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        23個德國鳶尾品種(系)的ISSR分析

        2017-03-01 06:00:17張永俠原海燕楊永恒劉清泉黃蘇珍
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年2期
        關(guān)鍵詞:鳶尾條帶指紋

        張永俠, 繆 淼, 原海燕, 楊永恒, 劉清泉, 黃蘇珍

        (江蘇省中國科學(xué)院植物研究所/南京中山植物園,江蘇南京 210014)

        23個德國鳶尾品種(系)的ISSR分析

        張永俠, 繆 淼, 原海燕, 楊永恒, 劉清泉, 黃蘇珍

        (江蘇省中國科學(xué)院植物研究所/南京中山植物園,江蘇南京 210014)

        以23個德國鳶尾品種(系)為材料,利用ISSR標記研究23份材料間的遺傳多樣性。結(jié)果表明,10條引物共獲得68條清晰可辨的條帶,多態(tài)性條帶為61條,平均每條引物擴增出6.8條帶,多態(tài)性位點百分率為89.7%;23個德國鳶尾品種(系)的平均有效等位基因數(shù)為1.897 1,平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.331 3,平均Shannon信息指數(shù)為0.491 1,品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)范圍在0.375~0.850,變幅為0.475,說明供試材料具有豐富的遺傳多樣性。UPGMA聚類分析結(jié)果表明,GS值0.706時,23個德國鳶尾品種(系)可聚為5類。利用2個ISSR引物UBC814、UBC900擴增譜帶構(gòu)建的指紋圖譜可以把23個德國鳶尾品種(系)完全區(qū)分開。

        德國鳶尾;遺傳多樣性;ISSR;指紋圖譜

        德國鳶尾(IrisgermanicaL.)為鳶尾科鳶尾屬多年生草本植物,是世界著名的宿根花卉之一,耐寒性強,葉叢美觀,花朵碩大,色彩艷麗,具有較高的觀賞價值,世界各地廣為栽培[1]。德國鳶尾是栽培起源種,并非1個野生種,19世紀末20世紀初美國成為德國鳶尾的雜交育種中心,培育出許多有髯大花德國鳶尾品種[2]。ISSR是1994年Zietkiewicz等提出的一種新型分子標記技術(shù)[3],具有操作簡單、穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富等特點。目前,ISSR分子標記已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析和品種鑒定[4-8],鳶尾屬植物中也有相關(guān)報道。張敏等利用RAPD及ISSR標記分析來自不同產(chǎn)地的鳶尾屬4個野生種的遺傳關(guān)系,結(jié)果表明,鳶尾屬種間遺傳多樣性較高,且種間變異大于種內(nèi)變異[9]。童俊等采用ISSR標記研究34份鳶尾屬園藝品種的遺傳特性及親緣關(guān)系發(fā)現(xiàn),多態(tài)性條帶比例達100%,供試材料具有豐富的遺傳多態(tài)性[10]。

        目前,國內(nèi)栽培的德國鳶尾大多引自國外,自主培育的新品種還處于起步階段。由于對引進品種的遺傳背景不了解,無法確定大部分栽培品種的親緣關(guān)系,且經(jīng)過長期的人工栽培選育,德國鳶尾存在較大的遺傳分化,采用傳統(tǒng)的分類方法很難區(qū)分其種下類群及品種。因此,運用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段,從分子水平上對德國鳶尾種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳多樣性開展研究,可為德國鳶尾種質(zhì)資源的挖掘、創(chuàng)新及德國鳶尾育種中的有效利用提供依據(jù)。本研究利用ISSR分子標記技術(shù),對23個德國鳶尾品種(系)進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究,旨在為德國鳶尾品種鑒定和雜交親本選配提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        供試的23個德國鳶尾品種(系)均采集于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所鳶尾種質(zhì)圃。12個品種于1997年引自西安植物園,引種編號分別為122、128、129、239、266、269、246、247、252、261、127、267,5個品種93E41076-8、93E41076-10、93E41078-17、93E41076-17、201425于1993年引自美國,另有6個為江蘇省中國科學(xué)院植物研究所培育的新品種(系),分別為2013001、黃金甲、幻舞、風燭、2010141、金舞娃(表1)。每個品種(系)采集1棵單株的嫩葉,置于液氮中,帶回實驗室-80 ℃冰箱中保存,備用。

        參考加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)的引物設(shè)計ISSR引物,并由上海捷瑞生物工程有限公司合成;TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker、10×PCR buffer等購于寶生物工程(大連)有限公司;EDC-810型-PCR擴增儀為東盛公司產(chǎn)品。

        1.2 方法

        1.2.1 DNA的提取與檢測 采用CTAB法[11]提取基因組DNA;核酸儀檢測DNA質(zhì)量和濃度,并稀釋至50 ng/μL。

        1.2.2 引物篩選 擴增反應(yīng)在EDC-810型-PCR儀上進行,用2個DNA樣品分別對31條ISSR引物進行篩選,選擇擴增穩(wěn)定、清晰條帶的引物進行正式擴增。

        1.2.3 反應(yīng)體系和擴增程序 通過對模板DNA濃度、Mg2+、dNTPs、Taq酶及退火溫度等試驗,得到2種標記的最適反應(yīng)體系和擴增程序。ISSR反應(yīng)體系25 μL:TaqDNA聚合酶1.0 U、模板DNA 50 ng、10×PCR buffer 2.5 μL、Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、引物0.4 μmol/L,用ddH2O補足到所需體積。擴增程序為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性30 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸120 s,38個循環(huán);72 ℃延伸10 min。ISSR的PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,電泳緩沖液為0.5×TBE,電泳時電壓為5 V/cm;電泳結(jié)束,在上海天能科技有限公司生產(chǎn)的凝膠成像系統(tǒng)儀上觀測分析并拍照。

        表1 供試的23個德國鳶尾品種(系)情況

        1.3 數(shù)據(jù)記錄與分析

        記錄清晰可重復(fù)的DNA電泳條帶,對同一引物的擴增產(chǎn)物,遷移率相同的條帶記為1個位點,同一位點上有條帶記為“1”,無條帶記為“0”;運用NTSYS-PC 2.10e版軟件計算供試材料的遺傳相似系數(shù),進行UPGMA聚類分析;采用POPGEN 1.32軟件計算Shannon信息多樣性指數(shù)(I)、Nei's基因多樣性指數(shù)(He)及觀察有效等位基因數(shù)(Ne)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

        從31條ISSR引物中篩選出10條擴增條帶清晰、重復(fù)性高的引物,圖1為ISSR引物UBC880對23個德國鳶尾品種的ISSR-PCR擴增電泳。由表2可見,10條ISSR引物共擴增出68條清晰可辨條帶,其中多態(tài)性條帶為61條,平均多態(tài)性比率為89.7%,擴增的DNA片段集中在150~2 000 bp之間,平均每對引物擴增出6.8條帶,其中6.1條具有多態(tài)性;多態(tài)性最高的為100%,低的只有75.0%。23個德國鳶尾品種(系)的GS值為0.375~0.850,變幅為0.475,不同引物的擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)的多態(tài)性水平有較大差異。

        2.2 德國鳶尾品種(系)的遺傳多樣性分析

        通過對23個德國鳶尾品種(系)群體遺傳參數(shù)進行計算,結(jié)果表明,23個德國鳶尾品種(系)平均有效等位基因數(shù)為1.897 1,平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.331 3,平均 Shannon 信息指數(shù)為0.491 1,這表明23個德國鳶尾品種(系)間存在豐富的遺傳多樣性。

        2.3 23個德國鳶尾品種(系)的聚類分析

        以23個德國鳶尾品種(系)的68條譜帶數(shù)據(jù)建立遺傳相似系數(shù)矩陣,其中,品種269與239間的遺傳相似系數(shù)相對最大,為0.850;品種93E41076-17、93E41078-17與127間的遺傳相似系數(shù)相對最小,僅為0.375。根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣,采用UPGMA法構(gòu)建供試23個德國鳶尾品種(系)的聚類圖。由圖2可見,于遺傳相似系數(shù)0.706處可將23個供試品種分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ類;Ⅰ類共包含16個品種(系),包括4個矮型小花品種122、128、266、129,2個矮型大花品種93E41076-8、93E41076-10,10個中型大花品種(系)239、269、201425、金舞娃、幻舞、2013001、246、261、93E41076-17、93E41078-17,其中白色品種239和黃色品種269之間的遺傳相似系數(shù)達到0.850,表明這2個品種具有較高的同源性;自主選育的花大色艷的黃色品種金舞娃、深紫色品種幻舞、紫色品系2013001這3個品種(系)的植株形態(tài)極其相似,被聚在一起,三者間的兩兩遺傳相似系數(shù)平均為0.805,處于較高水平,表明這3個品種(系)也具有較高的同源性;Ⅱ、Ⅲ類均只包含1個品種,Ⅱ類為自主選育品種黃金甲,該品種外花瓣基部有紅褐色條紋,觀賞性較高,Ⅲ類為品種267,極矮品種,株高只有10~15 cm,外花瓣黃色,內(nèi)花瓣淡紫色,花色艷麗,觀賞性極高,且是培育矮生德國鳶尾的重要親本;Ⅳ類包含247、風燭、2010141這3個品種(系),其中風燭為自主選育品種,花型奇特,為極其少見的黑紅色重瓣;Ⅴ類包含252、127這2個品種,均為高型淡紫色系品種,但兩者的遺傳相似系數(shù)不大。

        表2 10條ISSR引物擴增結(jié)果

        2.4 23個德國鳶尾品種(系)的ISSR指紋圖譜構(gòu)建

        根據(jù)每個品種DNA擴增圖譜中ISSR標記位點條帶的有無或缺失,分別用0、1進行數(shù)字化統(tǒng)計,形成由0、1排列的字符串,構(gòu)成1個數(shù)字指紋圖譜。由表3可見,由引物UBC814、UBC900構(gòu)建的數(shù)字指紋圖譜,可以快速鑒定出23個德國鳶尾品種(系)。

        3 結(jié)論與討論

        德國鳶尾的栽培品種遺傳背景復(fù)雜,現(xiàn)在栽培的德國鳶尾至少是有10個以上親本的園藝雜種[12]。因此,了解德國鳶尾種質(zhì)資源遺傳變異信息及親緣關(guān)系遠近,是培育優(yōu)良品種的基礎(chǔ)。本研究通過10條ISSR引物共在23個德國鳶尾品種(系)中擴增出68個清晰可辨位點,其中多態(tài)性位點有61個,多態(tài)位點百分率達89.7%;23個德國鳶尾品種的Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.331 3,遺傳相似系數(shù)為0.491 1,這說明德國鳶尾品種具有較為豐富的遺傳多樣性。

        ISSR聚類分析表明,23種德國鳶尾品種(系)被劃分為5類,但并沒有按照花色或花型聚類,而是形態(tài)相似的品種被聚到1類,這表明基于ISSR標記對德國鳶尾品種(系)進行遺傳多樣性分析是可行的。自主選育的品種黃金甲和極矮生品種267分別被獨自聚為1類,說明這2個品種與其他品種遺傳距離相對較遠;唯一的畸形重瓣品種風燭與247、2010141聚到1類,252和127形態(tài)特征相似,也被聚到1類。

        花卉品種鑒定的方法主要依靠表型特征,雖然便捷,但是表型性狀受環(huán)境影響較大,鑒別錯誤率較高,加之花卉品種資源逐年擴大,品種的相似度也越來越高,導(dǎo)致通過傳統(tǒng)的表型鑒定方法來區(qū)分品種越來越難[13]。由于遺傳物質(zhì)DNA受環(huán)境影響較小,且多態(tài)性高,基于DNA擴增的分子標記成為花卉品種鑒定的有效方法,目前,已在麗穗鳳梨、朱頂紅、菊花、景東報春等花卉中構(gòu)建了分子指紋圖譜[5,13-15]。本研究利用引物UBC814、UBC900譜帶構(gòu)建的指紋圖譜可將23種德國鳶尾品種(系)全部區(qū)分開來,說明ISSR是一種構(gòu)建德國鳶尾種質(zhì)資源指紋圖譜的理想標記。

        表3 引物UBC814、UBC900構(gòu)建23個德國鳶尾品種(系)的特征數(shù)字指紋

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        10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.012

        2015-12-14

        江蘇省科技支撐計劃(編號:BE2012349)。

        張永俠(1987—),女,安徽阜陽人,碩士,初級實驗室助理,主要從事觀賞植物遺傳育種研究。Tel:(025)84347086;E-mail:zhangyongxia8712@163.com。

        黃蘇珍,博士,研究員。E-mail:hsz1959@163.com。

        S682.1+90.32

        A

        1002-1302(2017)02-0047-04

        張永俠,繆 淼,原海燕,等. 23個德國鳶尾品種(系)的ISSR分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(2):47-50.

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