU/mL)。觀察試驗(yàn)鼠的臨床表現(xiàn)，并做記錄。結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 抗菌藥物體外抑菌試驗(yàn) 采用微量稀釋法檢測(cè)分離株的藥物敏感性。用無(wú)菌生理鹽水將氨芐西林鈉、左氧氟沙星、頭孢曲松鈉、頭孢拉定、頭孢噻肟鈉、阿莫西林鈉舒巴坦、硫酸慶大霉素稀釋成1 024 μg/mL的溶液，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)，將2個(gè)酶標(biāo)板并列，1列～15列各孔中加入100 μL MH肉湯培養(yǎng)基，而后，第1列加入1 024 μg/mL的抗生素100 μL，進(jìn)行2倍倍比稀釋至213，每種抗生素設(shè)3個(gè)平行和1個(gè)空白對(duì)照。最后1～14列各孔加100 μL 105CFU/mL的菌液，留置第15列孔作為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)24 h，觀察酶標(biāo)板各孔的渾濁度，判斷結(jié)果。

1.2.5 毒力基因檢測(cè) 用煮沸法提取分離株基因組DNA，擴(kuò)增條件參照下列文獻(xiàn)。

參照文獻(xiàn)[7-8]合成毒力基因引物(表1)。包括cvaC、feoB、fimA、fyuA、iroN、irp-2、iss、iucC、iutA、papC、traT和tsh。

表1 PCR擴(kuò)增的毒力基因引物

1.2.6 耐藥基因 檢測(cè)參照文獻(xiàn)[9-10]來(lái)合耐藥基因引物(表2)?；前奉惸退幓虬╯ul1、sul2和sul3；四環(huán)素類耐藥基因包括tetA和tetB；氨基糖苷類耐藥基因包括aacC2、aacC4、aadAl、aadA2、aac(3)-Ia、aac(3)-IIa和aph(3)-IIa；氯霉素類耐藥基因包括Catl、CmlA和Flor；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因包括CTX-M、SHV、OXA和TEM；其他基因包括Gyra(QRDR)、QnrS和Aac(6，)-Ib-cr。

表2 PCR擴(kuò)增的耐藥基因引物

1.2.7 中草藥提取物體外抑菌試驗(yàn) 稱取大黃、黃柏、金銀花、連翹和松針各50 g，參考文獻(xiàn)[11-12]所述方法，通過(guò)牛津杯法來(lái)研究各藥物的體外抑菌效果。測(cè)試項(xiàng)目包括體外抑菌圈大小、最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果

2.1 生化鑒定

從采集雞蛋中共分離到9株可疑菌，通過(guò)生化鑒定最終確定其中3株為大腸埃希菌，分別命名為KM1、KM2和KM3。

2.2 毒力基因檢測(cè)

從表3中可以看出檢測(cè)12對(duì)毒力基因的結(jié)果是菌株KM1、KM2和KM3均攜帶毒力基因，其中檢出率為100%的毒力基因包括feoB、fimA、fyuA、iroN、irp-2、iss、iucC、iutA和traT，并未檢出cavaC基因。

表3 毒力基因檢出率

注：“+”攜帶，“-”不攜帶。

Note：“+” Detection，“-”Not detection.

2.3 毒力基因檢出數(shù)量

從表4中可以看出KM3在3株菌種攜帶的毒力基因攜帶率91.7%，其次是KM2攜帶率83%，最后是KM1攜帶率75%。

表4 毒力基因檢出數(shù)量

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

經(jīng)統(tǒng)計(jì)在腹腔注射48 h后，A組小鼠未死亡，3只全部存活；B組小鼠也全部存活；C組小鼠有1只致死，存活2只；D組小鼠致死2只，存活1只。發(fā)病小鼠精神萎靡，不喜走動(dòng)。剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺有不同程度的出血癥，腸道充氣，腸壁變薄。由此表明，KM1菌株不致病，KM2為低致病性菌株，KM3為中致病性菌株。

2.5 耐藥基因檢測(cè)

從表5中看出，100%檢出的耐藥基因包括sul1、tetA、aacC4、aadA1、aadA2、Cat1、TEM和Gyra(QRDR)，耐藥基因SHV和QnrS未檢出。

表5 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

注：“+”攜帶，“-”不攜帶。

Note： "+" Detection，"-"Not detection.

2.6 藥敏試驗(yàn)

2.6.1 抗生素體外抑菌試驗(yàn)最小抑菌濃度MIC測(cè)定 表6中數(shù)據(jù)顯示3株大腸埃希菌對(duì)氨芐西林鈉與硫酸慶大霉素的耐藥性最高，對(duì)頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉敏感。

2.6.2 中草藥提取物體外抑菌試驗(yàn)抑菌圈測(cè)定 從表7中分析得出中草藥對(duì)于耐藥性高的菌株具有較好的抑制作用，松針提取物對(duì)于大腸埃希菌也有抑制效果。

2.6.3 中草藥提取物體外抑菌試驗(yàn)MIC與MBC測(cè)定 從表8中可以看出中草藥提取物對(duì)大腸埃希菌的抑制作用，且在抑制效果上各有不同，總體來(lái)說(shuō)，連翹和松針的效果較好，金銀花、大黃、黃柏的抑菌效果次之。

表6 抗菌藥物對(duì)3株大腸埃希菌的最小抑菌濃度MIC

表7 中草藥體外抑菌試驗(yàn)效果

3 討論

從昆明市及周邊各農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上采購(gòu)的80枚雞蛋共分離鑒定出了3株大腸埃希菌，雞蛋內(nèi)容物中大腸埃希菌的攜帶率為3.75%，普遍比其他地方低。陳國(guó)營(yíng)等[13]檢測(cè)出90枚雞蛋內(nèi)容物中大腸埃希菌的攜帶率為6.67%，由此可以看出，云南省昆明市及周邊地區(qū)的雞蛋安全性較高。

表8 中草藥提取物體外抑菌的MIC值與MBC值

致病性研究中發(fā)現(xiàn)， KM3菌株攜帶了11個(gè)毒力基因，攜帶率91.7%，動(dòng)物致病性試驗(yàn)中致死2只小鼠，KM3菌株為中致病性菌株。KM2和KM1攜帶毒力基因的個(gè)數(shù)分別為10和9，KM2菌株致死1只小鼠，KM1菌株并無(wú)致死，KM3菌株比其他兩株菌多攜帶了papC和Tsh基因，papC基因編碼P菌毛。Kariyawasam等證明Pap操縱子出現(xiàn)于APEC O1菌株的一個(gè)毒力島上，其基因組區(qū)域可能與非致病性向致病性的轉(zhuǎn)化相關(guān)。溫度敏感性血凝素Tsh能黏附紅細(xì)胞、血色素、外膜纖維連接蛋白和IV膠原等，Tsh可能與APEC的黏附作用有關(guān)，也可能與攝鐵功能相關(guān)。KM3菌株也由于這2個(gè)基因致病性比KM2和KM1強(qiáng)。一般情況下，毒力基因攜帶越多，其致病性越強(qiáng)，現(xiàn)其中2株為致病菌，如KM2和KM3可能對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生危害。KM1菌株攜帶毒力基因最少，在動(dòng)物毒性試驗(yàn)中為不致病菌株。董向磊[11]認(rèn)為攜帶iutA、iss、tsh、iroN、irp-2、cvaC這6個(gè)基因中2個(gè)以上的即為致病菌株。但是也有列外，有3個(gè)菌株含iutA、iss、tsh、iroN、irp-2、cvaC這6個(gè)毒力基因中的2個(gè)或以上是非致病性菌株。本研究中KM1攜帶了iutA、iss、iroN、irp-2這4個(gè)毒力基因，動(dòng)物毒性試驗(yàn)結(jié)果為非致病株，這與董向磊的研究結(jié)果相同。之所以出現(xiàn)這種結(jié)果，可能在基因間存在拮抗作用。2006年薛俊龍等[14]研究了138株雞致病性大腸埃希菌的耐藥情況，其中慶大霉素耐藥率28.2%，阿莫西林耐藥率87.0%。本研究發(fā)現(xiàn)慶大霉素耐藥率為66.7%，阿莫西林鈉舒巴坦耐藥率33.3%。由此可見，大腸埃希菌對(duì)慶大霉素耐藥率相比于2006年有明顯的增加，阿莫西林鈉舒巴坦相比阿莫西林效果更佳。慶大霉素耐藥率急速上升可能是盲目用藥的后果。

中草藥和松針來(lái)源廣泛，不易產(chǎn)生耐藥性，且體外抑制蛋源大腸埃希菌試驗(yàn)中抑菌效果明顯。若對(duì)其抑菌機(jī)制加以研究并優(yōu)化中草藥配伍，增加其抑菌效果，可廣泛應(yīng)用于今后的養(yǎng)殖業(yè)，為今后解決蛋源大腸埃希菌感染的問(wèn)題走出一條新路。但鑒于禽類消化道短，食物在其體內(nèi)停留時(shí)間少，藥物的吸收率不高，因此，要利用科技，優(yōu)化藥物生產(chǎn)工藝。要開發(fā)出易于禽類吸收的速效藥劑，如高效釋放劑、超微粉碎劑等提高藥物釋放速度和釋放量，增加藥物在禽體內(nèi)停留時(shí)間，增強(qiáng)藥效，以預(yù)防和治療大腸埃希菌的感染。

[1] 劉 慧.現(xiàn)代食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社,2006：143-163.

[2] 李宏偉,汪 洋,張 蕾,等.洛陽(yáng)地區(qū)禽源大腸埃希菌分離鑒定與耐藥性分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(6):196-198.

[3] 王紅寧,馬孟根,魏 永,等.規(guī)模化雞場(chǎng)種蛋蛋殼、蛋內(nèi)容物的總菌數(shù)、大腸埃希菌數(shù)、沙門氏菌數(shù)測(cè)定[J].中國(guó)家禽,2001,24(23):9-11.

[4] 趙 磊.鮮雞蛋致病微生物檢測(cè)與控制技術(shù)研究[D].新疆烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[5] 李晴云,杜華銳,蔣小松,等.雞蛋微生物測(cè)定與分析[J].四川畜牧獸醫(yī),2003,30(5):22-23.

[6] 蘭 菊,蔣媛嬡,劉紅英,等.雞大腸桿菌病的病原分離鑒定與藥敏試驗(yàn)研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003.37(4):392-395.

[7] 董向磊.禽致病性大腸桿菌的分離鑒定和分離株毒力基因與致病性相關(guān)性研究[D].江蘇揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué),2014.

[8] 蘇志新.雞源禽致病性大腸桿菌分離鑒定及其毒力相關(guān)基因分布特征分析[D].江蘇南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[9] 張 忠.寧夏地區(qū)大腸桿菌臨床分離株的耐藥性研究[D].寧夏銀川：寧夏大學(xué),2013.

[10] 張飛燕.雞源性大腸桿菌耐藥性檢測(cè)及相關(guān)耐藥基因的研究[D].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[11] 王唯霖.中草藥提取物的抑菌機(jī)理及對(duì)大腸桿菌的耐藥性研究[D].河北保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[12] 王經(jīng)洋,李 姝,楊小帆,等.松針提取物抑制病原茵作用研究及成分分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2015,26(2):275-277.

[13] 陳國(guó)營(yíng),詹 凱,陳麗園,等.褐殼、粉殼和綠殼雞蛋內(nèi)外大腸桿菌和沙門菌感染的調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī),2012,44(4):72-73.

[14] 薛俊龍,王采先,張李俊,等.山西省雞致病性大腸桿菌耐藥性研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(4):68-70.

Identification and Pathogenicity Associated Study ofEscherichiacoliIsolated from Eggs

WU Hai-bin,YANG Juan,HUANG Chao,ZHOU Jie-long,WU Pei-fu

(CollegeofLifeScience,SouthwestForestryUniversity,Kunming,Yunnan,650224,China)

Three strains ofEscherichiacoliwere isolated from eggs in order to investigate the bacterial infection status of eggs in Kunming,and provide the practical reference for egg production.In addition,the associated features of isolated strains were studied,including virulence genes,resistance genes,animal pathogenicity and drug sensitivity test.The results showed that the virulence gene carrying rate of 75% and the resistance gene rate of 77.3% were found in the the strain KM1; the virulence gene rate of 91.7% and the resistance genes rate of 50% were found in the the strain KM3; while,the rate of the KM2 mediated between the KM1 and KM3.The strain KM1 is non-pathogenic,the KM2 is low-pathogenic,and the KM3 is moderately pathogenic.Drug sensitivity test showed that the isolates were sensitive to cefotaxime and ceftriaxone sodium,however,resistant to gentamicin and ampicillin at different levels.The inhibitory effects of Chinese herbal medicine on 3 strains were different.In comparison,theForsythiasuspensaand pine needles had better anti-bacterial effects.The results provided theoretical basis for further investigation and control ofEscherichiacoliin eggs.

Escherichiacoliisolated from eggs; virulence gene; drug resistance gene; Chinese herbal medicine

2016-05-19

云南省優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(50097505)；云南省高校林下生物資源保護(hù)及利用科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(51400605)

吳海濱(1988-)，男，四川通江人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物疫源疫病研究。*通訊作者

S852.6612

A

1007-5038(2017)02-0017-05