付 剛， 付相敏， 劉 棗， 王金華， 王永澤

(1 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院， 湖北 武漢 430068； 2 濱州市力之源生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

大腸桿菌JH-B2產(chǎn)L-丙氨酸發(fā)酵工藝的研究

付 剛1，2， 付相敏1， 劉 棗1， 王金華1， 王永澤1

(1 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院， 湖北 武漢 430068； 2 濱州市力之源生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

L-丙氨酸在醫(yī)藥和食品行業(yè)中有著非常廣泛的應(yīng)用，利用大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酸具有生產(chǎn)周期短和營養(yǎng)要求低的特點。以一株經(jīng)過基因改造的大腸桿菌JH-B2(ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔldhA,ΔpflB∷alaD)作為發(fā)酵菌株，研究其以葡萄糖為碳源配以少量氮源(5g/L酵母粉)發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的條件，對比分批發(fā)酵和補料發(fā)酵的結(jié)果，并在50L的發(fā)酵罐中進(jìn)行了發(fā)酵的放大。研究結(jié)果表明，優(yōu)化后發(fā)酵條件為：轉(zhuǎn)速300r/min，pH6.0，通氣量0.6L/((min·L))。其中，pH為6.0接近于L-丙氨酸的等電點。在此條件下L-丙氨酸產(chǎn)量可達(dá)76.51g/L，比優(yōu)化前提高12.5%；7-L發(fā)酵罐中補料發(fā)酵相比分批發(fā)酵產(chǎn)量提高了40%；在50L發(fā)酵罐中進(jìn)行補料發(fā)酵，L-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到135.0g/L。

L-丙氨酸； 發(fā)酵； 大腸桿菌

L-丙氨酸是一種人體非必需氨基酸，但其在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的用途，可作為手術(shù)前后營養(yǎng)品[1]，亦可作為合成蛋白質(zhì)所需的原料[2]。除此之外，在工程塑料制造方面，L-丙氨酸也具備很大的商業(yè)價值，因此國內(nèi)L-丙氨酸的市場價格較高，約為2.5萬元/t。目前L-丙氨酸生產(chǎn)成本較高[3]，其大規(guī)模應(yīng)用受到一定的限制[4]。由于大腸桿菌具有生長快和營養(yǎng)要求低等特點，采用大腸桿菌生產(chǎn)L-丙氨酸，可在一定程度上降低L-丙氨酸生產(chǎn)成本。徐友強[5]等利用重組大腸桿菌，以富馬酸為底物，采用生物轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化為L-丙氨酸，產(chǎn)量達(dá)到112.5g/L。此外，還可通過基因工程手段，將外源丙氨酸脫氫酶基因?qū)氪竽c桿菌，使大腸桿菌利用葡萄糖合成L-丙氨酸，并通過代謝途徑的優(yōu)化，使L-丙氨酸產(chǎn)量和光學(xué)純度大大提高[6]。周麗[7]等利用重組大腸桿菌，以初始葡萄糖濃度30g/L作為碳源，經(jīng)補料發(fā)酵工藝最終得到67.2g/LL-丙氨酸。

本文以一株經(jīng)過前期基因工程改造的大腸桿菌JH-B2(ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔldhA,ΔpflB∷alaD)作為發(fā)酵菌株。該菌株具有需要有機(jī)氮源更少、發(fā)酵速度快等優(yōu)點。首先評估發(fā)酵轉(zhuǎn)速、pH、通氣量對L-丙氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究分批發(fā)酵與補料發(fā)酵的區(qū)別，并在50L的發(fā)酵罐中進(jìn)行了補料發(fā)酵的放大，以期為大規(guī)模發(fā)酵L-丙氨酸提供發(fā)酵參數(shù)和工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌JH-B2(ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔldhA，ΔpflB∷alaD)，出發(fā)菌株為大腸桿菌EscherichiacoliW(ATCC 9637)，經(jīng)過基因工程手段構(gòu)建而成，甘油管-20℃中保存。

1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：七水硫酸鎂 0.5 g/L，一水硫酸錳 0.05 g/L，磷酸二氫鉀 1.5 g/L，磷酸氫二鉀 3.6 g/L，NaCl 5 g/L，酵母粉 2 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂 20 g/L。

搖瓶種子培養(yǎng)基：七水硫酸鎂 0.5 g/L，一水硫酸錳 0.05 g/L，磷酸二氫鉀 1.5，磷酸氫二鉀 3.6 g/L，酵母粉 2 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖 20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：硫酸銨 30 g/L，七水硫酸鎂 0.5 g/L，一水硫酸錳 0.05 g/L，磷酸二氫鉀 1.5 g/L，磷酸氫二鉀 3.6 g/L，酵母粉 1 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖 120 g/L，聚醚消泡劑 1.0 g/L。

1.3 大腸桿菌JH-B2發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的條件

1.3.1 菌種活化及種子培養(yǎng)

菌種活化：用滅菌后的竹簽從甘油管中蘸取菌液，劃線至活化培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2～3代。

搖瓶種子培養(yǎng)：從活化好的平板培養(yǎng)基上劃取少量菌落，接入400 mL搖瓶種子培養(yǎng)基中，搖床37℃培養(yǎng)12 h。

1.3.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1)轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

將培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液(菌液OD值為1.0～1.5，pH為5.0～5.5)以10%接種量接種至含有1800 mL培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以7.47 mol/L氨水作為發(fā)酵中和劑，初始葡萄糖濃度80 g/L。設(shè)定pH值6.0，溫度37℃，通氣量0.6 L/(min·L)，轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100、200、300、400、500 r/min。

2)通氣量的優(yōu)化

將培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液(OD為1.0～1.5，pH為5.0～5.5)以10%接種量接種至含有1800 mL培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以7.47 mol/L氨水作為發(fā)酵中和劑，初始葡萄糖濃度140 g/L。設(shè)定pH值6.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量分別設(shè)置為2、4、6、8、10 L/min。

3)pH的優(yōu)化

將培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液(OD為1.0～1.5，pH為5.0～5.5)以10%接種量接種至含有1800 mL培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以7.47 mol/L氨水作為發(fā)酵中和劑，初始葡萄糖濃度140 g/L。設(shè)定溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量6 L/min，pH分別設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 L/(min·L)。

1.3.3 不同發(fā)酵方式的比較

1)分批發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液(OD為1.0～1.5，pH為5.0～5.5)以10%接種量接種至含有1800 mL培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以7.47 mol/L氨水作為發(fā)酵中和劑，初始葡萄糖濃度140 g/L。設(shè)定pH值0.6 L/(min·L)，溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量0.6 L/(min·L)，發(fā)酵重復(fù)三次。

2)分批-補料發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液(OD為1.0～1.5，pH為5.0～5.5)以10%接種量接種至含有1800 mL培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以7.47 mol/L氨水作為發(fā)酵中和劑，初始葡萄糖濃度80 g/L，發(fā)酵至24 h時，補充葡萄糖濃度至60 g/L。設(shè)定pH值6.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量0.6 L/(min·L)，發(fā)酵重復(fù)三次。

1.3.4 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵L-丙氨酸 將培養(yǎng)好的搖瓶種子培養(yǎng)液(OD為1.0～1.5，pH為5.0～5.5)以10%接種量接種至含有27 L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以7.47 mol/L氨水作為發(fā)酵中和劑，初始葡萄糖濃度80 g/L，發(fā)酵至24 h時，補充葡萄糖濃度至于60 g/L。設(shè)定pH值6.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量0.6 L/(min·L)。

1.3.5 發(fā)酵終點判斷 通過檢測殘?zhí)呛啃∮? g/L時，確定發(fā)酵終點。發(fā)酵結(jié)束后，升溫至60℃維持30 min。

1.4 分析檢測方法

1.4.1 發(fā)酵液OD值檢測方法 取1 mL樣品稀釋一定倍數(shù)，利用分光光度計在600 nm波長處檢測吸光度，使顯示值在0.2～0.8之間。

1.4.2 葡萄糖的檢測方法 取適量樣品10 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋100倍，利用生物傳感儀(SBA-40D)測定葡萄糖含量。

1.4.3 L-丙氨酸檢測方法 Waters e2695高效液相色譜，依力特C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，流動相甲醇-磷酸氫二鈉混合液(V(pH為6.5的0.05 mol/L磷酸氫二鈉)∶V(甲醇)=1∶9)，流速0.8 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣體積5 μL，檢測波長215 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 攪拌轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

設(shè)定pH值為6.0，溫度37℃，通氣量0.6 L/(min·L)，轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100、200、300、400、500 r/min來考察轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響。

圖 1 攪拌轉(zhuǎn)速對大腸桿菌發(fā)酵L-丙氨酸的影響

由圖1可知，L-丙氨酸產(chǎn)量隨發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速的提高而增加。當(dāng)轉(zhuǎn)速為300 r/min時，產(chǎn)量最大77.12 g/L；當(dāng)轉(zhuǎn)速大于300 r/min時，產(chǎn)量不再增加。結(jié)果表明，發(fā)酵轉(zhuǎn)速是影響搖瓶供氧的重要因素，適當(dāng)氧氣量的供應(yīng)可以促進(jìn)輔酶I的高效回復(fù)利用和代謝的高效運行[3]，這有利于丙氨酸的積累。

2.2 通氣量的優(yōu)化

設(shè)定pH值6.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量分別設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 L/(min·L)來考察不同通氣量對發(fā)酵的影響。

圖 2 通氣量對大腸桿菌發(fā)酵L-丙氨酸的影響

由圖2可以看出，L-丙氨酸產(chǎn)量與通氣量大小成正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)通氣量小于0.6 L/(min·L)時，L-丙氨酸產(chǎn)量隨通氣量增大而增加；當(dāng)通氣量大于0.6 L/(min·L)時，L-丙氨酸產(chǎn)量增長緩慢。通氣量直接關(guān)系到發(fā)酵液中溶氧值大小，但并非通氣量越大越好。當(dāng)通氣量達(dá)到一定值時，產(chǎn)物產(chǎn)量不再明顯提高，發(fā)酵能耗反而會進(jìn)一步增加，而且通氣量太大會使發(fā)酵液飛濺至管壁，容易造成染菌，通氣量6 L/min為大腸桿菌工程菌發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的適宜條件。

2.3 pH的優(yōu)化

設(shè)定溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量0.6 L/(min·L)，pH分別設(shè)置為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8和7.0來考察pH對發(fā)酵影響。

圖 3 pH值對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的影響

由圖3可知，發(fā)酵液pH值為6時，L-丙氨酸產(chǎn)量最高。這可能是由于L-丙氨酸等電點為6.02，因此在pH為6.0時L-丙氨酸溶解度最小，發(fā)酵液中L-丙氨酸濃度最小，對菌體反饋抑制作用最弱[8]。

2.4 7 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

設(shè)定pH值6.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量0.6 L/(min·L)進(jìn)行了分批發(fā)酵實驗。

圖 4 7 L發(fā)酵罐中利用大腸桿菌分批發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸

由圖4可知：0～12 h葡萄糖消耗較慢，產(chǎn)物增加較小，說明大腸桿菌基本還處于生長的延滯期；發(fā)酵12 h以后，耗糖速度和產(chǎn)酸速度明顯提高，發(fā)酵進(jìn)入了產(chǎn)酸旺盛階段，整個發(fā)酵過程中產(chǎn)物的積累基本在這個階段完成，最終L-丙氨酸積累量為95 g/L。

2.5 7 L發(fā)酵罐補料發(fā)酵

設(shè)定pH值6.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量0.6 L/(min·L)進(jìn)行補料發(fā)酵，初糖濃度為80 g/L，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)堑陀? g/L時，補料一次，使葡萄糖濃度達(dá)到60 g/L，繼續(xù)發(fā)酵至殘?zhí)堑陀? g/L，結(jié)束發(fā)酵(圖5)。

圖 5 7 L發(fā)酵罐中利用大腸桿菌補料發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸

從圖5可看出：0～8 h時耗糖速度和產(chǎn)物生成速度較慢；20 h后，耗糖速度和產(chǎn)物速度快速提高；當(dāng)發(fā)酵至46 h 時L-丙氨酸積累量為133 g/L。

2.6 50 L發(fā)酵罐補料發(fā)酵

設(shè)定pH值6.0，溫度37℃，轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量0.6 L/(min·L)，在50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了L-丙氨酸發(fā)酵。初糖濃度為80 g/L，當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)堑陀? g/L時，補料一次，使葡萄糖濃度達(dá)到60 g/L，繼續(xù)發(fā)酵至殘?zhí)堑陀? g/L，結(jié)束發(fā)酵(圖6)。

圖 6 50 L發(fā)酵罐中利用大腸桿菌補料發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸

由圖6可知：0～4 h時產(chǎn)物積累量很少；發(fā)酵4 h以后進(jìn)入產(chǎn)酸期，大量積累產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸；40 h發(fā)酵就已結(jié)束。整個發(fā)酵過程生產(chǎn)強度3.38 g/(L·h)，L-丙氨酸產(chǎn)量135 g/L。

2.7 不同發(fā)酵方式的比較

從表1中可以看出，不同發(fā)酵方式以及不同發(fā)酵規(guī)模對L-丙氨酸發(fā)酵都有一定影響。在7 L發(fā)酵罐中，補料發(fā)酵明顯比分批發(fā)酵效果要好，前者轉(zhuǎn)化率達(dá)95%，后者僅為68%；補料發(fā)酵最大生產(chǎn)強度和平均生產(chǎn)強度均高于分批發(fā)酵。一般來說，分批發(fā)酵初始葡萄糖濃度過高對菌體生長不利，延長了發(fā)酵周期，從本文研究結(jié)果也可看出，分批發(fā)酵發(fā)酵56 h后發(fā)酵液中還有40 g/L的葡萄糖殘留。而分批-補料發(fā)酵初始葡萄糖濃度僅為80 g/L，發(fā)酵46 h基本無殘?zhí)牵l(fā)酵轉(zhuǎn)化率大于95%。

表1 不同發(fā)酵方式L-丙氨酸發(fā)酵的效果

補料發(fā)酵從工藝上講，操作并不復(fù)雜，但其平均生產(chǎn)強度為2.90 g/(L·h)，不但高于分批發(fā)酵，對其他形式工藝操作也具有一定優(yōu)勢，如文獻(xiàn)[7]同樣利用大腸桿菌，以葡萄糖作為碳源，發(fā)酵分好氧和厭氧兩階段進(jìn)行發(fā)酵，其L-丙氨酸最終產(chǎn)量67.2 g/L，轉(zhuǎn)化率67.2%，L-丙氨酸生產(chǎn)強度2.01 g/(L·h)。

從發(fā)酵規(guī)模來看，50 L發(fā)酵罐中的效果比7 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵效果有一定提高，發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)135 g/L。50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵L-丙氨酸時糖酸轉(zhuǎn)化率97%，而7 L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化率僅僅為95%；前者最大生產(chǎn)強度和平均生產(chǎn)強度均高于后者，表明本文菌株在適應(yīng)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)L-丙氨酸上具有很大的潛力。

3 結(jié)論

本文以一株經(jīng)過基因工程改造的大腸桿菌JH-B2(ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔpflB∷alaD,ΔldhA)作為發(fā)酵菌株，對L-丙氨酸發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了探索。1)轉(zhuǎn)速小于300r/min范圍內(nèi)，隨轉(zhuǎn)速增大，L-丙氨酸產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)通氣量小于0.6L/(min·L)時，L-丙氨酸產(chǎn)量隨通氣量增大而增加；發(fā)酵液pH值為6時即在丙氨酸等電點附近時，L-丙氨酸產(chǎn)量最高。

2)對比了補料發(fā)酵和分批發(fā)酵產(chǎn)L-丙氨酸的發(fā)酵效果。結(jié)果表明，采用初糖80g/L補料60g/L的補料發(fā)酵方式，L-丙氨酸可達(dá)133.5g/L，比分批發(fā)酵(95g/L)產(chǎn)量高出40%，生產(chǎn)強度也有很大提高，達(dá)2.90g/(L·h)。

3)50L發(fā)酵罐中的效果比7L發(fā)酵罐中的發(fā)酵效果有一定提高。50L發(fā)酵罐中發(fā)酵L-丙氨酸時糖酸轉(zhuǎn)化率97%，而7L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化率為95%；前者最大生產(chǎn)強度和平均生產(chǎn)強度均高于后者，表明菌株在適應(yīng)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)上具有很大的潛力。

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[2]LeeM,SmithGM,EitemanMA,etal.Aerobicproductionofalanineby,EscherichiacoliaceFldhA,mutantsexpressingthe,BacillussphaericusalaD,gene[J].AppliedMicrobiology&Biotechnology, 2004, 65(1):56-60.

[3] 周麗, 鄧璨, 崔文璟,等. 利用重組大腸桿菌發(fā)酵甘油合成L-丙氨酸[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2016(6):163-169.

[4]DinariSMM.ProgressinSyntheticPolymersBasedonNaturalAminoAcids[J].JournalofMacromolecularSciencePartA, 2011,PartA(8):644-679.

[5] 徐友強, 馬玉岳, 姚粟,等. 重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化富馬酸生產(chǎn)L丙氨酸[J]. 生物加工過程, 2016, 14(2):7-11.

[6]SmithGM,LeeSA,ReillyKC,etal.Fed-batchtwo-phaseproductionofalaninebyametabolicallyengineeredEscherichiacoli[J].BiotechnologyLetters, 2006, 28(20):1695-700.

[7] 周麗, 鄧璨, 崔文璟,等. 溫度調(diào)節(jié)基因開關(guān)調(diào)控大腸桿菌發(fā)酵合成L-丙氨酸[J]. 微生物學(xué)通報, 2015, 42(11):2272-2281.

[8] 鄧輝, 陳存武, 孫傳伯,等. 大腸桿菌磷酸甘油酸脫氫酶突變體的構(gòu)建及抗反饋抑制效應(yīng)[J]. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(4):468-477.

[責(zé)任編校： 張 眾]

Research on L-alanine fermentation by Escherichia coli JH B2

FU Gang1,2, FU Xiangmin1, LIU Zao1, WANG Jinhua1, WANG Yongze1

(CollegeofBioengineeringandFoodScience，HubeiUniv.ofTech.，Wuhan430068China； 2BinzhouLIZHIYUANBiologicalTech.Co.Ltd.,Binzhou256600,China)

L-alanine has been widely used in the pharmaceutical and food industries. The production of L-alanine byEscherichiacolihasthecharacteristicsofshortfermentationtimeandminimalnutritionalrequirement.Inthisstudy,EscherichiacoliJH-B2 (ΔfrdBC,ΔadhE,Δpta,ΔldhA,ΔpflB∷alaD)wasevaluatedforfermentativeproductionofL-alanineusingbatchandfed-batchmodes.Theresultsachievedinbatchfermentationshowedthattheoptimizedfermentationconditionswereasfollows:rotationspeedof300r/min,controllingpHof6.0 (approximatelyequivalenttotheisoelectricpointofL-alanine),andaerationrateof0.6L/(min·L).Undertheseconditions,theL-alaninetiterreachedto76.51g/Linthebatchfermentation,whichwas12.5%higherthanthatproducedinpreviousfermentationwithoutoptimizedcondition.Furthermore,L-alaninetiterachievedinafed-batchmodewas40%higherthanobtainedinbatchmode.Ina50Lfermenterwithafed-batchmode,thetiterofL-alaninereached135.0g/L.

L-alanine；fermentation；Escherichia coli

2016-11-17

湖北省自然科學(xué)基金項目(2011CDB076；2011CDA008)，湖北省教育廳項目(B20121402)

付 剛(1969-)， 男， 山東濱州人，湖北工業(yè)大學(xué)碩士研究生，研究方向為生物化工

1003-4684(2017)01-0116-05

Q

A