李貞，章黎華，董丹鳳，江岑， 彭奕冰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025

·論著·

急診重癥監(jiān)護(hù)室患者與社區(qū)健康人群腸道假絲酵母構(gòu)成的比較與分析

李貞，章黎華，董丹鳳，江岑， 彭奕冰

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025

本研究旨在分析社區(qū)正常人群與急診重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)患者腸道假絲酵母(又稱念珠菌)的組成，比較兩組人群腸道念珠菌構(gòu)成的差異。2014年5—7月，收集1 732名上海社區(qū)健康人群的糞便標(biāo)本；2014年2月—2015年1月，收集191名上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院急診ICU患者的糞便或肛周拭子標(biāo)本。經(jīng)真菌培養(yǎng)收集單個(gè)菌落，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列分析進(jìn)一步鑒定菌種，分析兩組人群腸道定植真菌的組成特點(diǎn)。結(jié)果顯示，社區(qū)健康人群的腸道標(biāo)本中檢測(cè)到9種念珠菌，定植率為13.16%；同時(shí)有兩種和三種念珠菌定植的比例分別為3.81%和0。急診ICU患者腸道標(biāo)本只檢測(cè)到5種念珠菌，但定植率高達(dá)37.17%；同時(shí)有兩種和三種念珠菌定植的比例分別為9.95%和2.09%。社區(qū)健康人群和急診ICU患者腸道中常見(jiàn)念珠菌分別為白念珠菌(5.25%vs. 27.23%)、光滑念珠菌(5.83%vs. 13.61%)、熱帶念珠菌(0.52%vs. 7.33%)、近平滑念珠菌(4.16%vs. 2.09%)、Candidametapsilosis(1.10%vs. 1.05%)。結(jié)果顯示，急診ICU患者的腸道念珠菌定植率顯著高于社區(qū)人群(P<0.001)，同時(shí)有兩種(P=0.001)和三種(P<0.001)念珠菌定植的比例也顯著高于社區(qū)人群。這種腸道念珠菌的高度定植及多重定植可能增加急診ICU患者發(fā)生念珠菌感染的概率。

真菌；假絲酵母；腸道菌群；健康人群；重癥監(jiān)護(hù)室

假絲酵母(又稱念珠菌)是引發(fā)黏膜感染及侵襲性感染的重要致病菌[1]。近年來(lái)念珠菌菌血癥在重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)的發(fā)病率逐年上升。但侵襲性念珠菌感染早期缺乏特異的癥狀和體征，且患者常伴有多種復(fù)雜的基礎(chǔ)性疾病，因此早期診斷較困難，這給臨床預(yù)防治療侵襲性念珠菌感染帶來(lái)了挑戰(zhàn)。已有研究報(bào)道了一些監(jiān)測(cè)侵襲性念珠菌感染發(fā)生的指標(biāo)，其中念珠菌定植被認(rèn)為是獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。

念珠菌并不一定是致病菌，它是人體正常菌群的一部分，常定植在正常人的呼吸道、腸道及陰道。當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)，有可能引發(fā)疾病[3]。在ICU侵襲性念珠菌感染患者中，88.6%在感染前經(jīng)歷過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的念珠菌定植[2]。

腸道菌群是引發(fā)機(jī)體微生物感染的來(lái)源之一。疾病狀態(tài)下，腸黏膜上皮受損，菌群的生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生變化，種群間的拮抗作用減弱，優(yōu)勢(shì)菌群會(huì)大量繁殖。另外，因機(jī)體免疫力下降，腸內(nèi)菌更易向上或向體內(nèi)移位，從而引起肺炎、腸源性感染和內(nèi)毒素血癥等[4]。有研究表明，定植在腸道的念珠菌是引發(fā)念珠菌菌血癥的重要來(lái)源[5]。因此，了解腸道定植菌群的組成及分布有重要意義。

目前有關(guān)腸道菌群的研究多集中于細(xì)菌，腸道念珠菌的研究較少；加上近年來(lái)念珠菌菌血癥的發(fā)病率逐年上升，尤其是ICU危重患者。為此，本研究分析了社區(qū)正常人群與急診ICU患者腸道念珠菌的組成，比較兩組人群腸道念珠菌構(gòu)成的差異。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

于2014年5—7月收集上海社區(qū)健康人群的糞便標(biāo)本，接種于科瑪嘉顯色平板，35 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落顏色，收集單個(gè)菌落于YPD-甘油培養(yǎng)液中-80 ℃凍存。社區(qū)健康人群為進(jìn)行健康普查的人群，符合下列條件：①無(wú)腹瀉；②近1個(gè)月未使用抗生素及抗真菌藥物；③無(wú)其他明顯的疾病癥狀。收集2014年2月—2015年1月進(jìn)入上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院急診ICU約1周的患者，無(wú)腹瀉且未發(fā)生侵襲性念珠菌感染。取其糞便或肛周拭子標(biāo)本，接種于科瑪嘉顯色平板培養(yǎng)，收集單個(gè)菌落于YPD-甘油培養(yǎng)液中-80 ℃凍存。

1.2 菌株鑒定

所收集的菌株經(jīng)API板條(法國(guó)生物梅里埃公司)初步鑒定菌種，其后經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)測(cè)序進(jìn)一步鑒定。即將凍存的菌株接種SDA平板復(fù)蘇后，參照Redkar等[6]的方法提取DNA，保存于-20 ℃，采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增ITS片段進(jìn)一步鑒定菌種[7]。引物為ITS1：5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTT-ATTGATATGC-3′。PCR反應(yīng)體系50 μL，包括10×PCR緩沖液(無(wú)Mg2+)5 μL、25 mmol/L MgCl25 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、10 μmol/L引物各1 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL、DNA(100 ng/μL)1 μL、ddH2O 32.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托Invitrogen公司測(cè)序。

1.3 儀器與試劑

PCR擴(kuò)增儀(PTC-100 Thermal Cycle)購(gòu)自美國(guó)MJ Research公司，ITS分析所用引物由Invitrogen上海技術(shù)服務(wù)部合成，溶壁酶(lyticase)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，電泳成像系統(tǒng)為T(mén)anon 4100成像系統(tǒng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

整理菌種鑒定后的結(jié)果，用SPSS 19.0分析軟件比較社區(qū)人群與急診ICU患者中各種念珠菌檢出率的差異。連續(xù)性變量以mean±SD表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較；分類變量用百分比表示，用卡方檢驗(yàn)比較。P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 社區(qū)健康人群腸道念珠菌的構(gòu)成情況

本研究中共納入社區(qū)人群1 732人，平均年齡(63.38±15.98)歲；男性占43.73%，女性占56.27%。其中13.16%的人群腸道中有念珠菌定植，多為一種念珠菌定植(9.30%)，3.87%的人群同時(shí)有兩種念珠菌定植(表1)。同時(shí)有兩種念珠菌定植的社區(qū)人群中，多見(jiàn)白念珠菌+光滑念珠菌(35人)、白念珠菌+近平滑念珠菌(20人)、白念珠菌+Candidametapsilosis(4人)(表2)。在社區(qū)人群共檢測(cè)到9種念珠菌，其中白念珠菌占5.25%、光滑念珠菌占5.83%、熱帶念珠菌占0.52%、近平滑念珠菌占4.16%、Candidametapsilosis占1.10%。

表1 社區(qū)人群與急診ICU患者腸道念珠菌定植情況的比較

Tab.1 The intestinalCandidain healthy population and emergency ICU (EICU) patients

ParameterHealthypopulationnPositiverate(%)EICUpatientsnPositiverate(%)PvalueTotal1732191Sex(male/female)750/96570/1210.059Age(mean±SD)(year)63.38±15.9859.11±16.81CasewithCandidacolonization22813.167137.17<0.001CasewithoneCandidaspeciescolonization1619.304825.13<0.001CasewithtwoCandidaspeciescolonization663.81199.950.001CasewiththreeCandidaspeciescolonization0042.09<0.001Candidaalbicans915.255227.23<0.001Candidaglabrata1015.832613.61<0.001Candidatropicalis90.52147.33<0.001Candidaparapsilosis724.1642.090.237Candidametapsilosis191.1021.051.000Candidaethanolica10.0600Candidabracarensis10.0600Candidacatenulata10.0600Candidanivariensis10.0600

注：本研究中社區(qū)人群1 732人，其中17人未收集到性別信息。

表2 同時(shí)有兩種念珠菌定植的情況

Tab.2 Cases with twoCandidaspecies colonization

CandidaHealthypopulation(n=66)EICUPatients(n=19)Candidaalbicans+Candidaglabrata3510Candidaalbicans+Candidatropicalis16Candidaalbicans+Candidaparapsilosis202Candidaalbicans+Candidametapsilosis40Candidaalbicans+Candidabracarensis10Candidaglabrata+Candidatropicalis21Candidaglabrata+Candidametapsilosis10Candidatropicalis+Candidaparapsilosis10Candidatropicalis+Candidacatenulata10

2.2 急診ICU患者腸道念珠菌的構(gòu)成情況

急診ICU患者191人，平均年齡(59.11±16.81)歲；男性占36.65%、女性占63.35%。社區(qū)人群與急診ICU患者的性別、年齡構(gòu)成無(wú)顯著性差異。急診ICU患者腸道念珠菌的檢出率顯著高于社區(qū)人群(37.17%vs. 13.16%，P<0.001)，且同時(shí)有兩種(9.95%vs. 3.81%，P=0.001)和三種(2.09%vs. 0，P<0.001)念珠菌定植的比例顯著高于社區(qū)人群。同時(shí)有兩種念珠菌定植的急診ICU患者中，最多見(jiàn)白念珠菌+光滑念珠菌(10人)。在急診ICU患者腸道中只檢測(cè)到5種念珠菌，陽(yáng)性率依次為白念珠菌(27.23%)、光滑念珠菌(13.16%)、熱帶念珠菌(7.33%)、近平滑念珠菌(2.09%)、Candidametapsilosis(1.05%)；其中白色念珠菌、光滑念珠菌及熱帶念珠菌的陽(yáng)性檢出率顯著高于社區(qū)人群。

3 討論

人體腸道內(nèi)寄居著種類繁多的微生物，正常情況下這些微生物對(duì)人體無(wú)害，稱為正常菌群。正常菌群不僅與人體保持平衡狀態(tài)，菌群之間也相互制約，維持相對(duì)平衡。在這種狀態(tài)下，正常菌群發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)、免疫和拮抗等生理作用。在某些情況下，如機(jī)體免疫力下降、使用廣譜抗生素等，會(huì)使腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)疾病[4]。因此，了解腸道正常菌群的構(gòu)成、生理作用及其失調(diào)與疾病的關(guān)系，對(duì)維護(hù)人體健康有重要意義。

念珠菌是引發(fā)血流感染的重要致病菌。真菌血癥的發(fā)病率在丹麥約為8.6/10萬(wàn)[8]，在美國(guó)一些城市達(dá)26.2/10萬(wàn)[9]，而上海高達(dá)32/10萬(wàn)[10]，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康。引發(fā)真菌血癥的致病菌中念珠菌屬最常見(jiàn)(91.97%)，其次是畢赤酵母(3.65%)。念珠菌屬中最常見(jiàn)者為白念珠菌(35.03%)，其次為近平滑念珠菌(18.25%)、熱帶念珠菌(13.87%)、光滑念珠菌(11.68%)[1]。腸道是引發(fā)念珠菌菌血癥的重要來(lái)源之一[5]。本研究發(fā)現(xiàn)念珠菌的腸道定植率在社區(qū)健康人群為13.16%，在急診ICU患者達(dá)37.17%。腸道定植的念珠菌屬中，白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌較常見(jiàn)。雖然光滑念珠菌在腸道的定植率遠(yuǎn)高于近平滑念珠菌，但前者引發(fā)的血流感染率低于后者。這可能是因?yàn)?，一方面光滑念珠菌比近平滑念珠菌毒力弱；另一方面近平滑念珠菌不在患者定植也能引發(fā)血流感染，主要是通過(guò)外源性途徑，如醫(yī)療設(shè)施、醫(yī)護(hù)人員的手、靜脈插管等[11-12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，急診ICU患者腸道念珠菌的檢出率顯著高于社區(qū)人群(37.17%vs. 13.16%,P<0.001)，同時(shí)有兩種(9.95%vs. 3.81%，P=0.001)和三種(2.09%vs. 0，P<0.001)念珠菌定植的比例也顯著高于社區(qū)人群，表明急診ICU患者腸道內(nèi)念珠菌的數(shù)量和種類更豐富。這可能與急診ICU患者大多使用過(guò)廣譜抗生素有關(guān)。應(yīng)用廣譜抗生素后，對(duì)抗生素敏感的細(xì)菌被抑制或殺滅，而對(duì)抗生素不敏感的細(xì)菌和真菌則有機(jī)會(huì)大量繁殖。

綜上所述，社區(qū)健康人群腸道內(nèi)有念珠菌定植，且種類豐富。與社區(qū)健康人群相比，急診ICU患者腸道念珠菌檢出率顯著升高，同時(shí)有兩種和三種念珠菌定植的比例也顯著增高。這種腸道念珠菌的高度定植及多重定植一定程度上增加了急診ICU患者發(fā)生念珠菌感染的概率。

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. PENG Yibing, E-mail: pyb9861@sina.com

Analysis of the composition of intestinalCandidain emergency intensive care unit patients and community healthy population

LI Zhen，ZHANG Lihua，DONG Danfeng， JIANG Cen，PENG Yibing

DepartmentofClinicalLaboratory,RuijinHospital，ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

The purpose of the present study is to investigate the composition of intestinalCandidain community healthy population and emergency intensive care unit (EICU) patients. The stool or rectal swab samples were collected from 1 732 community healthy people in Shanghai between May 2014 and July 2014, and from 191 EICU patients in Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine between February 2014 and January 2015. After fungal culture, individual colonies were collected and further identified by amplifying and sequencing of internal transcribed spacers (ITSs). The composition characteristics of intestinal fungi in the two groups were analyzed by statistical method. The results demonstrated that, in the intestinal tract of community healthy population, 9Candidaspecies were detected. TheCandidacolonization rate of community healthy population was 13.16%, and the colonization rates of two or threeCandidaspecies were 3.81% and 0, respectively. While in the intestinal tract of EICU patients, only 5Candidaspecies were cultured. TheCandidacolonization rate of EICU patients was 37.17%, and the colonization rates of two or threeCandidaspecies were 9.95% and 2.09%, respectively. The positive rates of common intestinalCandidain community healthy population and EICU patients wereCandidaalbicans(C.albicans) (5.25%vs. 27.23%),C.glabrata(5.83%vs. 13.61%),C.tropicalis(0.52%vs. 7.33%),C.parapsilosis(4.16%vs. 2.09%),C.metapsilosis(1.10%vs. 1.05%). It is concluded that the colonization rate of intestinalCandidain EICU patients is significantly higher than that in community healthy population (P<0.001). The colonization rates of two or threeCandidaspecies in EICU patients are also higher than those in community healthy population (P=0.001,P<0.001). EICU patients have a higher colonization rate of intestinalCandida, to a certain extent, could increase the probability ofCandidainfection.

Fungus;Candida; Intestinal flora; Healthy population; Intensive care unit

國(guó)家自然科學(xué)基金(81371873、81572053、81301462)

彭奕冰

2016-02-24)