向玉勇， 徐中秋， 柴新義

(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州 239000)

金銀花尺蠖幼蟲腸道細(xì)菌分離與鑒定

向玉勇， 徐中秋， 柴新義

(滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州 239000)

金銀花尺蠖是近年來新發(fā)現(xiàn)的金銀花主要食葉害蟲之一，在河南、山東、安徽等地均有分布。為了解金銀花尺蠖幼蟲腸道環(huán)境中的細(xì)菌種類，對金銀花尺蠖幼蟲腸道中的細(xì)菌進(jìn)行分離、純化和培養(yǎng)，獲得3個(gè)細(xì)菌菌株，對菌株的培養(yǎng)性狀、染色反應(yīng)、菌體形態(tài)、生理生化反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，它們分別屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。這3種菌株在金銀花尺蠖幼蟲腸道中存在的數(shù)量差別很大，其中葡萄球菌屬的數(shù)量最大，為6.59×1011個(gè)/mL。

金銀花尺蠖；腸道細(xì)菌；分離；鑒定

動(dòng)物的腸道系統(tǒng)內(nèi)寄居著數(shù)量巨大的微生物群，動(dòng)物的生長發(fā)育除受溫度、濕度、光照等環(huán)境因素影響外，還受其腸道系統(tǒng)內(nèi)的微生物群影響[1-2]。這些微生物群是在與宿主動(dòng)物協(xié)同進(jìn)化過程中形成的，含有多種酶系統(tǒng)，能參與寄主動(dòng)物能量和物質(zhì)代謝，以及遺傳信息運(yùn)轉(zhuǎn)等一系列生理過程[3]，因此，對寄主動(dòng)物的健康生長是有益的。昆蟲是動(dòng)物界中數(shù)量最大的類群，在昆蟲腸道系統(tǒng)中寄居的正常微生物群，是昆蟲機(jī)體的生理組成部分，與昆蟲營養(yǎng)生理活動(dòng)有著密切關(guān)系[4]。如有些昆蟲不能直接利用食物中的某些營養(yǎng)成分，必須依靠腸道內(nèi)微生物的作用才能消化食物，從而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)化。腸道微環(huán)境發(fā)生改變，可引起微生物群發(fā)生變化，從而影響昆蟲的生命活動(dòng)。因此，對昆蟲腸道微生物菌群進(jìn)行研究，可以通過人為調(diào)控打破其腸道微生態(tài)平衡，影響昆蟲的營養(yǎng)生理活動(dòng)，使其不能正常發(fā)育，從而控制害蟲的發(fā)生危害，對害蟲防治具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。目前，國內(nèi)對昆蟲腸道微生物的研究只涉及少數(shù)昆蟲[4-7]，昆蟲是動(dòng)物界中種類最大的類群，不同種類昆蟲甚至同種昆蟲不同蟲態(tài)腸道微生物的種類會(huì)存在差異。因此，還必須選擇更多的昆蟲種類加以系統(tǒng)研究，以明確不同種類昆蟲腸道微生物的類群。

金銀花尺蠖(Heterolochajinyinhuaphaga)屬鱗翅目尺蛾科昆蟲，別稱拱腰蟲，是近年新發(fā)現(xiàn)的金銀花主要食葉害蟲之一，在河南、山東、安徽等地已有報(bào)道[8-11]。該蟲常將金銀花葉片咬成缺刻或孔洞，甚至將葉片全部吃光，造成金銀花大面積減產(chǎn)，給金銀花生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。目前，國內(nèi)對金銀花尺蠖的研究主要是關(guān)于其生物學(xué)特性及防治方面[8-12]，而對其腸道微生物的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)對金銀花尺蠖幼蟲的腸道細(xì)菌進(jìn)行分離及鑒定，以了解其幼蟲腸道細(xì)菌的種類，為進(jìn)一步探討腸道細(xì)菌對其生命活動(dòng)的影響奠定基礎(chǔ)，從而為更好地利用微生態(tài)調(diào)控技術(shù)防治該蟲提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源與培養(yǎng)基

金銀花尺蠖幼蟲采集于安徽省明光市三界鎮(zhèn)，在室內(nèi)人工氣候箱[光—暗周期為14 h—10 h、溫度為(25±1)℃、相對濕度為(70±7)%]中用新鮮的金銀花葉片飼養(yǎng)，選取大小一致的健康老熟幼蟲作為試驗(yàn)材料。培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基等[13]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 腸道細(xì)菌的分離與純化 取10頭金銀花尺蠖5齡老熟幼蟲，浸泡在75%的乙醇中將其殺死，15 s后取出蟲體放在0.1%氯化汞液中消毒2 min，再用滅菌水清洗，然后在無菌條件下取出消化道稱其質(zhì)量后用滅菌研缽研磨成勻漿，研磨液用滅菌水稀釋至10-1～10-10。取10-8、10-9、10-10等3個(gè)稀釋度用平板稀釋法和涂抹法進(jìn)行分離，各稀釋度重復(fù)3次，分別置于生化培養(yǎng)箱中，在30 ℃下培養(yǎng)72 h。挑取表征各異菌落在NA培養(yǎng)基平板上劃線、純化，然后分別移植斜面培養(yǎng)，并按出現(xiàn)數(shù)量依次編號。

1.2.2 腸道細(xì)菌的鑒定 將分離純化得到的各細(xì)菌菌株進(jìn)行形態(tài)染色，觀察其培養(yǎng)性狀，并進(jìn)行生理生化測定，根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]進(jìn)行鑒定。

1.2.3 腸道細(xì)菌的數(shù)量測定 將腸道細(xì)菌懸浮液定量稀釋后，取一定量不同稀釋度的細(xì)菌懸浮液，在瓊脂平板上培養(yǎng)72 h，選取菌落生長稀疏、適當(dāng)稀釋度計(jì)算菌落數(shù)，求出3個(gè)重復(fù)的平均值。按照以下公式計(jì)算出腸道中的細(xì)菌數(shù)[4]：腸道中的細(xì)菌數(shù)(個(gè)/mL)=平板上菌落數(shù)(個(gè))×稀釋倍數(shù)/平板上加菌液的量(mL)。

2 結(jié)果與分析

通過對金銀花尺蠖幼蟲腸道細(xì)菌進(jìn)行分離純化，獲得3個(gè)細(xì)菌菌株，對3個(gè)菌株進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。

2.1 菌體形態(tài)和培養(yǎng)性狀

在NA培養(yǎng)基上將供試菌株培養(yǎng)24 h，經(jīng)革蘭氏染色法和3% KOH簡易法鑒別，均呈陽性。油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，1個(gè)菌株呈球狀，2個(gè)菌株呈桿狀。用NA、NB培養(yǎng)基將分離純化的供試菌株經(jīng)28 ℃培養(yǎng)48 h后觀察，3個(gè)菌株在2種培養(yǎng)基各呈不同的表現(xiàn)(表1)。

表1 金銀花尺蠖幼蟲腸道細(xì)菌形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀

2.2 供試菌株生理性狀

從表2可知，經(jīng)不同溫度、pH值、NaCl濃度下培養(yǎng)，所有供試菌株均在15～42 ℃、pH值5～9、NaCl濃度2%～7%條件下生長良好。在10 ℃低溫下只有3號菌株能夠正常生長；在55 ℃高溫下，只有1號菌株能夠正常生長；pH值=11條件下只有1、2號菌能正常生長；在10% NaCl濃度條件下只有1號菌株可以正常生長。

表2 金銀花尺蠖幼蟲腸道細(xì)菌生理性狀

注：“+”表示該條件下菌株擴(kuò)繁；“-”表示該條件下菌株死亡。

2.3 供試菌株生化性狀

3種菌株均產(chǎn)生氧化酶和過氧化氫酶，能進(jìn)行淀粉水解和硝酸鹽還原，均能分解利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、海藻糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、肌醇，甲基紅試驗(yàn)均呈陰性，都不產(chǎn)生吲哚，其他生化項(xiàng)目各異(表3)。

表3 金銀花尺蠖幼蟲腸道細(xì)菌生化反應(yīng)

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.4 菌株鑒定

通過對3個(gè)細(xì)菌菌株的培養(yǎng)性狀、菌體形態(tài)、染色反應(yīng)、生理生化性狀等進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明它們分別屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。由表4可見，金銀花尺蠖幼蟲腸道中各菌株存在的數(shù)量差別很大，其中葡萄球菌屬的數(shù)量最大，為6.59×1011個(gè)/mL。

表4 金銀花尺蠖幼蟲腸道細(xì)菌鑒定結(jié)果及存在數(shù)量

3 討論

與其他動(dòng)物一樣，昆蟲與共生的腸道微生物之間建立了復(fù)雜的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系，其腸道系統(tǒng)為各種微生物提供適宜的生活環(huán)境，腸道微生物一方面幫助宿主昆蟲消化食物，為昆蟲提供各種營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面可以起著益生素的作用，調(diào)控腸道微生物區(qū)系本身之間的平衡，保證昆蟲健康。腸道微生物的類群和數(shù)量與昆蟲所取食的食物性質(zhì)存在密切的關(guān)系，不同食性昆蟲腸道環(huán)境中的微生物菌株的種類和數(shù)量存在差別。如刺吸植物汁液的斑衣蠟蟬(Lycormadelicatula)成蟲消化道內(nèi)存在有多黏芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)4種細(xì)菌，其中多黏芽孢桿菌數(shù)量最多[4]；取食動(dòng)物性物品和食品的白腹皮蠹(Dermestesmaculatus)成蟲消化道內(nèi)分布有堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、氣微菌屬(Aeromicrobium)、浸麻芽孢桿菌(Bacillusmacerans)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌和短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)6種細(xì)菌，以巨大芽孢桿菌數(shù)量最多[7]； 取食植物葉片或莖稈的沙漠蝗腸道中優(yōu)勢菌群為腸桿菌屬和鏈球菌屬[16]。本試驗(yàn)從金銀花尺蠖幼蟲腸道中分離鑒定出3種細(xì)菌，分別為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其中葡萄球菌屬的數(shù)量最大。金銀花尺蠖的食性單一，只取食危害金銀花等少數(shù)忍冬科植物，消化道對食物消化也比較單一，可能導(dǎo)致腸道中的細(xì)菌種類比較少。另外，金銀花是中藥材，含有抑菌作用的活性成分，其活性成分對金銀花尺蠖腸道細(xì)菌的影響還有待進(jìn)一步研究。

為適應(yīng)中藥材無公害生產(chǎn)的要求，今后還需進(jìn)一步分析金銀花尺蠖幼蟲腸道主要細(xì)菌菌株的功能，并與食物的營養(yǎng)成分進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，探討細(xì)菌菌群與金銀花尺蠖幼蟲的共生機(jī)制，從而通過人工方法改善和調(diào)節(jié)腸道微生物的微生態(tài)條件，調(diào)控金銀花尺蠖的生長發(fā)育，實(shí)現(xiàn)該蟲的生態(tài)控制。

[1]何明清. 動(dòng)物微生態(tài)學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994.

[2]施曼玲，邱清波，計(jì) 翔. 兩種有磷類爬行動(dòng)物消化道微生物的研究[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，2000，35(6)：12-15.

[3]陳 群，鮑大鵬. 人及動(dòng)物胃腸道正常微生物群的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，13(4)：39-42.

[4]劉玉升，陳艷霞，呂 飛，等. 斑衣蠟蟬成蟲腸道細(xì)菌的鑒定研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，37(4)：495-498.

[5]貝紹國，劉玉升，崔俊霞. 日本龜蠟蚧腸道細(xì)菌分離及鑒定研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，36(2)：209-212.

[6]孟祥杰，劉玉升，崔 俊，等. 六斑異瓢蟲成蟲腸道細(xì)菌分離及鑒定研究[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2008，20(2)：120-121，125.

[7]秦 浩，李志鵬，李林懋，等. 白腹皮蠹幼蟲腸道細(xì)菌分離及鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，40(3)：482-486.

[8]張文冉，高殿滑，劉愛華. 金銀花尺蠖的發(fā)生與氣象條件的關(guān)系[J]. 氣象與環(huán)境科學(xué)，2007，30(4)：60-62.

[9]王廣軍，張國彥，王江蓉. 金銀花尺蠖的發(fā)生規(guī)律與防治技術(shù)[J]. 中國植保導(dǎo)刊，2005，25(3)：22-23.

[10]姜 敏，邵明果，趙伯林. 金銀花尺蠖的生物學(xué)特性及防治技術(shù)[J]. 山東林業(yè)科技，2005(1)：62-63.

[11]向玉勇，劉克忠，殷培峰，等. 安徽金銀花尺蠖的生物學(xué)特性[J]. 滁州學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，12(5)：35-37.

[12]倪云霞，劉新濤，劉玉霞，等. 金銀花尺蠖的藥劑防治[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，35(12)：78-79.

[13]陳天壽. 微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：179-671.

[14]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 2版. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[15]布坎南R E，吉本斯N E. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 中國科學(xué)院微生物研究所，譯. 8版. 北京：科學(xué)出版社，1984.

[16]Hunt J，Charnly A K. Abundance and distribution of the gut flora of the desert locust，Schistocercagregaria[J]. Journal of Invertebrate Pathology，1981，38(3)：378-385.

10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.029

2015-11-21

安徽省高校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目(編號：KJ2012B123)；安徽省高等學(xué)校優(yōu)秀青年人才基金(編號：2009SQRZ147)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(編號：201310377018)。

向玉勇(1974—)，男，湖南麻陽人，博士，副教授，主要從事資源昆蟲學(xué)及害蟲防治研究。E-mail：xyy10657@sohu.com。

S433.4

A

1002-1302(2017)02-0106-02

向玉勇，徐中秋，柴新義. 金銀花尺蠖幼蟲腸道細(xì)菌分離與鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：106-108.