雷明月，許為鋼，李小博，張慶琛1,,王會偉，張 磊，方宇輝，李 艷,李春鑫

(1.河南農業(yè)大學農學院，河南鄭州 450002; 2.河南省農業(yè)科學院小麥研究所/小麥國家工程實驗室/農業(yè)部黃淮中部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，河南鄭州 450002 )

玉米C4光合酶基因導入對擬南芥光合特性及抗旱性的影響

雷明月1，2，許為鋼2，李小博2，張慶琛1,2,王會偉2，
張 磊2，方宇輝2，李 艷2,李春鑫2

(1.河南農業(yè)大學農學院，河南鄭州 450002; 2.河南省農業(yè)科學院小麥研究所/小麥國家工程實驗室/農業(yè)部黃淮中部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，河南鄭州 450002 )

為了解玉米C4型光合酶基因對C3植物擬南芥光合特性的影響及其對干旱脅迫的響應，分別以過表達ZmPEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)、ZmPPDK(丙酮酸磷酸二激酶)和ZmNADP-ME(依賴于NADP的蘋果酸酶)單個酶基因的擬南芥株系(分別簡寫為PC、PK、ME)，以及過表達PEPC+PPDK和PPDK+NADP-ME兩個酶基因的擬南芥株系(分別簡寫為PCK、PKM)為供試材料，在開花期停止?jié)菜⒎謩e于干旱脅迫處理前1天、第5天、第10天和結束干旱脅迫復水處理5 d時測定轉基因擬南芥中目標基因的表達量、光合速率、水分利用效率和酶活性。結果表明，在正常生長條件下，PCK類型株系的PEPC酶活性、PPDK酶活性、凈光合速率(Pn)以及水分利用效率(WUE)較野生型擬南芥分別高52%、20%、24%和55%，除PPDK酶活性外，PCK類型株系各指標測定值的增幅均高于其他轉基因類型株系，綜合表現(xiàn)最優(yōu)。不同類型株系的上述測定指標總體表現(xiàn)為PCK>PC>PK、PKM>ME。干旱脅迫處理5 d時，各類型株系中目標基因的表達量、光合酶活性、Pn和WUE均有所上升。干旱脅迫處理10 d時，擬南芥受到嚴重損傷，上述指標的測定值均下降。復水5 d時上述指標得到不同程度的恢復，不同類型轉基因株系的各項測定指標在不同干旱脅迫處理中總體仍表現(xiàn)為PCK最優(yōu)，PC次之。各轉基因株系均優(yōu)于受體非轉基因擬南芥。

擬南芥；干旱脅迫；轉基因；C4光合途徑關鍵酶基因；玉米

大量研究證實，與C3植物相比，C4植物具有更好的光合性能，對高溫、強光及干旱環(huán)境也具有更好的適應能力[1]，因此通過基因工程將C4植物的C4光合途徑關鍵酶基因轉入C3植物，以增強C3植物光合性能和耐脅迫能力已成為國內外作物遺傳改良研究的熱點之一。目前人們已成功將C4植物的若干C4型光合酶基因導入C3植物，在水稻[2]、小麥[3-5]、擬南芥[6]等植物中獲得了高效表達C4型光合酶基因PEPC、PPDK和NADP-ME的轉基因植株。關于C4光合酶基因導入C3植物能否提高C3植物的光合效率，目前的試驗結果仍存在一些分歧[7-10]。已有許多研究表明，過表達C4-PEPC、C4-PPDK基因可顯著提高水稻、小麥等C3植物的光合性能，并增強其抗逆性[11-14]。還有報道表明，過表達PEPC+PPDK雙基因的擬南芥[9]和水稻[15]的光合速率高于單轉PEPC基因，而過表達單個NADP-ME基因的轉基因C3植株光合速率無明顯變化或降低[16-17]。因此，研究C4光合酶基因在C3植物中的表達與功能，比較不同C4光合酶基因及基因組合導入C3植物中的功能差異，對改良C3植物的光合性能和抗逆性具有重要意義。

擬南芥是模式植物，生長周期短、基因組小、易于轉化和人工雜交，利于遺傳研究。本研究利用本課題組已獲得的5類過表達玉米C4光合酶基因的擬南芥株系為材料[6]，比較不同轉基因株系在不同水分處理條件下的光合特性，旨在深入了解C4型光合酶基因及其基因組合對C3植物光合特性及抗旱性的影響，為小麥高光效基因工程研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的轉基因擬南芥材料分別為轉玉米C4光合酶基因ZmPEPC的3個株系(簡寫為PC73、PC65、PC90)，轉ZmPPDK基因的3個株系(簡寫為PK16、PK26、PK36)，轉ZmNADP-ME基因的3個株系(簡寫為ME4、ME5、ME9)，轉ZmPEPC+ZmPPDK基因的3個株系(簡寫為PCK5、PCK7、PCK110)和轉ZmPPDK+ZmNADP-ME基因的3個株系(簡寫為PKM2、PKM4、PKM5)。以轉基因受體擬南芥GLI(哥倫比亞型擬南芥)為對照。以上試驗材料均由河南省農業(yè)科學院小麥研究所分子育種研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料的種植與水分脅迫處理

所有供試材料種植于人工氣候室，氣候室環(huán)境為溫度22～24 ℃，濕度60%；每天光照10 h/黑暗14 h，光照強度為200 μmol·m-2·s-1。所有供試的轉基因擬南芥在開花期前正常供水，開花期停止?jié)菜?，干旱脅迫處理10 d，分別于水分脅迫處理前1天、第5天和第10天測定光合有關參數(shù)，水分脅迫處理10 d后恢復澆水一次，復水5 d后再測定光合有關參數(shù)。每個株系測定4個單株，每個單株重復測定3次。

1.2.2 轉基因擬南芥的PCR驗證

待幼苗長出6～8片真葉后，取葉片提取DNA進行PCR驗證。引物分別為PC1：5′-GCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGT G-3′和PC2：5′-GGCACGTGGCCGCCTAGCC AGTGTTCTGCAT-3′；ME1：5-GTCCATGGT CCGAAGAGGGAGGAGGACGAC-3′和ME2：5′-AACACGTGTCCAGCAGCACCAGCAACA AGG-3′；PK1：5′-GCAGATCTTCGGCTCCCT CTCCCCTTGCTCCAT-3′和PK2：5′-GGTTAT AACACATCCACCAGCAGCAGGCAATCC-3′。

1.2.3 轉基因擬南芥的qRT-PCR分析

取開花期水分脅迫處理不同時間的參試材料葉片100 mg，利用超純RNA提取試劑盒提取葉片總RNA，利用反轉錄試劑盒將其反轉為cDNA，采用SYBR Green染料法進行PCR擴增。用 Bio-Rad 的IQ5熒光定量PCR儀分析目標基因表達量[17]。PEPC、PPDK引物參照Wang等[9]，NADP-ME引物為ME9：5′-CGTGGAGT ACGAAGGAAAGACT-3′和ME10：5′-GAGAT CTTTCTGATGC TGGTGA-3′。

1.2.4 轉基因擬南芥的光合酶活性測定

取開花期不同時間水分脅迫處理的參試材料葉片提取總蛋白，蛋白提取參照Ku等[8]的方法。用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，樣品稀釋到2 mg·mL-1。PEPC、PPDK和NADP-ME酶活性測定參照Sayre等的方法[18]稍作修改，將測定單位改為每毫克蛋白中PEPC、PPDK和NADP-ME的酶活性。

1.2.5 轉基因擬南芥的光合速率和水分利用效率測定

在擬南芥開花期，于日間9:00-14:00之間，利用便攜式光合儀(CIRAS-3,UK)測定轉基因株系和野生型擬南芥不同水分脅迫處理時間下蓮座葉的凈光合速率(Pn)和水分利用效率(WUE)，測定時系統(tǒng)光強設置為800 μmol·m-2·s-1，葉室溫度設置為30 ℃，每個株系測定4個單株，按植株序號往返重復測定3次，測定對象為無病、受光均勻且長勢相當?shù)闹仓晟徸~。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003對數(shù)據(jù)進行平均值和標準差分析，用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 供試材料的PCR驗證結果

對供試的各轉基因株系進行PCR擴增。由圖1可知，含ZmPEPC、ZmNADP-ME、ZmPPDK基因的轉基因株系均擴增出預期的目標片段(3 kb、2.2 kb、3 kb)，非轉基因植株中未擴增出目標片段，表明擬南芥轉基因株系中存在目標基因。

2.2 非水分脅迫條件下不同轉基因擬南芥的比較

2.2.1 目標基因表達量的比較

由圖2可知，野生型均無擴增產物。ZmPEPC、ZmNADP-ME、ZmPPDK在轉基因擬南芥葉片中均可正常轉錄，但不同株系間目標基因的相對表達量存在顯著差異。例如：PC65、PC73、PCK7株系中PEPC基因的表達量分別為PCK110株系的5.35、14.22和7.07倍；ME4、ME9、PKM2、PKM4、PKM5株系中NADP-ME基因的表達量分別為ME5株系的25.88、3.53、16.36、5.67、2.60倍；PK16、PK26、PK36、PCK5、PCK110、PKM2、PKM4、PKM5株系中PPDK基因的表達量分別為PCK7株系的27.87、20.90、13.55、7.76、4.21、17.64、8.57、4.59倍。

A:ZmPEPC；M：1 kb DNA ladder;1:p3301-PEPC;2.Negative control；3-5:PC65，PC73，PC90; 6-8：PCK5，PCK7，PCK110.

B:ZmNADP-ME;M:1 kb DNA ladder;1:p3301-NADP-ME;2.Negative control;3-5:ME4，ME5，ME9; 6-8:PKM2，PKM4，PKM5.

C:ZmPPDK;M:1 kb DNA ladder;1:p3301-PPDK;2:Negative control;3-5:PK16，PK26，PK36; 6-8:PCK5，PCK7，PCK110; 9-11:PKM2，PKM4，PKM5.

圖1 轉基因植株的PCR檢測結果

Fig.1 PCR assay of transgenic plants

*：P<0.05;**：P<0.01.

2.2.2 C4光合酶活性的比較

開花期轉基因擬南芥PC、ME、PK類型株系葉片中相應的PEPC、NADP-ME、PPDK酶的活性較野生型分別提高36%、67%和40%；PCK類型株系葉片中相應的PEPC和PPDK酶的活性較野生型分別提高52%和20%；PKM類型株系葉片中相應的PPDK和NADP-ME酶的活性較野生型分別提高19%和97%，增幅均達到顯著水平(表1)。表明ZmPEPC、ZmNADP-ME、ZmPPDK基因的導入可顯著提高擬南芥植株相應的PEPC、NADP-ME和PPDK酶的活性。

2.2.3 凈光合速率的比較

開花期轉基因擬南芥PC、PK、PCK和PKM類型株系葉片的Pn較野生型分別提高19%、21%、24%和17%，增幅達到顯著水平(表1)。表明ZmPEPC、ZmPPDK基因的導入能顯著提高擬南芥的凈光合速率。其中PCK類型株系的Pn高于PC類型株系，而PC類型株系的Pn高于本試驗其他基因的轉基因材料。

2.2.4 水分利用效率的比較

花期轉基因擬南芥PC、ME、PK、PCK和PKM類型株系的WUE較野生型分別提高39%、31%、39%、55%和33%，增幅達到顯著水平(表1)。表明ZmPEPC、ZmPPDK基因的導入能顯著提高擬南芥的水分利用效率，其中PCK類型株系的WUE高于PC類型株系，而PC類型株系的WUE高于其他基因的轉基因株系。

表1 非水分脅迫處理條件下轉基因擬南芥幾種生理指標的測定結果Table 1 Physiological traits of transgenic plants under non-water stress conditions

表中數(shù)值為轉同一基因的三個株系的平均值±標準差。*：P<0.05；**：P<0.01。

The date presented here are the means of three replicates(±SD).*:P<0.05；**:P<0.01.

2.3 不同轉基因擬南芥對干旱脅迫的響應

2.3.1 干旱脅迫處理第5天時轉基因擬南芥對干旱脅迫的響應

與脅迫前相比，干旱脅迫處理第5天時，轉基因株系上述指標測定值均有所上升(圖3、表2和表3)，不同基因型轉基因擬南芥株系的上述指標測定值的總體趨勢與脅迫前基本一致，且均高于脅迫后的野生型。其中PCK類型株系的PEPC和PPDK基因的表達量較脅迫前分別增加1.50、2.81倍，PEPC酶活性、PPDK酶活性、凈光合速率以及水分利用效率較野生型分別提高75%、45%、41%和74%，綜合表現(xiàn)最優(yōu)。PC類型株系的上述測定指標的表現(xiàn)次于PCK類型株系，但優(yōu)于其他轉基因類型株系。

2.3.2 干旱脅迫處理第10天時轉基因擬南芥對干旱脅迫的響應

與脅迫前相比，干旱脅迫處理第10天時，轉基因株系的上述指標測定值均下降(圖3、表2和表3)，不同類型轉基因擬南芥株系各指標測定值大小的總體趨勢與脅迫前基本一致，且均高于脅迫后的野生型，表明轉基因材料較野生型更耐干旱脅迫。其中PCK類型株系的PEPC和PPDK基因表達量下降幅度較小，PEPC酶活性、PPDK酶活性、凈光合速率以及水分利用效率較野生型分別高48%、46%、149%和70%，綜合表現(xiàn)最優(yōu)，其次是PC類型株系。脅迫處理10 d時，擬南芥已受到嚴重傷害，體內正常代謝活動受到影響，因此植株光合速率下降。

2.3.3 干旱脅迫復水后第5天轉基因擬南芥對干旱脅迫的響應

干旱脅迫處理10 d后再復水第5天時，轉基因材料上述測定指標逐漸接近脅迫前的表現(xiàn)(圖3、表2和表3)，不同類型轉基因擬南芥上述指標測定值大小的總體趨勢與脅迫前基本一致，均高于復水后的野生型，表明轉基因材料遭受脅迫后恢復較快，其中PCK和PC類型株系綜合表現(xiàn)較優(yōu)。

NC：Normal condition;DAD:days after drough;DAR:days after re-watering.*：P<0.05;**：P<0.01.

圖3 干旱脅迫處理條件下轉基因擬南芥的基因表達量

Fig.3 Relative expression level of transgene qPT-PCR in transgenic plants under drought stress conditions

3 討 論

遲 偉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，轉PEPC基因水稻的凈光合速率提高55%，轉PEPC+PPDK基因水稻的凈光合速率高于轉PEPC基因水稻，而轉PPDK和NADP-ME基因水稻的凈光合速率無明顯變化。李 霞等[20]研究認為在C3水稻中要加強C4循環(huán)，PEPC是限速酶。本研究結果表明，在同一水分處理條件下，所有轉玉米C4光合酶基因擬南芥株系的凈光合速率均高于野生型，并以PC和PCK類型株系最好，表明將玉米C4光合酶基因導入C3植物擬南芥中可以提高其光合性能和耐旱性，尤其是ZmPEPC基因的作用十分顯著。

表2 干旱脅迫處理條件下轉基因擬南芥的光合酶活性Table 2 Enzyme activity of transgenic plants under drought stress conditions

表中數(shù)值為轉同一基因型三個株系的平均值±標準差。*：P<0.05；**：P<0.01。表3同。

The date presented here are the means of three replicates(±SD).*：P<0.05；**：P<0.01.DAD：days after drought;DAR:days after re-watering.The same in table 3.

表3 干旱脅迫處理下轉基因擬南芥的凈光合速率和水分利用效率Table 3 Pn and WUE of transgenic plants under drought stress conditions

PC和PCK類型株系光合速率提高可能有以下主要原因：(1)ZmPEPC基因過表達可增加葉片中蘋果酸的濃度，促進葉片氣孔開放[21]，而植物光合速率與氣孔導度呈正相關[15，22]，因此轉基因擬南芥能保持較高的光合效率。(2)在本研究中，PC和PCK類型株系的PEPC酶活性顯著提高，而植株的光合速率與PEPC酶活性呈正相關[23]。此外轉基因擬南芥的其他C4光合酶也可被誘導表達[24]，這是生化反應鏈中前饋激活和后饋激活作用的表現(xiàn)，促進了擬南芥的C4循環(huán)[25]，從而光合速率增加。(3)魏愛麗等[26]認為，在干旱條件下C4途徑酶活性可被誘導表達是C3植物對干旱環(huán)境的一種生態(tài)適應機制。在本試驗中，PC和PCK類型株系在嚴重干旱脅迫下的光合優(yōu)勢可能與PEPC基因參與擬南芥對干旱脅迫反應的調節(jié)有關[27]。目前多數(shù)研究結果表明，C4-PEPC基因對C3植物光合作用的改善較C4-PPDK和C4-NADP-ME明顯[16，24]。PEPC酶在整個C4循環(huán)中起著至關重要的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)PCK類型株系的凈光合速率高于PC類型株系的，這可能是由于ZmPEPC和ZmPPDK基因過表達后植株體內PEPC和PPDK的酶活性均顯著增加，對擬南芥體內的C4循環(huán)促進效果更明顯，因此光合速率提高幅度較大。此外，PK類型株系的光合速率高于PKM類型株系的，可能是由于ZmNADP-ME基因過表達后NADP-ME酶活性升高導致葉片中蘋果酸含量下降，保衛(wèi)細胞滲透壓下降，最終導致氣孔關閉[28-29]，進而影響PKM類型株系的光合速率。

目前大量研究表明，干旱脅迫較輕時，植物光合速率降低是由于氣孔關閉所致；而在重度干旱脅迫時，則是非氣孔限制因素在起作用[30]，如干旱脅迫影響到葉肉細胞內的有關代謝[31，32]。在本研究中，干旱脅迫處理5 d時，由于ZmPEPC基因的導入促進了植株氣孔開放，而且短期干旱脅迫處理后，植物會啟動脅迫應激機制來抵御外來影響[33]，轉基因擬南芥的光合速率上升。繼續(xù)干旱脅迫處理，則擬南芥株系的正常生長和代謝受到影響，因此轉基因擬南芥的光合速率下降。

綜合本研究結果，不同類型轉基因材料的上述測定指標總體表現(xiàn)為PCK>PC>PK、PKM>ME。PC和PCK類型株系在非水分脅迫和水分脅迫條件下均表現(xiàn)較優(yōu)，在進行小麥等C3作物轉基因高光效育種時可著重考慮這兩種基因型的利用。

[1] HATCH M D.C4photosynthesis:a unique elend of modified biochemistry,anatomy and ultrastructure[J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA) -ReviewsonBioenergetics,1987,895(2):81.

[2] SUZUKI S,MURAI N,BURNELL J N,etal.Changes in photosynthetic carbon flow in transgenic rice plants that express C4-type phosphoenolpyruvate carboxykinase from Urochloapanicoides [J].PlantPhysiology,2000,124(1):163.

[3] 張慶琛,許為鋼,胡琳,等.玉米C4型全長PEPC基因導入普通小麥的研究[J].麥類作物學報,2010,30(2):194.

ZHANG Q C,XU W G,HU L,etal.Development of transgenic wheat plants with maize C4-specificPEPCgene by particle bombardment[J].JournalofTriticeaeCrops,2010,30(2):194.

[4] OLGA I.KERSHANSKAYA·J A T D S J.Photosynthetic basis for wheat crop improvement:genetic modification of photosynthesis [J].TheAsianandAustralasianJournalofPlantScienceandBiotechnology,2010,4:27.

[5] HU L,LI Y,XU W G,etal.Improvement of the photosynthetic characteristics of transgenic wheat plants by transformation with the maize C4phosphoenolpyruvate carboxylase gene [J].PlantBreeding,2012,131(3):385.

[6] 杜西河,許為鋼,胡 琳,等.轉ZmPEPC與ZmPPDK基因擬南芥對干旱脅迫的反應[J].分子植物育種,2013,11(4):477.

DU X H,XU W G,HU L,etal.Response of maize C4-type PEPC and PPDK transgenicArabidopsisplants to drought stress [J].MolecularPlantBreeding,2013,11(4):477.

[7] ISHIMARU K,ICHIKAWA H,MATSUOKA M,etal.Analysis of a C4maize pyruvate,orthophosphate dikinase expressed in C3transgenicArabidopsisplants [J].PlantScience,1997,129(1):57.

[8] KU M S,AGARIE S,NOMURA M,etal.High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plant [J].NatureBiotechnology,1999,17(1):76.

[9] WANG Y M,XU W G,HU L,etal.Expression of maize gene encoding C4-pyruvate orthophosphate dikinase(PPDK) and C4-phosphoenolpyruvate carboxylase(PEPC) in transgenicArabidopsis[J].PlantMolecularBiologyReporter,2012,30(6):1367.

[10] FUKAYAMA H,MIYAO M.Significant accumulation of C4-specific pyruvate,orthophosphate dikinase in a C3plant,rice [J].PlantPhysiology,1977,127(3):1136.

[11] NA Q,XU W,LIN H,etal.Drought tolerance and proteomics studies of transgenic wheat containing the maize C4phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) gene [J].Protoplasma,2015:1.

[12] 方立鋒,丁在松,趙明.轉ppc基因水稻苗期抗旱特性研究[J].作物學報,2008,34(7):1220.

FANG L F,DING Z S,ZHAO M.Characteristics of drought tolerance inppcoverexpressed rice seedings [J].ActcAgronomicaSinica,2008,34(7):1220.

[13] GU J F,QIU M,YANG J C.Enhanced tolerance to drought in transgenic rice plants overexpressing C4photosynthesis enzymes [J].ActcAgronomicaSinica,2013,1(2):105.

[14] WANG J,LI R.Integration of C4-specificppdkgene of chinochloa to C3upland rice and its photosynthesis characteristics analysis [J].AfricanJournalofBiotechnology,2008,7(6):783.

[15] KU M S B,RANADE U,HSU T P,etal.Photosynthetic performance of transgenic rice plants overexpressing maize C4photosynthesis enzymes [J].StudiesinPlantScience,2000,7(00):193.

[16] 黃雪清,焦德茂,遲偉,等.轉C4光合酶基因水稻的CO2交換和熒光特性[J].植物學報,2002,44(4):405.

HUANG X Q,JIAO D M,CHI W,etal.Characteristics of CO2exchange and chlorophyll fluorescence of transgenic rice with C4genes[J].ActaBotanicaSinica,2002,44(4):405.

[17] 王永霞,杜新華,許為鋼,等.導入外源玉米C4型NADP-ME基因對小麥光合效能的影響[J].作物學報,2016,42(4):600.

WANG Y X,DU X H,XU W G,etal.Photosynthetic charateristics of transgenic wheat expressing maize C4-typeNADP-MEgene [J].ActcAgronomicaSinica,2016,42(4):600.

[18] SAYRE R T,KENNEDY R A.Photosynthetic enzyme activities and Localization in Mollugo verticillata populations differing in the levels of C3and C4cycle operation [J].PlantPhysiology,1979,64(2):293.

[19] 遲 偉,焦德茂,黃雪清,等.轉PEPC基因水稻的光合生理特性[J].植物學報,2001,43(6):657.

CHI W,JIAO D M,HUANG X Q,etal.Photosynthetic characteristics of transgenic rice plants overexpressing maize phosphoenopyruvatecarboxylase[J].ChineseBulletinofBotany,2001,43(6):657.

[20] 李 霞,焦德茂.轉C4光合基因水稻及其在育種中的應用[J].分子植物育種,2005,3(4):550.

LI X,JIAO D M.Transgenic rice overexpressing C4photosynthetic genes and their application in breeding [J].MolecularPlantBreeding,2005,3(4):550.

[21] DING Z S,HUANG S H,ZHOU B Y,etal.Overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase cDNA from C4millet(Seteriaitalica) increase rice photosynthesis and yield under upland condition but not in wetland fields [J].PlantBiotechnologyReports,2013,7(7):155.

[22] 焦德茂,匡廷云,李 霞,等.轉PEPC基因水稻具有初級CO2濃縮機制的生理特點[J].中國科學,2003,33(1):33.

JIAO D M,KUANG T Y,LI X,etal.Physiological characteristics of the primitive CO2concentrating mechanism inPEPCtransgenic rice[J].ScienceinChina,2003,46(4):438.

[23] 李 霞,焦德茂,戴傳超,等.轉育PEPC基因的雜交水稻的光合生理特性[J].作物學報,2001,27(2):137.

LI X,JIAO D M,DAI C C,etal.Photosynthetic characteristics for rice hybrids with transgenicPEPCparent HPTER-01 [J].ActcAgronomicaSinica,2001,27(2):137.

[24] 焦德茂,李 霞,黃雪清,等.轉PEPC基因水稻的光合CO2同化和葉綠素熒光特性[J].科學通報,2001,46(5):414.

JIAO D M,LI X,HUANG X Q,etal.The characteristics of CO2assimilation of photosynthesis and chlorophyll fluorescence in transgenicPEPCrice [J].ChineseScienceBulletin,2001,46(13):1080.

[25] 季本華,朱素琴,焦德茂.轉玉米C4光合酶基因水稻株系中的光合C4微循環(huán)[J].作物學報,2004(6):536.

JI B H,ZHU S Q,JIAO D M.Photosynthetic C4-microcycle in transgenic rice plant lines expressing the maize C4-photosynthetic enzymes[J].ActcAgronomicaSinica,2004(6):536.

[26] 魏愛麗,王志敏,翟志席,等.土壤干旱對小麥旗葉和穗器官C4光合酶活性的影響[J].中國農業(yè)科學,2003,36(5):508.

WEI A L,WANG Z M,ZHAI Z X.etal.Effect of soil drought on C4photosynthesis enzyme activities of flag leaf and ear in wheat[J].ScientiaAgriculturaSinica,2003,36(5):508.

[27] 周寶元,丁在松,趙 明.PEPC過表達可以減輕干旱脅迫對水稻光合的抑制作用[J].作物學報,2011,37(1):112.

ZHOU B Y,DING Z S,ZHAO M.Alleviation of drought stress inhibition on photosynthesis by overexpression ofPEPCgene in rice[J].ActcAgronomicaSinica,2011,37(1):112.

[28] LAPORTE M M,SHEN B,TARCZYNSKI M C.Engineering for drought avoidance:expression of maize NADP-malic enzyme in tobacco results in altered stomatal function[J].JournalofExperimentalBotany,2002,53(369):699.

[29] OUTLAW W H,MANCHESTER J,BROWN P H.High levels of malic enzyme activities inViciafabaL. epidermal tissue [J].PlantPhysiology,1981,68(5):1047.

[30] 張紅萍,?？×x,軒春香,等.干旱脅迫及復水對豌豆葉片脯氨酸和丙二醛含量的影響[J].甘肅農業(yè)大學學報,2008,43(5):50.

ZHANG H P,NIU J Y,XUAN C X,etal.Effect of drought stress and re-watering on content of proline and malondiadehyde in pea leaves [J].JournalofGansuAgriculturalUniversity,2008,43(5):50.

[31] LAWLOR D W.Limitation to photosynthesis in water-stressed leaves:stomata vs metabolism and the role of ATP [J].AnnalsofBotany,2002,89(7):871.

[32] CORNIC G,FRESNEAU C.Photosynthetic carbon reduction and carbon oxidation cycles are the main electron sinks for photosystem II activity during a mild drought [J].AnnalsofBotany,2002,89(6):887.

[33] 季艷林,賴惠玲,鄭茹萍,等.植物澇漬脅迫應激機制研究進展[J].生物技術進展,2016,6(1):1.

JI Y L,LAI H L,ZHENG R P,etal.Progress on plant resistance mechanism to waterlogging stress [J].CurrentBiotechnology,2016,6(1):1.

Effect of Maize C4-specific Photosynthesis Genes on Photosynthesis and Drought Resistance ofArabidopsisthaliana

LEI Mingyue1，2，XU Weigang2，LI Xiaobo2，Zhang Qingchen1,2,WANG Huiwei2，ZHANG Lei2，F(xiàn)ANG Yuhui1，2，LI Yan2，LI Chunxin2

(1.College of Agronomy， Hennan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450002，China; 2.Wheat Research Insitute，Henan Academy of Agricultural Sciences/National Laboratory of Wheat Engineering/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Breeding in central Huang Huai Hai Region，Ministry of Agriculture，Zhengzhou，Henan 450002，China)

The three key C4-specific photosynthesis genes of maize，ZmPEPC，ZmPPDKandZmNADP-ME，hold great promise for increasing photosynthetic rate of C3type plants. To investigate the effects of overexpression of those C4-specific photosynthesis genes on photosynthetic rate and drought tolerance of C3plants，we obtainedArabidopsisthalianaplants overexpressingZmPEPC(phosphoenopyruvate carboxylase)，ZmPPDK(pyruratedikinase)，ZmNADP-ME(NADP-malic enzyme)，ZmPEPC+ZmPPDK，andZmPPDK+ZmNADP-ME,respectively，using agrobacterium mediated transformation. Wild type and transgenicArabidopsisplants were firstly grown under well-water conditions and then under drought stress at flowering stage by stopping watering. Samples were collected at 1 d before water stress，5 d and 10 d after water stress，and 5 d after rewatering to analyze the relative expressions of transgenes，the enzymic activities of PEPC，NADP-ME and PPDK，net Photosynthetic rate(Pn) and water use efficiency(WUE). The results showed that the activities of PEPC and PPDK，Pnand WUE of theZmPEPC+ZmPPDKtransgenic plants were 52%，20%，24% and 55% higher than those of wild-type under normal water condition，respectively. TheZmPEPC+ZmPPDKtransgenic plants had the largest increase in these parameters，except PPDK activity，compared to the plants with other transgenes. Based on the above measured parameters，the performances of the different transgenes can be ranked asZmPEPC+ZmPPDK>ZmPEPC>ZmPPDK，ZmPPDK+ZmNADP-ME>ZmNADP-ME. All the measured parameters in the transgenicArabidopsisleaves increased compared with their non-stressed controls at 5 d of drought stress，and decreased at 10 d of drought stress due to severe damage by drought，but were recovered in various degrees at 5 d after watering restored. Overall，ZmPEPC+ZmPPDKtransgenic plants had the highest increase in these measured parameters under different drought stress conditions，andZmPEPCtransgenic plants were as the second. All transgenicArabidopsisplants with different transgenes showed better drought tolerance than the wild type control.

Arabidopsisthaliana; Drought stress; Transgene; C4-specific photosynthesis gene; Maize

時間：2017-01-03

2016-05-29

2016-07-12

國家自然科學基金項目(31371707); 國家轉基因生物新品種培育科技重大專項(2016ZX08002003)；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(132300410005)；河南省重大科技專項(151100111400);河南省基礎研究項目(132300410005，132300410283)

E-mail：leimingyue18@163.com

許為鋼(E-mail:xuwg1958@163.com)

S58；S311

A

1009-1041(2017)01-0108-08

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170103.1629.030.html