桂安勝，聶迎彬，馬 麗，徐紅軍，李瑞博，劉小芳，孔德真，張曉科，穆培源

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院作物研究所，新疆石河子 832000)

小麥雄性不育系A(chǔ)L18A育性恢復(fù)基因的QTL定位

桂安勝1，聶迎彬2，馬 麗1，徐紅軍2，李瑞博1，劉小芳2，孔德真2，張曉科1，穆培源2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院作物研究所，新疆石河子 832000)

為加快AL型雜交小麥的發(fā)展，以不育系A(chǔ)L18A、恢復(fù)系99AR144-1及二者雜交F2代群體為材料，選用SSR標(biāo)記和分離群體分組分析法進(jìn)行育性恢復(fù)基因的QTL定位。結(jié)果表明，育性恢復(fù)由主效和微效基因共同控制，采用復(fù)合區(qū)間作圖法分析，在1B染色體上檢測(cè)到了1個(gè)主效恢復(fù)基因QTL qRf-1B-1，在5AL染色體上檢測(cè)到了1個(gè)微效QTL qRf-5A-1。 qRf-1B-1位于SSR標(biāo)記Xbarc8與Xgwm413之間，與兩標(biāo)記的遺傳距離分別為0.85 cM和2.00 cM，LOD值為14.06，加性效應(yīng)為18.87，可解釋22.43%的表型變異； qRf-5A-1位于SSR標(biāo)記Xgwm595與Xgwm410之間，與兩標(biāo)記的遺傳距離分別為10.00 cM和0.10 cM，LOD值為3.18，加性效應(yīng)為12.32，可解釋5.44%的表型變異。

小麥；AL型不育系；恢復(fù)基因；QTL

采用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系配制雜交種，是小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑之一。利用三系法配置的小麥AL型雜交種“新冬43號(hào)”已被審定并在生產(chǎn)上推廣[1]。三系雜交小麥成功應(yīng)用的關(guān)鍵之一是要求雜種F1具有高的結(jié)實(shí)率，這一特性受控于恢復(fù)性高的優(yōu)良恢復(fù)系。然而，選育恢復(fù)系相對(duì)常規(guī)育種選育要求更高，既要具備優(yōu)良農(nóng)藝性狀，還應(yīng)包含有相應(yīng)的恢復(fù)基因。通過常規(guī)育種方法選育恢復(fù)系，工作量大，周期長(zhǎng)，選育后代是否含有恢復(fù)基因還需要與不育系測(cè)交以及測(cè)交后代育性觀察才可判定。利用與恢復(fù)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，就可在當(dāng)代完成多份待選材料恢復(fù)基因鑒定，也可進(jìn)行恢復(fù)基因累加，選育高恢復(fù)度的恢復(fù)系。細(xì)胞質(zhì)雄性不育系育性恢復(fù)基因定位，可獲得緊密連鎖分子標(biāo)記，能為雜交小麥的育種和大面積推廣提供基礎(chǔ)。

隨著分子生物學(xué)水平的發(fā)展，利用DNA分子標(biāo)記逐步開展了小麥育性相關(guān)基因的定位，其中，RFLP是最早被運(yùn)用于該類基因定位的分子標(biāo)記。Ma等[2-3]采用RFLP技術(shù)對(duì)T型不育恢復(fù)系R113( Rf3、Rf4)、Primepi和2114( Rf6)的恢復(fù)基因分別進(jìn)行了定位， Rf3基因定位在1BS上，且與標(biāo)記Xcdo442和Xbcd249緊密連鎖， Rf4基因定位在6BS上，且與標(biāo)記Xksug48緊密連鎖，Primepi的恢復(fù)基因定位在5D上，且與Xcdo786緊密連鎖， Rf6基因位在6AS上。隨后，SSR分子標(biāo)記又被廣泛運(yùn)用于育性相關(guān)基因定位分析。Zhou等[4]和Sinha等[5]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)T型雄性不育系的恢復(fù)基因進(jìn)行了定位研究，檢測(cè)到 Rf3和 Rf8分別位于1B和2D染色體上。Song等[6]通過712對(duì)SSR引物篩選，將K型不育系的恢復(fù)基因定位在1B和2A染色體上。Guo等[7]采用分離群體分組分析法(BSA)與SSR相結(jié)合的技術(shù)手段，將337S的不育基因定位于2B和5B染色體上。Xing等[8]利用SSR和AFLP方法分析溫敏不育系BNY-S/蘭考52-24的F2群體，將1個(gè)溫敏基因定位在2B染色體上，命名為 wtms1。Ru等[9]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)溫敏不育系BS20-T/ZN7的162株極端不育和30株可育F2單株進(jìn)行分析，檢測(cè)到不育基因位于2B染色體上，且與標(biāo)記Xgwm403和Xgwm374連鎖。田再民等[10]采用SSR和EST-SSR分析小麥光溫敏核雄性不育系的DH群體，將不育基因定位在1B、2B和3A染色體上。

王世杰等[11]研究表明，小麥AL型雄性不育系能被90%以上的普通小麥品種保持，連續(xù)回交轉(zhuǎn)育成的不育系不育度達(dá)100%，且不育性在不同年份氣候條件下保持穩(wěn)定。Liu等[12]采用SSR分子技術(shù)對(duì)不育系A(chǔ)L18A與恢復(fù)系99AR144-1雜交的F2代分離群體進(jìn)行育性恢復(fù)基因分析，檢測(cè)到2A染色體上的標(biāo)記Xgwm95和1B染色體上的標(biāo)記Xbarc61分別與AL型小麥的2對(duì)恢復(fù)基因連鎖，遺傳距離分別是15 cM和18 cM。因遺傳連鎖距離較遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步標(biāo)記加密驗(yàn)證定位結(jié)果。為此，本研究擬用SSR標(biāo)記和BSA方法對(duì)AL18A×99AR144-1的F2代分離群體進(jìn)行分析，旨在定位不育系A(chǔ)L18A的育性恢復(fù)基因，獲得緊密連鎖標(biāo)記，為加快AL型雜交小麥的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究以不育系A(chǔ)L18A、恢復(fù)系99AR144-1及二者雜交F2代群體(263株)為試驗(yàn)材料。AL18A 是AL 型不育系781A與普通小麥多代回交轉(zhuǎn)育20代而成的穩(wěn)定不育系，在新疆石河子和陜西楊凌兩地均表現(xiàn)完全不育；恢復(fù)系99AR144-1的農(nóng)藝性狀好，且高度散粉，恢復(fù)能力強(qiáng)。種子由新疆農(nóng)墾科學(xué)院作物研究所穆培源研究員提供。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)材料的種植和結(jié)實(shí)率調(diào)查

親本及其F2代群體于2014年種植于陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田中。試驗(yàn)小區(qū)行長(zhǎng)1 m，行距0.25 m，株距0.06 m，栽培管理同當(dāng)?shù)卮筇?。每?行種植父母本各1行作為對(duì)照，控制田間試驗(yàn)誤差。

幼苗期對(duì)親本及F2代單株掛牌編號(hào)及取相應(yīng)單株葉片用于基因組DNA提取。對(duì)所掛牌單株主莖穗開花前進(jìn)行套袋自交，成熟后單株單穗收獲，進(jìn)行室內(nèi)考種，以國(guó)內(nèi)法進(jìn)行單株主莖自交結(jié)實(shí)率計(jì)算。自交結(jié)實(shí)率(%)=有效小穗基部?jī)蓚?cè)小花結(jié)實(shí)數(shù)/(有效小穗數(shù)×2)×100%。

1.2.2 基因組DNA的提取及DNA池的構(gòu)建

采用CTAB法[13]提取小麥葉片基因組DNA，用1×TE稀釋成50 ng·μL-1。參照Michelmore等[14]提出的BSA分析法，根據(jù)F2代單株主莖自交結(jié)實(shí)率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，隨機(jī)選取8株結(jié)實(shí)率大于80%的可育單株DNA等量混合組成可育池(F)，8株結(jié)實(shí)率為0的完全不育單株DNA等量混合組成不育池(S) 。

1.2.3 SSR標(biāo)記分析

參照Somers等[15]和GrainGenes網(wǎng)站(http://wheat.pw.usda.gov/GG3/ )提供的引物序列信息，交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成了分布于小麥21條染色體的1 480對(duì)SSR引物。篩選出在親本間有多態(tài)性的引物，然后將多態(tài)性引物在可育池和不育池中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為10 μL，包括10×PCR Buffer (含 Mg2+) 1 μL、dNTPs(10 mmol·L-1) 0.8 μL、正反向引物(10 μmoL·L-1)各0.5 μL、模板DNA(50 ng·μL-1) 1 μL、TaqDNA聚合酶 (5 U·μL-1) 0.2 μL、ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)在MyCycler Thermal Cycle上進(jìn)行，程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入4 μL上樣緩沖液(98%甲酰胺、10 mmol·L-1EDTA、0.025%溴酚蘭、0.025%二甲苯青，pH 8.0)，95 ℃變性后立即置于冰水混合物上待用，隨后在1×TBE緩沖液中用6%變性聚丙烯酰胺凝膠分離。電泳結(jié)束后，10%醋酸固定20 min，雙蒸水漂洗3次，0.1% AgNO3(含0.15%甲醛)染色10 min，雙蒸水漂洗5～10 s，1.5% NaOH(含0.4%甲醛)顯影至出現(xiàn)清晰條帶，雙蒸水漂洗，記錄和分析檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 連鎖圖譜構(gòu)建與QTL定位

F2群體表型數(shù)據(jù)結(jié)合PCR擴(kuò)增帶型用于遺傳連鎖分析。F2群體單株的擴(kuò)增帶型與母本AL18A相同的記為0，與父本99AR144-1相同的記為2，缺失的記為-1。采用IciMapping V4.0(http://www.isbreeding.net/)軟件計(jì)算標(biāo)記與恢復(fù)基因間的遺傳距離。采用MapDraw V2.1軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。采用復(fù)合區(qū)間作圖法檢測(cè)恢復(fù)基因的QTL，取LOD值2.5為閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及其后代的自交結(jié)實(shí)率

由圖1可知，30株不育系A(chǔ)L18A的自交結(jié)實(shí)率均為0，表現(xiàn)為完全不育；23株恢復(fù)系99AR144-1的平均自交結(jié)實(shí)率為86.4%，不育系與恢復(fù)系之間的結(jié)實(shí)率存在明顯差異。由大田F2代263個(gè)單株套袋自交結(jié)實(shí)率的樣本分布圖來看，F(xiàn)2群體結(jié)實(shí)率表現(xiàn)出數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)，適合進(jìn)行QTL分析。群體結(jié)實(shí)率分布特點(diǎn)呈現(xiàn)偏態(tài)分布，存在可育峰，說明育性恢復(fù)由主效基因控制，同時(shí)也受到微效基因影響，為多基因控制的數(shù)量性狀。

X1=0；0

圖1 AL18A與99AR144-1雜交F2群體自交結(jié)實(shí)率的樣本分布圖

Fig.1 Self seed-setting sample distribution of F2population from a cross between AL18A and 99AR144-1

2.2 BSA法篩選恢復(fù)基因連鎖的分子標(biāo)記

首先用分布于小麥21條染色體的1 480對(duì)SSR引物在親本間進(jìn)行初篩，其中560對(duì)出現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)性為37.8%，對(duì)出現(xiàn)多態(tài)性的引物在BSA池中作進(jìn)一步篩選，只有位于1BS染色體上的兩個(gè)標(biāo)記Xbarc8、Xgwm413在F池與S池中有多態(tài)性(圖2)，表明1BS染色體上SSR標(biāo)記Xbarc8與Xgwm413周圍存在育性恢復(fù)基因。

Liu等[12]在1B和2A染色體上定位到不育系A(chǔ)L18A的恢復(fù)基因，而本研究只在1B染色體上篩選到雙親和池間有多態(tài)性的SSR引物。為此，又選用T型、K型等雄性不育系育性恢復(fù)基因所在1A、2A、4B、5A、6B、7B的染色體區(qū)段且在親本AL18A和99AR144-1間有穩(wěn)定差異的SSR引物，進(jìn)行F2群體局部連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL分析，尋找其他恢復(fù)基因的位置。

P1：99AR144-1；P2：AL18A；F：可育池；S：不育池；1～8：部分F2單株。

P1:99AR144-1; P2: AL18A; F:Fertile pool; S:Sterile pool;1-8:Part of individuals from F2population.

圖2 SSR標(biāo)記Xbarc8、Xgwm413在雙親、可育與不育池及部分F2單株中的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 PCR amplification of SSR markers Xbarc8 and Xgwm413 in parents,bulks,and partial F2individuals

2.3 F2群體局部遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL定位

構(gòu)建的染色體1A、1B、2A、4B、5A、6B、7B局部遺傳連鎖圖譜覆蓋了小麥基因組136.49 cM，標(biāo)記間平均遺傳距離為6.20 cM(小于15～20 cM)，符合小麥Q(jìng)TL定位的必要條件[16]。

采用IciMapping V4.0軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法，對(duì)不育系A(chǔ)L18A育性恢復(fù)基因進(jìn)行定位分析。在1BS和5AL染色體區(qū)段上，分別發(fā)現(xiàn)1個(gè)與恢復(fù)基因相關(guān)的QTL位點(diǎn)(圖3)。1B染色體上的位點(diǎn)暫命名為 qRf-1B-1，位于SSR標(biāo)記Xbarc8與Xgwm413之間，與Xgwm413和Xbarc8的遺傳距離分別為2.00 cM和0.85 cM，LOD值為14.06，加性效應(yīng)為18.87，對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率為22.43%，為1個(gè)主效QTL位點(diǎn)。5A染色體上的QTL暫命名為 qRf-5A-1，位于SSR 標(biāo)記Xgwm595與Xgwm410之間，與Xgwm595和Xgwm410的遺傳距離分別為10.00 cM和0.10 cM，LOD值為3.18，加性效應(yīng)為12.32，對(duì)表型變異的貢獻(xiàn)率為5.44%，為1個(gè)微效的QTL位點(diǎn)。由于以上得到的主效和微效QTL位點(diǎn)均表現(xiàn)為正加性效應(yīng)，說明這2個(gè)QTL位點(diǎn)的增效等位基因來源于恢復(fù)系99AR144-1。

黑色實(shí)心方框表示恢復(fù)基因的QTL位置。

Black solid box indicated the location of QTL for restorer genes.

圖3 F2群體局部遺傳連鎖圖譜及恢復(fù)基因的QTL位置

Fig.3 Genetic linkage map of F2population and the QTL positions of the restorer genes

3 討 論

3.1 BSA與QTL分析方法的結(jié)合應(yīng)用

作物育性具有典型的數(shù)量性狀特點(diǎn)，后代呈連續(xù)性分布，很多定位研究者人為劃分和確定分離群體中各單株基因型，具有一定的主觀性和隨意性，影響基因定位的準(zhǔn)確性。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，采用QTL分析相關(guān)軟件可直接將育性表型數(shù)據(jù)與遺傳圖譜上各個(gè)分子標(biāo)記區(qū)間的可能位置分別進(jìn)行檢測(cè)，從中篩選出一個(gè)最恰當(dāng)?shù)腝TL位置，結(jié)果更加客觀公正。鄭建敏等[17]以組合SCT-1×B2183的F2群體為材料，結(jié)合QTL分析和BSA方法，找到2個(gè)主效育性基因，分別位于2B和5D上。池慧芳[18]利用BSA和SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)光溫敏不育系BS210/O201構(gòu)建的DH系進(jìn)行分析，將育性主效QTL分別定位在2A、2B和3A染色體上。張立平等[19]以光溫敏不育系BS20×Fu3的DH群體為材料，綜合BSA和QTL分析結(jié)果，將育性QTL定位在7D和2B染色體上。本研究同樣利用BSA與QTL相結(jié)合的方法在1BS染色體上定位到1個(gè)主效恢復(fù)基因。由此看出，采用QTL與BSA法相結(jié)合的技術(shù)可以更加快速準(zhǔn)確定位到數(shù)量性狀的主效基因位點(diǎn)，可以省時(shí)省力。

3.2 小麥育性恢復(fù)基因的染色體分布

恢復(fù)基因的遺傳研究對(duì)恢復(fù)系選育具有重要的意義。已在小麥1A、1B、4A、4B、5A、5D、6A、6B、6D、7B和7D染色體上發(fā)現(xiàn)了11個(gè)分別來自提莫菲維小麥、普通小麥以及其野生近緣種T型不育系的恢復(fù)基因不同主效 Rf基因座 ( Rf1～Rf11)，表明恢復(fù)基因分布范圍廣且復(fù)雜。張 萃等[20]利用SSR標(biāo)記在T型不育系75-3369A×恢復(fù)系7269-10的F2群體中進(jìn)行篩選，將 Rf1和 Rf3分別定位于染色體1AS和1BS上，其中恢復(fù)基因 Rf1與SSR標(biāo)記Xgwm136的遺傳距離為6.7 cM，恢復(fù)基因 Rf3與SSR標(biāo)記Xgwm550的遺傳距離為5.1 cM。劉保申等[21]采用79對(duì)SSR標(biāo)記引物對(duì)(K冀5418A//911289/LK783)的三交F1分離群體進(jìn)行多態(tài)性分析，找到1BS上與K型育性恢復(fù)基因連鎖的標(biāo)記Xgwm11、Xgwm18 和 Xgwm273。周菊紅等[16]以YM型溫敏雄性不育系A(chǔ)TM3314與恢復(fù)系中國(guó)春組配的F2代群體為作圖群體，構(gòu)建了1個(gè)包含5對(duì)標(biāo)記的1BS局部遺傳連鎖圖譜，并結(jié)合F2代個(gè)體的育性調(diào)查，采用復(fù)合區(qū)間作圖法在1BS染色體上檢測(cè)到不育基因的1個(gè)主效QTL位點(diǎn)，位于標(biāo)記Xgwm18與Xwmc406之間，距兩標(biāo)記的遺傳距離分別為6.0 cM和4.6 cM，可解釋表型變異的23.91%。董普輝等[22]找到了1B染色體上與育性恢復(fù)基因 Rf3遺傳距離連鎖的標(biāo)記Xbarc8和Xgwm18。郭艷萍等[23]對(duì)粘性雄性不育系育性恢復(fù)基因進(jìn)行定位，經(jīng)過分離群體驗(yàn)證表明，恢復(fù)基因位于1BS染色體上，4對(duì)SSR標(biāo)記及恢復(fù)基因之間的順序依次為Xwmc406、 Rfv1、Xbarc8、Xwmc611、Xgwm273。本研究同樣表明，不育系A(chǔ)L18A的育性恢復(fù)基因位于1BS染色體上，并且與Xbarc8、Xgwm413緊密連鎖，推斷位于1BS2-1.06區(qū)段，與T型不育系、粘型不育系有1個(gè)相同的連鎖標(biāo)記Xbarc8[20-21]，推測(cè)染色體1BS這一區(qū)段上有成簇存在的恢復(fù)基因。本實(shí)驗(yàn)在2A染色體上沒有檢測(cè)到與育性恢復(fù)基因相關(guān)的QTL位點(diǎn)，可能跟該染色體上進(jìn)行群體擴(kuò)增的SSR標(biāo)記密度不夠大有關(guān)，或者Liu等[12]在2A染色體上定位到的恢復(fù)基因是個(gè)微效基因，在不同環(huán)境和不同年份具有不穩(wěn)定性。另外，本研究在5A染色體長(zhǎng)臂上定位到1個(gè)微效QTL，Zhou等[4]研究也表明T型不育系的5A染色體上有1個(gè)影響育性的微效QTL，是否為同1個(gè)QTL有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究只進(jìn)行了局部連鎖圖的繪制和QTL分析，且未在繪制的2A染色體上找到主效基因，還需要篩選更多引物或者全基因組掃描檢測(cè)多年種植群體分析，確定主效恢復(fù)基因的個(gè)數(shù)及位置。本研究獲得位于1B染色體上2個(gè)緊密連鎖的共顯性SSR標(biāo)記，可以應(yīng)用于AL型三系雜交小麥分子標(biāo)記輔助選擇育種。

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Mapping QTLs of Fertility Restoring Genes for AL-type Male Sterility Line AL18A in Wheat

GUI Ansheng1,NIE Yingbin2,MA Li1,XU Hongjun2,LI Ruibo1, LIU Xiaofang2,KONG Dezhen2,ZHANG Xiaoke1,MU Peiyuan2

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Institute of Crop Research,Xinjiang Academy of Agri-Reclamation Sciences,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

In order to promote the development of AL-type hybrid wheat,the fertility QTLs in the F2population derived from a cross between AL18A and 99AR144-1 were mapped by using SSR markers and bulked segregation analysis. The results showed that the fertility was controlled by the major and minor genes. QTLs were detected using composite interval mapping method. One major QTL and one minor QTL were detected,which were designated as qRf-1B-1 and qRf-5A-1,respectively. The QTL qRf-1B-1 was located between the SSR markers Xbarc8 and Xgwm413 on short arm of chromosome 1B with genetic distances of 0.85 cM and 2.00 cM,respectively. The LOD value for this locus was 14.06,and the gene effect was 18.87 for additive effect. This QTL explained 22.43% of the phenotypic variation. The QTL qRf-5A-1 was mapped on long arm of chromosome 5A between markers Xgwm595 and Xgwm410 with genetic distances of 10.00 cM and 0.10 cM,respectively.The LOD value of this QTL was 3.18. This locus had additive effect of 12.32,and explained 5.44% of the phenotypic variation.

Wheat; AL-type male sterile lines; Restorer genes; QTL

時(shí)間：2017-01-03

2016-08-16

2016-12-09

新疆兵團(tuán)十二五種質(zhì)資源專項(xiàng)(2012BB048)；兵團(tuán)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目(2015AC001)；兵團(tuán)十三五小麥育種攻關(guān)項(xiàng)目(2016AC027)； 西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項(xiàng)目

E-mail：xinong2109@163.com

張曉科(E-mail:zhangxiaoke66@126.com)；穆培源(E-mail:mupy@sohu.com)

S512.1；S334

A

1009-1041(2017)01-0001-06

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