李美玲，孫愛清，楊 敏，張杰道，王振林，陳蕾太，陳路路，馬雪麗，尹燕枰

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018)

小麥干熱風(fēng)抗性鑒定及熱脅迫相關(guān)基因TaHSPs的表達(dá)分析

李美玲，孫愛清，楊 敏，張杰道，王振林，陳蕾太，陳路路，馬雪麗，尹燕枰

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018)

為鑒定黃淮麥區(qū)小麥品種干熱風(fēng)抗性以及不同抗性品種熱激蛋白(TaHSPs)基因的表達(dá)差異，以98個小麥品種為試驗(yàn)材料，于花后10～20 d進(jìn)行人工模擬干熱風(fēng)處理，通過測定小麥不同生長時期的葉綠素含量、收獲后的千粒重與籽粒品質(zhì)，評價不同品種干熱風(fēng)抗性；對篩選出的干熱風(fēng)抗性不同的品種在出苗15 d進(jìn)行熱脅迫處理，通過熒光定量PCR測定熱脅迫0～4.5 h內(nèi)TaHSPs基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，干熱風(fēng)處理后，供試小麥品種旗葉的葉綠素含量均降低，高抗干熱風(fēng)品種降幅較小，熱敏感型品種降幅較大；供試小麥品種的千粒重均降低。山農(nóng)23號等3個品種達(dá)到高、中抗干熱風(fēng)等級，且抗性比較穩(wěn)定，師欒02-1為熱敏感型品種。干熱風(fēng)處理后籽粒蛋白質(zhì)含量升高，總淀粉含量降低，抗干熱風(fēng)小麥品種總淀粉相對含量降幅較小。不同小麥品種幼苗在熱脅迫0～4.5 h期間，TaHSPs基因表達(dá)量均為拋物線趨勢，抗干熱風(fēng)品種在熱脅迫1 h時 TaHSP16.9基因表達(dá)上調(diào)幅度大于熱敏感型品種。對于 TaHSP17.8基因，抗干熱風(fēng)品種在熱脅迫期間，上調(diào)表達(dá)反應(yīng)時間均早于熱敏感型品種；在熱脅迫0.5 h時，山農(nóng)23號、周麥18與泰山9818三個抗干熱風(fēng)品種基因表達(dá)均上調(diào)至590倍以上，而師欒02-1與濟(jì)南17號的上調(diào)幅度在300倍以下。對于 TaHSP23.6基因，山農(nóng)23號的上調(diào)表達(dá)峰值遠(yuǎn)高于其他品種。對于 TaHSP26.6基因，熱敏感型品種在熱脅迫后期的上調(diào)倍數(shù)高于抗干熱風(fēng)品種，師欒02-1與濟(jì)南17號兩個熱敏感型品種在熱脅迫4.5 h時上調(diào)幅度均在4 000倍以上，而抗干熱風(fēng)品種山農(nóng)23號、周麥18與泰山9818上調(diào)幅度均在3 000倍以下。

小麥；干熱風(fēng)；千粒重；抗逆指數(shù)；熱激蛋白

干熱風(fēng)是中國北方麥區(qū)的主要?dú)庀鬄?zāi)害之一，發(fā)生在每年5月中下旬到6月初的高溫少雨天氣，此時正值小麥灌漿期，高溫低濕使得籽粒灌漿期縮短，造成小麥產(chǎn)量、品質(zhì)嚴(yán)重下降。高溫對小麥產(chǎn)量和穗粒數(shù)有顯著影響[1]，對籽粒蛋白質(zhì)的影響也明顯高于水分、干旱等其他脅迫對蛋白質(zhì)的影響[2-3]。高溫主要通過影響小麥淀粉的形成而影響其品質(zhì)，蛋白質(zhì)相對含量的提高也與淀粉合成減少有關(guān)[4-6]。劉 萍等[4]研究表明，灌漿期溫度超過30 ℃，小麥淀粉的形成受到抑制，且在花后25～27 d受影響程度最大。李永庚等[5]研究表明，灌漿后期高溫會提高小麥蛋白質(zhì)的含量，主要原因是籽粒淀粉積累減少。

防御干熱風(fēng)的關(guān)鍵在于選用適宜當(dāng)?shù)夭シN的抗干熱風(fēng)品種，因此，鑒定、篩選抗干熱風(fēng)小麥品種、研究其抗性相關(guān)指標(biāo)具有重要意義。儀小梅等[7]于2011-2013年以旗葉功能期抗逆指數(shù)和千粒重抗逆指數(shù)為鑒定指標(biāo)，對黃淮麥區(qū)部分小麥品種進(jìn)行了干熱風(fēng)抗性鑒定，篩選出一批干熱風(fēng)抗性好的品種。有研究表明，葉綠素是評價植物抗逆境脅迫、尤其是熱脅迫的一個關(guān)鍵性指標(biāo)[8-10]。Kumar等[11]認(rèn)為，從分子生物學(xué)角度研究小麥抗性，是當(dāng)前研究小麥抵御高溫危害的趨勢。不同基因型小麥的耐熱性不同，可能與熱激蛋白的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄因子以及其他相關(guān)基因有關(guān)[12]。Miller等[13]研究表明，熱激蛋白可以通過提高植物的光合效率、改變同化物的分配、提高水分和營養(yǎng)成分的利用效率、增強(qiáng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性等生理作用提高植物體應(yīng)對高溫脅迫的能力[14]。在熱激蛋白中，12～45 kD小分子量熱激蛋白種類最豐富，且在植物生長的各個階段都有分布，植物在遭遇高溫時，其表達(dá)量會在短時間內(nèi)異常升高，是植物耐高溫脅迫的關(guān)鍵[15-16]。郭秀林等[17]研究表明，耐熱小麥品種受高溫脅迫后會激發(fā)更強(qiáng)的抗性基因表達(dá)。Lee等[18]發(fā)現(xiàn)， EsHSP16.9基因表達(dá)量升高可以提高野生黑麥的抗逆性。Abu-Romman[19]研究發(fā)現(xiàn)， TdHSP23.5 與 TdHSP26.5基因在高抗性小麥品種中表達(dá)量高于低抗品種。上述研究主要涉及高溫對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)或?qū)π←溒贩N某個熱激蛋白的影響，而在田間模擬干熱風(fēng)脅迫鑒定小麥品種的干熱風(fēng)抗性，并利用多個熱抗性不同的品種同時分析多個熱激蛋白表達(dá)的報道較少。本研究在儀小梅等[7]研究的基礎(chǔ)上，田間模擬干熱風(fēng)脅迫，根據(jù)傳統(tǒng)指標(biāo)對黃淮麥區(qū)小麥品種干熱風(fēng)抗性進(jìn)行鑒定，并利用分子生物學(xué)方法研究干熱風(fēng)抗性不同的多個小麥品種的小分子熱激蛋白基因(TaHSPs)的表達(dá)差異，分析小麥干熱風(fēng)抗性與TaHSPs基因表達(dá)的關(guān)系，以期為小麥品種的合理布局和灌漿期小麥干熱風(fēng)抗性鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為98個小麥品種，分別于2014、2015兩年進(jìn)行鑒定，部分品種在兩年內(nèi)均有鑒定，詳情見表1。

表1 供試小麥品種Table 1 Wheat cultivars tested in this study

1～10：兩年重復(fù)鑒定品種；11～60：2014年鑒定品種；61～98：2015年鑒定品種。

1-10:Wheat cultivars with repetitive identification in two years; 11-60:Wheat cultivars identified in 2014; 61-98:Wheat cultivars identified in 2015.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

灌漿期干熱風(fēng)處理試驗(yàn)于2013-2014和2014-2015兩個小麥生長季在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)試驗(yàn)站完成。試驗(yàn)采用裂區(qū)設(shè)計(jì)，主區(qū)為干熱風(fēng)處理，副區(qū)為品種，以正常生長為對照；3次重復(fù)。于小麥花后10 d進(jìn)行人工模擬干熱風(fēng)處理，處理時間為每天9:00～16:00，通過人工氣候室中智能控溫、控濕系統(tǒng)控制溫、濕度，溫度低于38 ℃系統(tǒng)自動加溫，溫度高于40 ℃時，手動開窗散熱，連續(xù)10 d進(jìn)行模擬干熱風(fēng)處理。期間采用Davis氣象儀記錄溫、濕度等氣象數(shù)據(jù)。

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取小麥品種周麥18、山農(nóng)23號、濰麥9903、魯麥23號、藁城8901、滄麥6003、師欒02-1及濟(jì)南17號用于灌漿期干熱風(fēng)處理期間葉綠素的測定。

山農(nóng)23號、周麥18、泰山9818、師欒02-1及濟(jì)南17號用于苗期高溫誘導(dǎo)相關(guān)基因TaHSPs的表達(dá)測定。苗期TaHSPs基因的表達(dá)測定于2015年9月18日至2015年10月6日在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選取飽滿一致的種子，點(diǎn)播于穴盤的基質(zhì)中，待幼苗在室外長至10 d后，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。光暗比14/10，溫度22/17 ℃，相對濕度為60%，培養(yǎng)5 d后分別置于38 ℃和25 ℃培養(yǎng)箱，分別于處理0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.5、4.5 h后剪取小麥葉片于2 mL離心管中，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用。3次重復(fù)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 葉綠素和千粒重測定

葉綠素含量測定：在小麥抽穗期選取長勢一致的穗子掛牌標(biāo)記，每個品種標(biāo)記20個單莖，利用SPAD 502葉綠素儀測定小麥干熱風(fēng)處理前、中、后期旗葉的SPAD值。

千粒重測定：選用百粒法測千粒重。

1.3.2 小麥品種抗性評定

采用儀小梅等[7]提出的千粒重抗逆指數(shù)評價小麥干熱風(fēng)抗性，抗逆指數(shù)≥100為高抗干熱風(fēng)品種(HR)，90～99之間為中抗干熱風(fēng)品種(R)，80～89之間為低抗干熱風(fēng)品種(LR)，小于80為敏感干熱風(fēng)品種(S)。

1.3.3 品質(zhì)性狀的測定

用近紅外谷物分析儀測定不同小麥品種籽粒淀粉、蛋白質(zhì)含量，3次重復(fù)。

1.3.4 基因表達(dá)量的測定

采用熒光定量PCR方法測定1.2中于-80 ℃保存小麥葉片的小分子熱激蛋白基因 TaHSP16.9、 TaHSP17.8、 TaHSP23.6、 TaHSP26.6的表達(dá)量。擴(kuò)增體系為20 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各0.4 μL，10 μL 2×SYBR，0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL稀釋后的cDNA，用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s,60 ℃ 30 s；75 ℃ 34 s，40個循環(huán)。RNA的提取按照RNAiso Plus C Takara說明書進(jìn)行。用紫外分光光度計(jì)測量RNA濃度與純度；用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性。RNA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)與熒光定量試劑盒(RR420A)均購自大連寶生物工程有限公司。所用引物見表2，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖，用DPS v7.05進(jìn)行差異顯著性分析。

表2 小分子熱激蛋白基因表達(dá)分析所用引物Table 2 Primers used in the expression analysis of TaHSPs gene

2 結(jié)果與分析

2.1 干熱風(fēng)對小麥旗葉SPAD值的影響

由圖1可知，小麥灌漿期經(jīng)干熱風(fēng)處理后，不同抗性品種旗葉的SPAD值均有不同程度下降，處理前期下降緩慢，后期下降幅度較大；藁城8901、滄麥6003、師欒02-1、濟(jì)南17號4個熱敏感型品種葉綠素含量下降幅度較大，在熱脅迫10 d后SPAD值低于周麥18、山農(nóng)23號、濰麥9903、魯麥23號4個抗干熱風(fēng)品種。其中，干熱風(fēng)抗性強(qiáng)的山農(nóng)23號旗葉的SPAD值大于50，降低幅度最小。

Gaocheng 8901:藁城8901;Cangmai 6003：滄麥6003；Shiluan 02-1：師欒02-1；Jinan 17：濟(jì)南17號;Zhoumai 18:周麥18；Shannong 23：山農(nóng)23號；Weimai 9903：濰麥9903；Lumai 23：魯麥23號。

圖1 8個小麥品種經(jīng)干熱風(fēng)處理不同時期后旗葉的葉綠素含量

DH:干熱風(fēng)處理；CK：對照；HR:高抗干熱風(fēng)；R:中抗干熱風(fēng)；LR:低抗干熱風(fēng)；S:干熱風(fēng)敏感型。同一品種數(shù)據(jù)后不同字母表示處理與對照在5%水平下差異顯著。表4至表8同。

DH:Dry-hot wind treatment; CK:Control;TKW：Thousand kernal weight;AITKW:Adversity index of TKW;HR:High resistant to dry-hot wind; R:Resistant to dry-hot wind; LR:Low resistant to dry-hot wind; S:Sensitive to dry-hot wind. Different letters following data of the same variety mean significant difference at 5% level between dry-hot wind stress and CK. The same in table 4-8.

2.2 干熱風(fēng)對小麥千粒重的影響

由表3、表4可知，98個小麥品種經(jīng)干熱風(fēng)處理后，千粒重均有不同程度下降。2014年的運(yùn)旱2129、京冬8號等4個品種與2015年的山農(nóng)23號、豐德存麥1號等5個品種經(jīng)干熱風(fēng)處理后，千粒重平均下降6 g左右，抗逆指數(shù)達(dá)到100%以上，屬高抗干熱風(fēng)品種；2014年的濟(jì)寧16、濰麥9903等8個小麥品種與2015年的周麥18、豫農(nóng)211等8個小麥品種千粒重平均下降7.6 g左右，抗逆指數(shù)達(dá)到90%以上，屬中抗干熱風(fēng)品種。2014年的邯6172、魯原502等16個小麥品種與2015年的鑫289、冀5265等13個小麥品種千粒重平均下降8 g左右，抗逆指數(shù)大于80%，為低抗干熱風(fēng)品種。2014年的洛麥21號與濟(jì)核916等32個小麥品種與2015年的魯麥15、中育12等22個品種千粒重平均下降10 g以上，抗逆指數(shù)均小于80%，為熱敏感型品種，占到供試品種的二分之一。

共10個品種在2014與2015年均有鑒定，其中山農(nóng)23號、運(yùn)旱2129與周麥18三個品種在兩年抗性鑒定中的抗逆指數(shù)均達(dá)到90%以上，抗性比較穩(wěn)定，屬于抗干熱風(fēng)品種；冀5265、魯麥23號、滄麥119、濟(jì)寧16號與中優(yōu)9507五個品種在兩年抗性鑒定中，抗性表現(xiàn)不穩(wěn)定，2014年表現(xiàn)為中抗與高抗干熱風(fēng)，2015年表現(xiàn)為低抗干熱風(fēng)；2014年篩選出的熱敏感型小麥品種師欒02-1，在2015年的重復(fù)鑒定中，抗逆指數(shù)在70%以下，抗性表現(xiàn)仍比較差。

表4 2015年鑒定小麥品種的千粒重及其抗逆指數(shù)與抗性等級Table 4 Classification of wheat cultivars in 2015 based on adversity resistance index of 1 000-kernel weight

2.3 干熱風(fēng)對小麥品質(zhì)的影響

2.3.1 干熱風(fēng)對蛋白質(zhì)含量的影響

表5、表6顯示，98個小麥品種中，除2014年鑒定的中優(yōu)9507、魯麥23號2個品種和2015年鑒定的山農(nóng)23號等6個品種，其余品種的蛋白質(zhì)含量經(jīng)干熱風(fēng)處理后均升高。2014年鑒定品種中(表5)，蛋白質(zhì)含量增幅在-1.73%～26.67%之間，其中，中優(yōu)9507蛋白質(zhì)含量變化最小，僅比對照降低0.25%，而豫麥34變化幅度最大，在干熱風(fēng)處理后，蛋白質(zhì)含量升高26.67%。2015年鑒定品種中(表6)，蛋白質(zhì)含量變化幅度在-11.43%～19.64%之間，其中，滄麥119變化幅度最小，蛋白質(zhì)相對含量僅比對照高0.64%，而菏麥17變化幅度最大，處理后升高19.64%。

蛋白質(zhì)含量的增幅與干熱風(fēng)抗性等級存在一定關(guān)系，2014年鑒定的小麥品種中(表5)，高抗小麥品種(HR)經(jīng)干熱風(fēng)處理后，蛋白質(zhì)含量增幅均在10%以下，而大部分熱敏感型品種(S)蛋白質(zhì)含量增幅均15%以上，甚至高于20%。表6顯示，2015年鑒定的小麥品種中，高抗干熱風(fēng)品種(HR)的蛋白質(zhì)含量增幅均在10%以下，同樣，大部分的熱敏感型品種(S)蛋白質(zhì)含量增幅在15%以上。高抗干熱風(fēng)品種經(jīng)干熱風(fēng)處理后蛋白質(zhì)含量升高幅度顯著低于熱敏感型品種(P<0.05)。對兩年鑒定小麥品種的抗逆指數(shù)與蛋白質(zhì)含量增幅分別進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，2014年、2015年鑒定品種的相關(guān)系數(shù)分別為-0.681與-0.659(P≤0.01)，均表現(xiàn)為極顯著負(fù)相關(guān)。

表5 2014年鑒定小麥品種的蛋白質(zhì)含量Table 5 Protein content of wheat cultivars identified in 2014 %

表6 2015年鑒定小麥品種的蛋白質(zhì)含量Table 6 Protein content of wheat cultivars identified in 2015 %

表7 2014年鑒定小麥品種的淀粉含量Table 7 Starch content of wheat cultivars identified in 2014 %

2.3.2 干熱風(fēng)對淀粉含量的影響

由表7、表8可知，2014年干熱風(fēng)處理后，小麥籽粒淀粉含量均降低，降幅在0.01%～4.42%之間，其中，高抗(HR)與中抗(R)干熱風(fēng)品種淀粉含量降幅在0.01%～1.93%之間，而熱敏感型品種(S)在0.09%～4.42%之間；2015年鑒定小麥品種中，除山農(nóng)23號等8個品種在干熱風(fēng)處理后淀粉含量不降反升，其余品種籽粒淀粉含量均降低，降幅為-2.47%～4.41%，其中高抗干熱風(fēng)品種(HR)的降幅小于2.5%，而大部分熱敏感型品種降幅大于2.5%，豫麥34等品種的降幅高達(dá)4%。說明干熱風(fēng)處理后小麥籽粒淀粉含量的降幅與品種的干熱風(fēng)抗性關(guān)系密切，干熱風(fēng)抗性越強(qiáng)，干熱風(fēng)處理后淀粉含量降幅越小。對兩年鑒定小麥品種的抗逆指數(shù)與淀粉含量降幅分別進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，2014年、2015年的相關(guān)系數(shù)分別為-0.689與-0.651(P≤0.01)，均為極顯著負(fù)相關(guān)。

2.4 高溫誘導(dǎo)對不同抗性小麥品種小分子熱激蛋白基因表達(dá)的影響

2.4.1 高溫誘導(dǎo)對 TaHSP16.9基因表達(dá)的影響

圖2顯示，5個小麥品種在苗期經(jīng)高溫38 ℃處理0～4.5 h， TaHSP16.9基因表達(dá)水平均迅速上調(diào)，泰山9818的上調(diào)倍數(shù)高達(dá)6 000。除周麥18，其余4個品種基因表達(dá)上調(diào)倍數(shù)呈先上升后下降趨勢，在高溫誘導(dǎo)1.5 h時達(dá)到峰值，隨后開始下降。在熱脅迫過程中，山農(nóng)23號、周麥18與泰山9818三個抗干熱風(fēng)品種的 TaHSP16.9基因表達(dá)上調(diào)倍數(shù)變化幅度較大，而師欒02-1與濟(jì)南17號兩個熱敏感型品種的 TaHSP16.9基因表達(dá)變化幅度較平緩，不同時間之間差異較小。

表8 2015年鑒定小麥品種的淀粉含量Table 8 Starch content of wheat cultivars identified in 2015 %

2.4.2 高溫誘導(dǎo)對 TaHSP17.8基因表達(dá)的影響

圖3顯示，5個干熱風(fēng)抗性不同的小麥品種在38 ℃高溫誘導(dǎo)過程中， TaHSP17.8基因表達(dá)均迅速上調(diào)，在0.5～1 h內(nèi)基因上調(diào)至峰值，隨后開始下降，基因表達(dá)上調(diào)倍數(shù)呈先上升后下降趨勢，在2.5 h之后，基因上調(diào)倍數(shù)均趨于穩(wěn)定至最低水平。山農(nóng)23號、周麥18與泰山9818三個抗干熱風(fēng)品種 TaHSP17.8基因?qū)Ω邷氐姆磻?yīng)迅速，熱脅迫0.5 h后，上調(diào)倍數(shù)分別迅速上升至1 212、1 010與598，而師欒02-1與濟(jì)南17號兩個熱敏感型品種 TaHSP17.8基因?qū)Ω邷胤磻?yīng)遲緩，熱脅迫0.5 h時，基因表達(dá)僅上調(diào)至304與273倍。

SL02-1：師欒02-1;JN17:濟(jì)南17;SN23:山農(nóng)23號;ZM18:周麥18號;TS 9818:泰山9818。下同。

SL02-1：Shiluan 02-1;JN17:Jinan 17;SN23:Shannong 23;ZM18:Zhoumai 18;TS 9818:Taishan 9818.The same in Fig.3-5.

圖2 抗、感干熱風(fēng)小麥品種熱脅迫不同時間 TaHSP16.9基因的表達(dá)差異

Fig.2 Differential expression of TaHSP16.9 in both resistant and susceptible wheat cultivars under high temperature stress

圖3 抗、感干熱風(fēng)小麥品種熱脅迫不同時間 TaHSP17.8基因的表達(dá)差異

圖4 抗、感干熱風(fēng)小麥品種熱脅迫不同時間 TaHSP23.6基因的表達(dá)差異

2.4.3 高溫誘導(dǎo)對 TaHSP23.6基因表達(dá)的影響

圖4顯示，5個干熱風(fēng)抗性不同的小麥品種在高溫38 ℃處理0～4.5 h內(nèi)， TaHSP23.6基因表達(dá)上調(diào)倍數(shù)呈先上升后下降趨勢，基因表達(dá)上調(diào)峰值在熱脅迫0.5 h左右出現(xiàn)，隨后開始下降，在熱脅迫2.5 h之后，基因表達(dá)上調(diào)倍數(shù)趨于穩(wěn)定至最低水平。5個品種中，山農(nóng)23號基因表達(dá)上調(diào)峰值最大，接近400倍，其余品種基因表達(dá)上調(diào)峰值相對較小，均在100倍以下。

2.4.4 高溫誘導(dǎo)對 TaHSP26.6基因表達(dá)的影響

圖5顯示，5個干熱風(fēng)抗性不同的小麥品種在高溫38 ℃處理0～4.5 h內(nèi)， TaHSP26.6基因表達(dá)上調(diào)倍數(shù)為先上升后下降的趨勢，熱脅迫至1.5～2.5 h出現(xiàn)峰值，較其他小分子熱激蛋白基因出現(xiàn)晚，隨后開始下降。5個品種中，山農(nóng)23號與周麥18上調(diào)表達(dá)峰值最大，高至10 000倍以上，師欒02-1上調(diào)表達(dá)峰值最小，為6 000倍左右；此外，師欒02-1與濟(jì)南17號兩個熱敏感型品種在熱脅迫4.5 h時基因表達(dá)分別上調(diào)至5 829與4 163倍，而山農(nóng)23號、周麥18與泰山9818三個抗干熱風(fēng)品種上調(diào)幅度分別為1 317、2 896、894倍，可見，抗干熱風(fēng)品種在處理后期 TaHSP26.6基因上調(diào)表達(dá)倍數(shù)顯著低于熱敏感型品種。

圖5 抗、感干熱風(fēng)小麥品種熱脅迫不同時間 TaHSP26.6基因的表達(dá)差異

3 討 論

3.1 高溫對小麥籽粒品質(zhì)與千粒重的影響

關(guān)于干熱風(fēng)對小麥品質(zhì)的影響前人已做了大量研究。小麥在灌漿后期經(jīng)歷高溫，籽粒蛋白的積累速率加快，淀粉含量降低；蛋白質(zhì)的積累與淀粉形成是兩個相互獨(dú)立又有聯(lián)系的過程，灌漿期經(jīng)歷高溫，籽粒蛋白含量增加是由于淀粉的減少造成的[2,5,20]。儀小梅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，抗干熱風(fēng)品種在灌漿后期經(jīng)干熱風(fēng)脅迫后，淀粉含量降低幅度小于熱敏感型品種。本研究發(fā)現(xiàn)，兩年鑒定的98個小麥品種在灌漿期經(jīng)歷干熱風(fēng)后，大部分品種的籽粒蛋白質(zhì)含量顯著提高，淀粉含量顯著降低，籽粒蛋白質(zhì)含量升高的主因是籽粒淀粉含量降低。

Hanft等[21]研究表明，環(huán)境對籽粒的發(fā)育具有重要作用，小麥灌漿期間經(jīng)歷干熱風(fēng)，必然會嚴(yán)重影響到小麥千粒重。Zhao等[22]研究表明，在灌漿期遭受高溫后，蛋白質(zhì)含量高的小麥品種千粒重高于蛋白質(zhì)含量低的小麥品種。本研究表明，不同小麥品種經(jīng)干熱風(fēng)處理后，千粒重均下降，降低幅度為4%～30%。根據(jù)小麥千粒重抗逆指數(shù)鑒定出的小麥抗性與淀粉、蛋白質(zhì)含量變化有一定關(guān)系，即抗性強(qiáng)的品種，其籽粒的淀粉含量下降幅度與蛋白質(zhì)含量升高幅度也較低。

3.2 高溫對小分子熱激蛋白表達(dá)的影響

在熱激蛋白中，12～45 kD小分子量熱激蛋白種類最豐富[23]，且其在植物生長的各個階段都有分布。高溫條件下，小分子熱激蛋白會大量合成[12,15-16]。熱激蛋白的積累可以增強(qiáng)植物耐熱性[13]。Xue等[10]對高溫誘導(dǎo)擬南芥中 HSP26基因的研究發(fā)現(xiàn)，HSP26熱激蛋白的積累可以增強(qiáng)植物的耐熱性。Zhang等[24]對擬南芥的高溫誘導(dǎo)研究結(jié)果表明， HSP21.4基因能在短時間內(nèi)迅速表達(dá)，對抵御外界脅迫有關(guān)鍵性作用。Murakami等[25]對水稻中 HSP17.7基因的研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)的 HSP17.7基因，可以提高水稻對高溫脅迫的抵抗能力。Park等[26]對高溫誘導(dǎo)胡蘿卜中 HSP17.7基因表達(dá)的研究也表明，高溫會在短時間內(nèi)提高 HSP17.7基因的表達(dá)量。本研究表明，小麥中 TaHSP16.9、 TaHSP17.8、 TaHSP23.6、 TaHSP26.6四個小分子熱激蛋白基因在高溫脅迫下能在短時間內(nèi)快速大量表達(dá)，這與前人研究相一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，高溫誘導(dǎo)小麥幼苗中，小分子熱激蛋白基因表達(dá)在干熱風(fēng)抗性不同的品種間有差異，抗干熱風(fēng)品種在高溫誘導(dǎo)期間， TaHSP16.9基因表達(dá)上調(diào)變化幅度大于熱敏感型品種， TaHSP17.8基因上調(diào)表達(dá)時間均早于熱敏感型品種，山農(nóng)23號的 TaHSP23.6基因上調(diào)表達(dá)峰值遠(yuǎn)高于其他品種，熱敏感型品種在熱脅迫后期 TaHSP26.6基因的上調(diào)倍數(shù)高于抗干熱風(fēng)品種，這表明TaHSPs基因的熱激反應(yīng)時間、上調(diào)表達(dá)幅度、基因表達(dá)峰值以及高溫誘導(dǎo)后期基因表達(dá)水平的維持在干熱風(fēng)抗性不同的品種間有差異。因此，還需進(jìn)一步明確小麥苗期小分子熱激蛋白基因的表達(dá)與灌漿期小麥干熱風(fēng)抗性的關(guān)系，以期為干熱風(fēng)抗性品種的選育提供更有價值的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

干熱風(fēng)處理導(dǎo)致干熱風(fēng)抗性有差異的小麥品種千粒重不同程度下降，在兩年重復(fù)鑒定小麥品種中，山農(nóng)23號等品種抗性等級均達(dá)到高、中抗干熱風(fēng)水平，抗性穩(wěn)定，而師欒02-1在兩年的鑒定中，均為熱敏感型品種。干熱風(fēng)處理顯著提高籽粒蛋白質(zhì)含量，降低籽粒淀粉含量和旗葉葉綠素含量，且抗性高的品種蛋白質(zhì)含量升高幅度與淀粉及葉綠素含量降低幅度較小。在38 ℃高溫誘導(dǎo)0～4.5 h的小麥幼苗中， TaHSP16.9、TaHSP17.8、)TaHSP23.6與 TaHSP26.6基因迅速大量表達(dá)，且不同品種的表達(dá)均為拋物線趨勢，但小分子熱激蛋白基因上調(diào)表達(dá)幅度、基因表達(dá)峰值以及高溫誘導(dǎo)后期基因表達(dá)水平的維持方面在干熱風(fēng)抗性不同的品種間有差異。

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Identification of Dry-Hot Wind Resistance of Wheat Cultivars and Gene Expression Analysis ofTaHSPsRelated to Heat Stress

LI Meiling,SUN Aiqing,YANG Min,ZHANG Jiedao,WANG Zhenlin,CHEN Leitai,CHEN Lulu,MA Xueli,YIN Yanping

(College of Agronomy,Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology/Shandong Key Laboratory of Crop Biology,Tai’an,Shandong 271018,China)

This study aims to identify dry-hot wind resistance of wheat cultivars and analyze expression of heat shock protein genes(TaHSPs) related to heat stress in resistant and susceptible wheat cultivars. Ninety-eight wheat cultivars were used as materials and treated with simulating dry-hot wind from 10 to 20 days after anthesis. Chlorophyll content,grain quality and thousand-kernel weight were tested,and the effects of dry-hot wind resistance of wheat cultivars were studied. The expression ofTaHSPsin 15-day-old seedling of resistant and susceptible wheat cultivars,which were subjected to continuous heat stress at 38 ℃ for 4.5 h,was tested by real-time quantitative PCR. The results showed that the chlorophyll content in flag leaf of wheat cultivars decreased gradually during the treatment of dry-hot wind and decreased much more in susceptible wheat cultivars than in resistant cultivars. Thousand-kernel weight of all cultivars was reduced after dry-hot wind treatment and some cultivars which were identified showed the same resistance to dry-hot wind in two-year replications,such as Shannong 23 showed steady resistance to dry-hot wind,whereas Shiluan 02-1 was sensitive to dry-hot wind in 2-year replications. Protein content was significantly increased while the starch content was significantly decreased. Besides,the percentage of decreased starch content of wheat cultivars with high adversity resistance index (AI) was lower than those with low AI. Expression analysis ofTaHSPsgenes showed, TaHSP16.9, TaHSP17.7, TaHSP23.6 and TaHSP26.6 in wheat seedling were highly expressed and the expression trends ofTaHSPswere first increasing and then decreasing during heat stress at 38 ℃. In addition,the gene expression patterns ofTaHSPswere different between resistant and susceptible wheat cultivars under heat stress at 1 h.For TaHSP16.9,the up-regulated extent of gene expression in resistant wheat cultivars was greater than that in susceptible wheat cultivars. For TaHSP17.8,the up-regulated times of gene expression in resistant wheat cultivars was higher than that in susceptible wheat cultivars under heat stress at 0.5 h. The up-regulated times of gene expression level in Shannong 23 with heat tolerance was higher than 590,whereas the expression level in Shiluan 02-1 with heat sensitivity only reached 300. For TaHSP23.6,the peak of Shannong 23 with heat tolerance was four times higher than those in other cultivars. For TaHSP26.6,the up-regulated times of gene expression in susceptible wheat cultivars were higher than resistant wheat cultivars under heat stress at 4.5 h. The up-regulated times of TaHSP26.6 in heat susceptible cultivars were higher than 4 000,whereas that in heat tolerant cultivars only reached 3 000.

Wheat; Dry-hot wind; 1 000-kernel weight; Adversity resistance index; Heat shock protein

時間：2017-01-16

2016-04-07

2016-05-23

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203029)

E-mail：limeiling0602@163.com

尹燕枰(E-mail:ypyinsdau@sina.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)02-0162-13

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170116.1833.006.html