張占偉，廖亮英，楊 惠，曾勁松，高 宇，梅志剛*

龍琥醒腦顆粒對腦缺血再灌注模型大鼠受損腦細(xì)胞線粒體動力學(xué)的影響

張占偉1，廖亮英1，楊 惠1，曾勁松1，高 宇2，梅志剛2*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208

研究龍琥醒腦顆粒對腦缺血性再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）大鼠受損腦細(xì)胞線粒體動力學(xué)的影響及其機(jī)制。大鼠制備CIRI模型，將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為模型組及龍琥醒腦顆粒低、中、高劑量（75、150、300 mg/kg）組和金納多（150 mg/kg）組，另設(shè)置假手術(shù)組8只，給予相應(yīng)藥物干預(yù)4 d后，TTC染色法檢測大鼠腦組織梗死體積；透射電鏡（TEM）觀察梗塞側(cè)腦皮層組織超微結(jié)構(gòu)的變化；Western blotting和qRT-PCR法檢測各組大鼠線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，F(xiàn)is1）、線粒體融合蛋白2（mitochondrial fusion protein 2，Mfn2）、視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy 1，Opa1）、動力相關(guān)蛋白1（dynamin related protein 1，Drp1）、核受體相關(guān)因子1（nuclear receptor-related factor 1，Nurr1）、Yes相關(guān)蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）和反式形成蛋白2（inverted formin 2，INF2）蛋白及mRNA表達(dá)情況。與模型組相比，各給藥組大鼠神經(jīng)功能評分和腦組織梗死面積均顯著下降（＜0.05、0.01）；大鼠大腦皮層神經(jīng)元病理損傷顯著減輕；受損腦組織、和mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.01、0.001），、、和1 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（＜0.05、0.01、0.001）；受損腦組織Drp1和Fis1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.05、0.01、0.001），Mfn2、Opa1、Nurr1和YAP1蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（＜0.05、0.01、0.001）。龍琥醒腦顆?？梢愿纳艭IRI大鼠腦梗死面積，減輕缺血病理損傷，延緩CIRI進(jìn)展，其機(jī)制可能為通過Nurr1調(diào)控YAP-INF2信號通路，糾正線粒體動力學(xué)失衡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

龍琥醒腦顆粒；線粒體動力學(xué)；神經(jīng)保護(hù)；腦缺血再灌注損傷；核受體相關(guān)因子1；Yes相關(guān)蛋白-反式形成蛋白2信號通路

缺血性腦卒中指由于大腦供血?jiǎng)用}（頸動脈和椎動脈）狹窄或閉塞、腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的一類疾病，其病理核心為大腦局限性缺氧缺糖，致使神經(jīng)功能受損[1-2]。該病具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，給患者及其家庭、社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)。藥物溶栓、機(jī)械取栓是腦部血管栓塞急性期的主要方法，然而缺血后腦組織快速再灌注易引起腦缺血性再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI），阻礙了患者神經(jīng)功能恢復(fù)，為目前缺血性腦卒中康復(fù)的重要絆腳石[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在接受再灌注治療的缺血性腦卒中患者中，約有25%～50%發(fā)生CIRI，嚴(yán)重阻礙了缺血性腦卒中的臨床獲益[4]。因此，深入了解CIRI的病理機(jī)制，探索有效的防治策略來減少再灌注損傷，對改善接受血運(yùn)重建治療的缺血性腦卒中患者預(yù)后至關(guān)重要。

CIRI是一個(gè)復(fù)雜而迅速的級聯(lián)反應(yīng)過程，其發(fā)生機(jī)制主要與興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和血腦脊液屏障破壞等有關(guān)[5]。線粒體作為缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵靶區(qū)，其動力學(xué)紊亂是CIRI中神經(jīng)細(xì)胞損傷的關(guān)鍵[6]。線粒體的動力學(xué)包括線粒體分裂與融合過程，可調(diào)控細(xì)胞信號傳導(dǎo)、鈣穩(wěn)態(tài)、自噬、凋亡和壞死性凋亡等[7]，線粒體分裂與融合失衡是線粒體動力學(xué)紊亂的病理基礎(chǔ)[8]。維持線粒體動力學(xué)穩(wěn)態(tài)是保證神經(jīng)元正常生命活動的重要基礎(chǔ)。核受體相關(guān)因子1（nuclear receptor-related factor 1，Nurr1）是在應(yīng)激條件下調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子[9]。相關(guān)研究證實(shí)，在各種疾病模型中，Nurr1是影響線粒體穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞活力的重要因子[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Nurr1可以通過依賴于Yes相關(guān)蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）途徑的方式阻止反式形成蛋白2（inverted formin 2，INF2）上調(diào)來調(diào)節(jié)線粒體分裂，維持了線粒體的穩(wěn)態(tài)，減少CIRI大腦的梗塞面積，并減少了神經(jīng)元凋亡[11]。故從Nurr1及YAP-INF2信號通路調(diào)控線粒體動力學(xué)穩(wěn)態(tài)，對防治CIRI具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

CIRI屬于中醫(yī)學(xué)的“中風(fēng)”范疇，“氣虛血瘀，經(jīng)脈不通”是貫穿CIRI始終的核心病機(jī)，而益氣養(yǎng)血、化瘀通絡(luò)是其主要治則。龍琥醒腦顆粒由“通竅活血湯”加減而成，具有益氣扶正、活血化瘀兼開竅醒神的功效，契合了CIRI中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)。既往研究發(fā)現(xiàn)，龍琥醒腦顆粒對腦缺血和腦損傷具有重要的治療作用[12-14]，可改善腦血管意外后腦循環(huán)及腦內(nèi)微環(huán)境來達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、減少繼發(fā)性損傷的作用[15]，并且對CIRI后的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[16]。研究表明，活血化瘀、開竅醒神法能改善缺血腦組織供血供氧，減輕血腦屏障破壞，降低氧化應(yīng)激，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善功能損傷等[17-18]。且該法可抑制線粒體膜電位下降，降低線粒體腫脹度，抑制線粒體異常分裂，維持線粒體功能穩(wěn)定[19-20]。

因此，本研究擬通過建立CIRI大鼠模型，觀察腦組織病理損傷、線粒體動力學(xué)關(guān)鍵蛋白以及Nurr1和YAP-INF2通路關(guān)鍵因子mRNA及蛋白表達(dá)情況，深入探究龍琥醒腦顆粒治療CIRI的具體作用機(jī)制，為臨床采用中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠54只，6～8周齡，體質(zhì)量230～270 g，由湖南斯萊克景達(dá)動物實(shí)驗(yàn)有限公司供應(yīng)，許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物于溫度（22±2）℃、相對濕度50%～70%的環(huán)境中，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開展實(shí)驗(yàn)。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號ZYFY20210812），遵循湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用規(guī)定。

1.2 藥品與試劑

龍琥醒腦顆粒由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，由地龍、琥珀、冰片、黃芪、當(dāng)歸、川芎、桃仁、赤芍、天麻、菖蒲、大黃、田七、酸棗仁等組成。參照《湖南省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》2016版由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制劑室制成顆粒劑型（湘藥制字Z20070271，批號20181206，10 g/袋），臨用前以生理鹽水溶解。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）進(jìn)行定量分析，其中黃芪甲苷182.6 μg/g、阿魏酸33.5 μg/g。

金納多（銀杏葉提取物注射液，批號NB169）購自悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司；大鼠血管線栓購自北京西濃科技有限公司；Trizon Reagent（批號CW0580S）、Ultrapure RNA超純RNA提取試劑盒（批號CW0581M）購自康為世紀(jì)有限公司；β-actin抗體（批號TA-09）、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體（批號ZB-2305）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號ZB-2301）購自中山金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，F(xiàn)is1，批號DF12005）、兔抗YAP1（批號AF6328）購自美國Affinity公司；兔抗動力相關(guān)蛋白1（dynamin related protein 1，Drp1，批號12957-1-AP）、鼠抗視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy 1，Opa1，批號66583-1-Ig）購自美國Proteintech公司；兔抗線粒體融合蛋白2（mitochondrial fusion protein 2，Mfn2，批號9482）購自美國CST公司；兔抗Nurr1（批號NB110-40415ss）購自美國Novus公司；TTC染色液（批號G3005）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器

WP8025型高精度腦立體定位儀系統(tǒng)（美國WPI公司）；Z32HK型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Leica公司）；GS-800型凝膠掃描成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Realplex2型熒光定量PCR儀（德國Eppendorf公司）；JEM-1230型透射電鏡（TEM，日本JEOL公司）。

2 方法

2.1 動物造模

參照Rynkowski等[21]方法構(gòu)建大鼠右側(cè)大腦中動脈阻斷缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前大鼠禁食12 h，ip 1%戊巴比妥鈉麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)板上，于頸部正中切開約1.5 cm開口，分離暴露右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA），沿CCA尋找并小心分離頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）和頸外動脈（extemal carotid artery，ECA）。結(jié)扎CCA近心端和ECA，用無菌注射用針頭在距ICA、CCA分叉6 mm處扎開一小口，將尼龍線圓鈍的一端沿開口小心插入ICA，緩慢向前推進(jìn)18～20 mm，使尼龍線末端位于大腦前動脈起始段內(nèi)從而阻斷來自對側(cè)的側(cè)枝循環(huán)血流，遇阻力即停。扎緊CCA以避免尼龍線脫出，縫合傷口，將尼龍線殘端留1 cm長于皮外，2 h后，慢慢拔出尼龍線進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組大鼠除不插入尼龍線外，其余操作與模型組相同。

2.2 神經(jīng)功能評分

再灌注24 h后，評估各組大鼠神經(jīng)功能損傷，參照Longa等[22]方法進(jìn)行神經(jīng)功能評分：神經(jīng)功能無障礙為0分；提尾時(shí)向?qū)?cè)前肢屈曲為1分；不能直行，大鼠向左側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分；行走困難，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒為3分；嚴(yán)重意識障礙，無自發(fā)活動或意識不清為4分。神經(jīng)功能評分為0～3分的大鼠表明造模成功，納入實(shí)驗(yàn)；評分為4分的大鼠予以剔除。

2.3 分組與給藥

大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及龍琥醒腦顆粒低、中、高劑量（75、50、300 mg/kg）組和金納多（150 mg/kg）組，每組8只，另有6只大鼠造模失敗棄用。待術(shù)后大鼠清醒后給藥，各給藥組ig相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組ig等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉，1次/d，連續(xù)4 d。

2.4 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠腦梗死的影響

結(jié)束給藥后，大鼠禁食12 h，ip 2%戊巴比妥鈉（300 mg/kg）麻醉致死。取全腦，清洗干凈于?20 ℃冰凍15 min；用手術(shù)刀片將腦平均切開為5等分，每片厚約2 mm；用2% TTC染液浸沒腦，用錫紙包裹于37 ℃的烘箱中避光放置15 min；用4%多聚甲醛固定并拍照，腦正常區(qū)為紅色，腦缺血梗死區(qū)為白色，用Image-Pro軟件計(jì)算梗死面積。

2.5 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠梗塞側(cè)腦皮層組織損傷的影響

大鼠麻醉處死后，于冰板上取腦，分離腦組織，于梗塞側(cè)腦皮層組織區(qū)取體積約1 mm3的腦組織塊，于2.5%戊二醛溶液中固定24 h。PBS溶液漂洗3次，于1%鋨酸固定液中4 ℃固定2～3 h，然后梯度乙醇溶液脫水，丙酮置換、浸透，純丙酮＋包埋液包埋、烘烤后固化，超薄切片機(jī)切片（70 nm），進(jìn)行3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，于TEM下觀察并拍照。

2.6 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠梗塞側(cè)腦皮層組織線粒體裂解、Nurr1和YAP-INF2通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響

大鼠麻醉處死后，冰板上取腦，分離梗塞側(cè)大鼠皮層組織，清洗干凈后，進(jìn)行充分研磨，用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2?ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以為內(nèi)參，相對定量法計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量，采用Primer Premier 5.0和Beacon designer 7.8軟件進(jìn)行定量PCR引物設(shè)計(jì)，然后由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠梗塞側(cè)腦皮層組織線粒體動力學(xué)、Nurr1和YAP-INF2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

取各組大鼠梗塞側(cè)再灌注損傷皮層腦組織，置于離心管中，加入PMSF-RIPA（1∶100）抽提試劑，12 000 r/min離心10 min，取上清，根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別加入相應(yīng)抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光后通過蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描，并計(jì)算各蛋白的相對光密度值。用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPad Prism 8作圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用表示。計(jì)量資料采用單因素（ANOVA）對多組樣本均值間進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)及Dunnett’s3檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 造模及模型驗(yàn)證結(jié)果

如圖1所示，模型組大鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷情況，與假手術(shù)組相比，其神經(jīng)功能評分顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組大鼠神經(jīng)功能評分均顯著下降（＜0.05、0.01），其中龍琥醒腦顆粒中劑量組作用最佳。

A-假手術(shù)組 B-模型組 C-龍琥醒腦顆粒低劑量組 D-龍琥醒腦顆粒中劑量組 E-龍琥醒腦顆粒高劑量組 F-金納多組 與假手術(shù)組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.2 TTC染色結(jié)果

圖2中白色部分表示腦梗死區(qū)域，紅色部分表示非梗死區(qū)域。如表2所示，與假手術(shù)比較，模型組大鼠腦梗死面積顯著增加（＜0.05）；與模型組比較，各給藥組腦梗死面積顯著減少（＜0.05），以龍虎醒腦顆粒中劑量組梗死面積改善作用最佳。

3.3 TEM結(jié)果

假手術(shù)組大鼠梗塞側(cè)大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓，細(xì)胞核膜完整，核仁可見，線粒體呈圓形或橢圓形，內(nèi)嵴清晰可見，軸索形態(tài)規(guī)則，髓鞘板層呈同心圓致密排列，軸膜清晰，緊貼內(nèi)層髓鞘，軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲及微管排列緊密，線粒體結(jié)構(gòu)清晰（圖3-A1、A2、A3）；模型組神經(jīng)元細(xì)胞體積縮小，核膜皺縮，核仁破裂分散（圖3-B1），線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)模糊（圖3-B2），髓鞘板層嚴(yán)重分離，局部崩解、斷裂，軸漿內(nèi)線粒體模糊不清（圖3-B3）；龍琥醒腦顆粒低劑量組神經(jīng)元細(xì)胞核大而偏橢圓，核膜完整，核仁部分分散（圖3-C1），部分線粒體結(jié)構(gòu)模糊且空泡化（圖3-C2），軸索髓鞘板層排列模糊，板層部分崩解、斷裂，軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲及微管排列疏松，軸漿內(nèi)線粒體模糊不清（圖3-C3）；龍琥醒腦顆粒中劑量組神經(jīng)元體積縮小，細(xì)胞核膜稍完整，核仁破裂分散（圖3-D1），線粒體呈長條，內(nèi)嵴清晰可見（圖3-D2），軸索髓鞘板層模糊，部分出現(xiàn)分離崩解及斷裂，軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲及微管排列緊密，線粒體結(jié)構(gòu)清晰（圖3-D3）；龍琥醒腦顆粒高劑量組細(xì)胞核大而偏橢圓，核膜完整，核仁部分分散（圖3-E1），線粒體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)模糊（圖3-E2），軸索髓鞘板層排列廣泛分離，大部分板層崩解、斷裂明顯，軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲無明顯排列，線粒體模糊結(jié)構(gòu)腫脹（圖3-E3）；金納多組神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓，核膜完整，核仁破裂（圖3-F1），線粒體偏圓形，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)清晰，個(gè)別腫脹有空泡（圖3-F2），軸索髓鞘板層排列模糊，板層局部崩解，軸漿內(nèi)神經(jīng)微絲及微管排列疏松，線粒體結(jié)構(gòu)模糊，部分空泡化（圖3-F3）。

圖2 各組大鼠TTC染色結(jié)果

表2 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠腦梗死的影響(, n = 3)

Table 2 Effect of Longhu Xingnao Granules on cerebral infarct of MCAO rats (, n = 3)

表2 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠腦梗死的影響(, n = 3)

組別劑量/(mg·kg?1)梗死范圍/% 假手術(shù)—0 模型—29.81±0.67# 龍琥醒腦顆粒7524.90±0.70* 15016.75±0.80* 30021.11±0.73* 金納多15022.62±0.77*

與假手術(shù)組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05

#< 0.05sham group;*< 0.05model group

3.4 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠腦梗死側(cè)皮層組織線粒體動力學(xué)、Nurr1和YAP-INF2通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響

如圖4所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死側(cè)皮層組織、和mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)（＜0.05、0.01），、、和mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)（＜0.05、0.001）；與模型組比較，各給藥組和mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.01、0.001），和mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（＜0.05、0.001）；龍虎醒腦顆粒低、中劑量組和金納多組mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)（＜0.001），和1 mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)（＜0.05、0.01、0.001）。

1-神經(jīng)元 2-線粒體 3-軸索

圖4 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠腦梗死側(cè)皮層組織線粒體動力學(xué)、Nurr1和YAP-INF2通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響(, n = 5)

3.5 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠腦梗死側(cè)皮層組織線粒體動力學(xué)、Nurr1和YAP-INF2通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

如圖5所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦梗死側(cè)皮層組織Fis1和Drp1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（＜0.05），Mfn2、Opa1、Nurr1和YAP1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.001）；與模型組比較，龍虎醒腦顆粒高劑量組和金納多組Drp1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.01、0.001），龍虎醒腦顆粒中、高劑量組和金納多組Fis1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.05、0.01），龍虎醒腦顆粒低、中劑量組和金納多組Mfn2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（＜0.001），各給藥組Opa1、Nurr1和YAP1蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（＜0.05、0.01、0.001）。

圖5 龍琥醒腦顆粒對MCAO大鼠腦梗死側(cè)皮層組織線粒體動力學(xué)、Nurr1和YAP-INF2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CIRI的主要病機(jī)為瘀血阻滯，腦絡(luò)不通。瘀血等致病因素在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中被認(rèn)為是導(dǎo)致CIRI的重要因素，“血瘀氣阻，因瘀致虛”導(dǎo)致細(xì)胞線粒體動力學(xué)及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促使神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)能量代謝障礙，影響正常細(xì)胞代謝和調(diào)節(jié)功能，繼而誘發(fā)神經(jīng)元壞死、老化、凋亡。歷代醫(yī)家都善用活血化瘀治療CIRI，龍琥醒腦顆粒是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科經(jīng)驗(yàn)方，由經(jīng)典名方“通竅活血湯”化裁而成，由地龍、琥珀、桃仁、當(dāng)歸、川芎、黃芪、三七、赤芍和冰片等組成，以黃芪益氣扶正，三七、赤芍、桃仁、當(dāng)歸、紅花等養(yǎng)血活血、化瘀通絡(luò)，地龍祛瘀兼有利水，琥珀活血兼鎮(zhèn)驚安神，冰片芳香走竄、醒腦開竅等，全方共奏益氣扶正、活血化瘀兼以開竅醒神功效。然而其潛在作用機(jī)制尚不明確，本研究從CIRI損傷后的線粒體動力學(xué)視角探究其作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用該方奠定理論基礎(chǔ)。

CIRI是缺血性腦卒中血流再通后發(fā)生的最常見繼發(fā)性損傷，增加了30 d住院死亡率[23]，嚴(yán)重阻礙缺血性腦卒中患者的康復(fù)，是臨床亟待解決而又尚未解決的難題。因此，識別CIRI的分子過程對早期預(yù)防具有重要意義。CIRI是一個(gè)復(fù)雜的級聯(lián)過程，其病理環(huán)節(jié)主要包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）爆發(fā)、鈣超載、興奮性氨基酸的毒性、膠質(zhì)細(xì)胞激活、炎癥反應(yīng)及白細(xì)胞黏附等，而線粒體的動力學(xué)功能障礙被認(rèn)為在介導(dǎo)這些病理生理過程中發(fā)揮重要作用[24]。線粒體的動力學(xué)包括線粒體分裂與融合過程，是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的重要內(nèi)源性機(jī)制[25]。相關(guān)研究證實(shí)，CIRI中ROS的增多和鈣失衡等可使線粒體分裂/融合失衡，出現(xiàn)線粒體分裂增多，融合減少，出現(xiàn)線粒體斷裂、碎片化增多，引發(fā)神經(jīng)元的程序性死亡[26-27]。因此，調(diào)節(jié)線粒體動力學(xué)的相對穩(wěn)態(tài)對于CIRI后的恢復(fù)至關(guān)重要。

線粒體分裂主要由Drp1和Fis1等負(fù)責(zé)調(diào)控，Drp1可以通過Fis1以及其他多種銜接蛋白募集到線粒體外膜，在線粒體周圍形成環(huán)，隨后纏繞收縮使原線粒體變成2個(gè)單獨(dú)的線粒體[28]。線粒體融合分為線粒體外膜融合和內(nèi)膜融合，在哺乳動物中，Mfn1和Mfn2通過線粒體嵴形態(tài)重塑促進(jìn)線粒體外膜融合，之后Opa1介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜融合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以提高其能量合成的速度[29]。相關(guān)研究證實(shí)，在CIRI病理中，線粒體分裂明顯增加，而線粒體融合現(xiàn)象明顯減少[30]，通過抑制線粒體分裂，促進(jìn)線粒體融合可以減緩CIRI的病理。Nurr1是Lew教授于1992年首次從小鼠腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的基因，迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)其有明確配體，所以又屬于孤兒受體超家族成員，隨著研究的深入，其在神經(jīng)退行性、腫瘤、腦血管意外等相關(guān)疾病的作用開始受到關(guān)注[31-32]，此外，本課題組先前的研究證實(shí)Nurr1可以通過一種依賴于YAP通路的方式阻止INF2的上調(diào)來抑制線粒體裂變，維持線粒體動力學(xué)的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而減少神經(jīng)元死亡[11]。

本研究證實(shí)，CIRI大鼠腦梗塞側(cè)大腦皮層中和的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高，、的mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，表明CIRI大鼠受損皮層腦神經(jīng)細(xì)胞的線粒體動力學(xué)（分裂/融合）出現(xiàn)明顯的失衡狀態(tài)。龍琥醒腦顆?？梢愿纳艭IRI大鼠腦梗死面積，減輕缺血后腦細(xì)胞病理損傷結(jié)構(gòu)，降低線粒體分裂蛋白Fis1、Drp1表達(dá)，提高線粒體融合蛋白Mfn2、Opa1和Nurr1水平，說明龍琥醒腦顆粒修復(fù)了線粒體動力學(xué)失衡；且龍琥醒腦顆粒抑制線粒體分裂作用呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，高劑量的龍琥醒腦顆粒療效最優(yōu)；而對線粒體融合的作用，高劑量的龍琥醒腦顆粒并未觀察到發(fā)揮顯著的劑量相關(guān)性作用。進(jìn)一步的機(jī)制探索中，本研究發(fā)現(xiàn)龍琥醒腦顆粒可提高Nurr1的表達(dá)水平，通過依賴于YAP1途徑的方式阻止INF2上調(diào)來抑制線粒體分裂，促進(jìn)線粒體融合。龍琥醒腦顆粒上述調(diào)控作用優(yōu)于或者與陽性對照藥物金納多（銀杏葉提取物）大致相當(dāng)，可見龍琥醒腦顆粒有望成為治療CIRI的潛在候選藥物。

綜上所述，龍琥醒腦顆粒能改善CIRI大鼠腦組織的病理損傷，糾正CIRI后線粒體動力學(xué)失衡，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與調(diào)控Nurr1、激活YAP1-INF2信號通路有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Longhu Xingnao Granules on mitochondrial dynamics of damaged brain cells in rats with cerebral ischemia reperfusion injury

ZHANG Zhan-wei1, LIAO Liang-ying1, YANG Hui1, ZENG Jin-song1, GAO Yu2, MEI Zhi-gang2

1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China 2. Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-Cerebral Diseases, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

To study the effect and mechanism of Longhu Xingnao Granules (龍琥醒腦顆粒) on mitochondrial dynamics of damaged brain cells in rats with cerebral ischemia reperfusion injury (CIRI).CIRI rats model was established, and 40 successful rats were randomly divided into model group, Longhu Xingnao Granules low-, medium-and high-dose (75, 150, 300 mg/kg) groups and Ginadol (150 mg/kg) groups, and 8 rats were set as sham group. After 4 d of corresponding drug intervention, infarct volume of rats brain tissue was detected by TTC staining; Ultrastructure of infarcted cerebral cortex was observed by transmission electron microscope (TEM); Western blotting and qRT-PCR were used to detect protein and mRNA expressions of mitochondrial fission protein 1 (Fis1), mitochondrial fusion protein 2 (Mfn2), optic atrophy 1 (Opa1), dynamin related protein 1 (Drp1), nuclear receptor-related factor 1 (Nurr1), Yes-associated protein 1 (YAP1) and inverted formin 2 (INF2).Compared with model group, neurological function score and brain infarction area of rats in each administration group were significantly decreased (< 0.05, 0.01); Pathological damage of cerebral cortex neurons of rats was significantly alleviated;,andmRNA expressions in damaged brain tissue were significantly down-regulated (< 0.01, 0.001),,,andmRNA expressions were significantly up-regulated (< 0.05, 0.01, 0.001); Drp1 and Fis1 protein expressions in damaged brain tissue were significantly down-regulated (< 0.05, 0.01, 0.001), Mfn2, Opa1, Nurr1 and YAP1 protein expressions were significantly up-regulated (< 0.05, 0.01, 0.001).Longhu Xingnao Granules can improve the cerebral infarct size in CIRI rats, reduce ischemic pathological damage, and delay the progression of CIRI. Its mechanism may be that Nurr1 regulates YAP-INF2 signaling pathway and corrects the imbalance of mitochondrial dynamics, thereby exerting neuroprotective effects.

Longhu Xingnao Granules; mitochondrial dynamics; neuroprotection; cerebral ischemia reperfusion injury; Nurr1;YAP-INF2 signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)15 - 4755 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.019

2022-04-18

湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目（202015）；湖南省衛(wèi)健委科研計(jì)劃項(xiàng)目（20200308）；湖南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2021JJ30529，2021JJ30499）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合一流學(xué)科重點(diǎn)項(xiàng)目（2021ZXYJH01）

張占偉，男，博士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治腦血管疾病研究。E-mail: pijia1978@126.com

通信作者：梅志剛，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治缺血性腦病研究。E-mail: zhigangmei@139.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]