李孟軍，李亞青，張士昌，張 楠，史占良

(石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北石家莊 050041)

小麥LEAsm基因及其啟動(dòng)子的克隆與功能研究

李孟軍，李亞青，張士昌，張 楠，史占良

(石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北石家莊 050041)

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(LEA)是一個(gè)小的高親水性的蛋白家族，該蛋白家族在逆境脅迫下大量積累，保護(hù)植物免受逆境脅迫。LEA蛋白可分為7組，其中重復(fù)的11-氨基酸基序是第3組 LEA蛋白的特征。為深入分析第3組LEA蛋白在小麥響應(yīng)逆境脅迫中的作用機(jī)制，利用芯片技術(shù)從小麥表達(dá)譜中篩選出一個(gè)滲透脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的第3組LEA蛋白基因TaLEAsm，然后根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)引物篩選石麥15的BAC文庫(kù)，獲得1個(gè)含有該基因的BAC單克隆，以該BAC單克隆質(zhì)粒為模板，通過(guò)BAC延伸測(cè)序克隆了TaLEAsm基因及其啟動(dòng)子序列，并對(duì)TaLEAsm序列特征、表達(dá)模式和啟動(dòng)子功能進(jìn)行了初步分析。結(jié)果表明，TaLEAsm基因序列僅含有1個(gè)105 bp的內(nèi)含子，其開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)675 bp，編碼224個(gè)氨基酸。TaLEAsm含有10個(gè)11-氨基酸重復(fù)序列，屬于第3組 LEA蛋白。低溫、高鹽和滲透脅迫均誘導(dǎo)TaLEAsm基因上調(diào)表達(dá)，但在根和葉中表達(dá)模式不同。在TaLEAsm基因起始密碼子上游1 500 bp序列中，預(yù)測(cè)含有14個(gè)逆境響應(yīng)順式元件。在擬南芥中，TaLEAsm基因啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)GUS基因表達(dá)，滲透脅迫誘導(dǎo)GUS基因明顯上調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果表明，TaLEAsm為小麥脫水響應(yīng)基因，其啟動(dòng)子為滲透脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子。

小麥；TaLEAsm；啟動(dòng)子；克??；功能研究

胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(LEA)是生物體內(nèi)與滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的蛋白家族，在植物胚胎發(fā)育晚期大量積累，響應(yīng)多種非生物逆境脅迫，如干旱、鹽害和低溫等[1]。Dure等[2]首次在棉花子葉中發(fā)現(xiàn)LEA蛋白。根據(jù)氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域和親水性，植物L(fēng)EA蛋白可分為7組，除第5組LEA蛋白具有疏水特征外，其余6組均為親水蛋白[3]。第3組LEA蛋白通常含有多拷貝的由11個(gè)氨基酸組成的基序 (TAQAAKEKAGE)，其分子量差異通常是由于11個(gè)氨基酸基序的拷貝數(shù)造成的[4]。研究表明，主要農(nóng)作物第3組LEA蛋白的11-氨基酸基序以多拷貝串聯(lián)形式存在，其長(zhǎng)度占蛋白序列長(zhǎng)度的40%～60%，帶電荷/極性氨基酸和疏水氨基酸數(shù)目分別占重復(fù)序列氨基酸總數(shù)的71%和29%[5]。

植物第3組LEA蛋白的積累與多種非生物逆境之間(低溫、干旱、鹽害等)存在很高的相關(guān)性。小麥第3組LEA-L2蛋白的組成型表達(dá)能夠顯著提高擬南芥的抗凍害能力[6]。轉(zhuǎn)大麥 HVA1的桑樹(shù)(Morusindica)和水稻對(duì)干旱和高鹽的耐受性明顯提高[7-8]。干旱和高鹽誘導(dǎo)水稻幼苗中 OsLEA19a上調(diào)表達(dá)，其編碼蛋白可能參與水稻對(duì)干旱和高鹽的抗性反應(yīng)[9]。干旱、低溫脅迫、鹽脅迫和外源ABA處理能夠提高小麥 TaLEAL3的表達(dá)量，表明其可能參與了小麥逆境脅迫響應(yīng)[10]。外源ABA、干旱、低溫、高鹽和高溫等均誘導(dǎo)臘梅 CpLEA的上調(diào)表達(dá)[11]。在煙草中過(guò)量表達(dá) ZmLEA3能夠提高煙草的抗?jié)B透脅迫和氧化脅迫的能力[12]。在玉米莖中 ZmLEA3的表達(dá)受到低溫、滲透脅迫、外源ABA和H2O2誘導(dǎo)后顯著提高[13]。

逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子使抗逆基因在特定時(shí)間和空間表達(dá)，提高植物抗逆性的同時(shí)，可減少抗逆基因組成型表達(dá)給植物帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)[14]。與CaMV35S啟動(dòng)子相比較，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子RD29A啟動(dòng) TaEXPB23在煙草中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)水分脅迫耐受性提高，同時(shí)降低了 TaEXPB23對(duì)煙草的負(fù)面影響[14]。擬南芥 CBF4上游序列CBF4P在干旱脅迫條件下轉(zhuǎn)錄活性高于CaMV35S啟動(dòng)子[15]。水楊酸和低溫處理可誘導(dǎo)葡萄(Vitispseudoreticulata)VpSTS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，起始密碼子上游162 bp對(duì)于該啟動(dòng)子的組成型表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)模式必不可少[16]。干旱脅迫誘導(dǎo)水稻 Oshox24的啟動(dòng)子強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá)，同時(shí)該啟動(dòng)子還受到脫落酸的誘導(dǎo)[17]。 OsDhn1啟動(dòng)子受到干旱誘導(dǎo)，但不受傷害、冷害、鹽害和外源ABA處理等誘導(dǎo)[18]。高鹽脅迫使擬南芥 AtPUB18啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)量顯著升高[19]。逆境脅迫誘導(dǎo)基因 ZmRXO1上游1 576 bp啟動(dòng)子序列可驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草中高水平表達(dá)，其中582 bp(-582 to -1)的序列能夠在激素(MeJA、GA、ABA)、干旱、低溫誘導(dǎo)下驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)[20]。

LEA 蛋白基因在非生物逆境中的作用已在多種作物中得到證實(shí)[6-13]，小麥第3組LEA蛋白基因，特別是其啟動(dòng)子的克隆及其功能分析，不僅有利于對(duì)其作用機(jī)制的深入探討，而且也為利用第3組LEA 蛋白基因提高作物抗逆性奠定基礎(chǔ)。本研究利用Affymetrix小麥表達(dá)譜芯片分析石麥15滲透脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)1個(gè)第3組LEA蛋白基因TaLEAsm受滲透脅迫誘導(dǎo)高豐度表達(dá)。通過(guò)PCR篩選石麥15基因組BAC文庫(kù)，結(jié)合BAC克隆測(cè)序了TaLEAsm基因及其啟動(dòng)子，并對(duì)TaLEAsm序列特征、表達(dá)模式和啟動(dòng)子功能等進(jìn)行了初步分析，以期為深入研究和利用TaLEAsm進(jìn)行小麥抗逆遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為冬小麥品種石麥15，由石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院小麥研究所提供。挑選大小基本一致的飽滿種子在光照培養(yǎng)箱中用自來(lái)水培養(yǎng)至二葉一心期，改用1/2 Hoagland培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)溫度為22±1 ℃，每天光照14 h。選取生長(zhǎng)發(fā)育一致的幼苗20～25株置培養(yǎng)皿中，分別進(jìn)行16% PEG6000(1/2 Hoagland配制)、200 mmol·L-1NaCl(1/2 Hoagland配制)和4 ℃(春化箱)處理，并于各處理的0、1、3、6、9、12、24和48 h取根和葉片，取樣期間保持全天光照，所取樣品液氮速凍后于-70 ℃冰箱保存。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

石麥15基因組BAC文庫(kù)由1 000 000個(gè)以上克隆組成，保存在1 020個(gè)混合池中，克隆插入片段平均長(zhǎng)度為85 kb，空載率為2.5%，保存于石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 石麥15的BAC文庫(kù)篩選

根據(jù)小麥TaLEAsmcDNA序列(GenBank:AY148490)設(shè)計(jì)TaLEAsmF1/TaLEAsmR1(TaLEAsmF1：5′-GGTCGTGTTCCAAGAAA CC-3′；TaLEAsmR1：5′-AGCAAAGTAAATTA AGCGCC-3′)和TaLEAsmF2/TaLEAsmR2(TaLEAsmF2：5′-GTTCCAAGAAACCAAAA TGG-3′；TaLEAsmR2：5′-ACATGCGTCTAGT GATTCCTG-3′)兩對(duì)嵌套引物對(duì)石麥15 BAC文庫(kù)進(jìn)行篩選。 PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。TaqDNA聚合酶為2×TaqPCR StarMix(GenStar)。

1.3TaLEAsm基因gDNA、cDNA及啟動(dòng)子序列的獲得

以含有TaLEAsmBAC單克隆質(zhì)粒為模板，根據(jù)BAC單克隆質(zhì)粒上已知TaLEAsm序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物，用BigDye○RTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(ABI)進(jìn)行測(cè)序PCR反應(yīng)，用ABI 3730 XL DNA Analyzer進(jìn)行測(cè)序。采用primer walking方法進(jìn)行步移，直至獲得基因完整序列及其啟動(dòng)子序列。用RNAiso Plus(TaKaRa) 提取根和葉片總RNA。用polyATract○RmRNA isolation system III (Promega) 分離mRNA。用PrimerScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)合成第一鏈cDNA。PCR擴(kuò)增引物為T(mén)aLEAsmF1/TaLEAsmR1。PCR產(chǎn)物克隆使用DNA A-Tailing Kit和pMD18-T vector (TaKaRa)。

1.4TaLEAsm基因的表達(dá)模式分析

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用SYBR○RPremix ExTaqTMII(TaKaRa)。上游引物：5′-CACCAG GAATCACTAGACGCAC-3′；下游引物：5′-CAAATGAGCTGAAATCACGAAAG-3′。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。以小麥β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，反應(yīng)在ABI Prism7500熒光定量PCR儀上運(yùn)行，3次重復(fù)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。

1.5TaLEAsm基因啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建與擬南芥的轉(zhuǎn)化

根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果確定TaLEAsm基因啟動(dòng)子序列，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物TaLEAsm-proF/TaLEAsm-proR(TaLEAsm-proF:5′-CGGG ATCCGTGCGTGTCGGAAGAACTC-3′，下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)；TaLEAsm-proR:5′-CCAAGCTTTGGAACACGACCTGGAATC-3′，下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)槠鹗济艽a子ATG上游從11 bp到1 647 bp。TaLEAsm基因啟動(dòng)子表達(dá)載體構(gòu)建使用pCAMBIA1831Z載體。20 μL PCR反應(yīng)體系包含2×Pfu PCR MasterMix 10 μL(TIANGEN)、上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、模板質(zhì)粒DNA (20 ng·L-1)2 μL及ddH2O 6 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。酶切片段連接使用T4 DNA ligase(NEB)。轉(zhuǎn)化菌株分別使用大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101。通過(guò)BamHⅠ和HindⅢ酶切和測(cè)序?qū)?gòu)建的啟動(dòng)子表達(dá)載體進(jìn)行驗(yàn)證。以擬南芥生態(tài)型Columbia-0為受體，采用花序浸染法進(jìn)行轉(zhuǎn)化[21]。轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定采用PCR和GUS染色的方法，經(jīng)過(guò)連續(xù)培養(yǎng)，啟動(dòng)子功能驗(yàn)證采用T3代純合體進(jìn)行。

1.6 GUS組織化學(xué)染色

轉(zhuǎn)基因擬南芥苗(T3代)在抗性平板上生長(zhǎng)10 d后，選取生長(zhǎng)一致的幼苗，分別于1/2MS培養(yǎng)基、16% PEG8000(1/2MS培養(yǎng)基配制)、400 mmol·L-1Mannitol(1/2MS培養(yǎng)基配制)在培養(yǎng)室中處理12 h(22 ℃，16 h光照；16 ℃，8 h黑暗)。用不含X-Gluc的GUS染色液洗滌轉(zhuǎn)基因擬南芥植株后，轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，加入適量GUS染色液浸沒(méi)全部植株，37 ℃保溫8 h，然后去除染色液，用95%乙醇37 ℃脫色2～3 h，組織染色完畢后保存于75%乙醇中，4 ℃保存。使用變倍體視顯微鏡(Nikon SMZ1000)觀察，并用數(shù)碼相機(jī)(Nikon DXM1200F)拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1TaLEAsm引物特異性分析

Affymetrix小麥表達(dá)譜芯片分析表明，小麥cDNA序列(GenBank No. AY148490)滲透脅迫后上調(diào)表達(dá)，其中葉片表達(dá)量在滲透脅迫后3 h、9 h和27 h分別為對(duì)照的138.3倍、71.3倍和45.6倍，根系分別為對(duì)照的42.4倍、28.5倍和45.8倍。NCBI Blastx比對(duì)顯示，該基因?yàn)榈?組LEA蛋白編碼基因，命名為T(mén)aLEAsm。根據(jù)TaLEAsmcDNA序列設(shè)計(jì)嵌套引物，分別以石麥15基因組DNA和cDNA為模板，使用高保真酶進(jìn)行PCR和RT-PCR擴(kuò)增，分別隨機(jī)挑取6個(gè)克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物僅含有TaLEAsm，嵌套引物均為T(mén)aLEAsm特異性引物(圖1)。

M：DL2000；1：石麥15的DNA；2：石麥15的cDNA；3：BAC質(zhì)粒；4：ddH2O。

M:DL2000; 1:DNA from Shimai 15; 2:cDNA from Shimai 15; 3:BAC plasmid; 4:ddH2O.

圖1TaLEAsm基因PCR引物特異性檢測(cè)

Fig.1 Specific detection of PCR primers forTaLEAsmgene

2.2TaLEAsm基因gDNA和cDNA序列擴(kuò)增結(jié)果

以石麥15基因組BAC文庫(kù)混合池質(zhì)粒為模板，采用引物TaLEAsmF1/TaLEAsmR1，利用PCR技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得陽(yáng)性混合池4個(gè)(pool 269、pool 479、pool 588和pool 721)。PCR產(chǎn)物測(cè)序表明，4個(gè)混合池中TaLEAsm基因序列一致。通過(guò)對(duì)混合池pool 269進(jìn)一步篩選，分離出含有TaLEAsm的BAC單克隆。脈沖場(chǎng)凝膠電泳顯示，該克隆插入片段75 kb左右。

根據(jù)TaLEAsmcDNA序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物，以含有該序列的BAC單克隆質(zhì)粒為模板，通過(guò)5次測(cè)序反應(yīng)，經(jīng)序列組裝，獲得1條長(zhǎng)為3 846 bp 的DNA序列。NCBI blastx分析表明，該序列中含有完整的TaLEAsm。TaLEAsm基因cDNA序列和gDNA序列分別長(zhǎng)為843 bp和948 bp，該基因僅含有1個(gè)105 bp的內(nèi)含子(圖2)。TaLEAsm讀碼框長(zhǎng)為675 bp，編碼一個(gè)含有224個(gè)氨基酸的蛋白，分子量為23.2 kD。TaLEAsm具有10個(gè)重復(fù)的11-氨基酸基序(TAQAAKEKAGE)，這些重復(fù)的基序以串聯(lián)重復(fù)形式分3組分布在TaLEAsm序列中，長(zhǎng)度占蛋白質(zhì)全序列的54%[4](圖3)。序列比對(duì)表明，單子葉植物第3組LEA基因在11-氨基酸基序重復(fù)區(qū)域保守性低，11-氨基酸基序數(shù)目的不同導(dǎo)致該區(qū)域序列長(zhǎng)度的變化(圖4)。

圖2 TaLEAsm基因結(jié)構(gòu)

2.3TaLEAsm基因的表達(dá)模式分析

分析TaLEAsm基因在低溫、高鹽、PEG脅迫處理下的小麥幼苗根和葉中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其受這些脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但表達(dá)模式有所不同(圖5)。在高鹽條件下，根中TaLEAsm基因表達(dá)量明顯高于葉中，二者相差3倍以上；而在PEG滲透脅迫條件下，葉中TaLEAsm基因表達(dá)量高于根中，二者相差也在3倍以上。低溫、高鹽、PEG脅迫處理下，葉中TaLEAsm基因在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值；而根中TaLEAsm基因在12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值。說(shuō)明TaLEAsm基因?yàn)榈蜏亍⒏啕}和PEG誘導(dǎo)表達(dá)基因；在高鹽和PEG脅迫下，TaLEAsm基因在根和葉中可能存在不同的調(diào)控機(jī)制。

2.4TaLEAsm基因啟動(dòng)子的克隆與序列分析

TaLEAsm基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為A，位于起始密碼子上游23 bp處，符合轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的一般特點(diǎn)。通過(guò)延伸測(cè)序獲得TaLEAsm基因起始密碼子ATG上游5′側(cè)翼序列2 290 bp。采用PlantCARE在線預(yù)測(cè)TaLEAsm基因ATG上游1 500 bp序列的順式作用元件，該啟動(dòng)子序列中含有14個(gè)與逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，包括ABRE(5)、CE3(2個(gè))、CGTCA-motif(2個(gè))、HSE(2個(gè))、TGACG-motif(2個(gè))和motif IIb(1個(gè))(表1)，說(shuō)明TaLEAsm基因可能與小麥逆境脅迫反應(yīng)有關(guān)。

11-氨基酸基序用細(xì)線標(biāo)出。 The motif of eleven amino acids is marked by thin line.

圖4 單子葉植物第3組LEA蛋白的序列比對(duì)

圖5 TaLEAsm基因在不同脅迫處理下的表達(dá)模式

順式作用元件名稱(chēng)Nameofcis-actingelement物種Species位置Location/bpDNA鏈Strand序列Sequence功能FunctionABRE大麥464+GCAACGTGTC脫落酸響應(yīng)順式作用元件Hordeumvulgare1146-GCAACGTGTCCis-actingelementinvolvedintheabscisicacidresponsiveness1340+GCAACGTGTC1114+CGTACGTGCA1310+CCTACGTGGCCE3水稻Oryzasativa945-GACGCGTGTC脫落酸和休眠基因Viviparous-1響應(yīng)順式作用元件1297+GACGCGTGTCCis-actingelementinvolvedinABAandVP1responsivenessCGTCA-motif大麥Hordeumvulgare951+CGTCA茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件Cis-actingregulatoryelementinvolvedinthe1156+CGTCAMeJA-responsivenessHSE油菜Brassicaoleracea247-AAAAAATTTC熱脅迫響應(yīng)順式作用元件Cis-actingelementinvolvedinheatstressresponsiveness825-AAAAAATTTCTGACG-motif大麥Hordeumvulgare951-TGACG茉莉酸甲酯響應(yīng)順式作用元件Cis-actingregulatoryelementinvolvedinthe1156-TGACGMeJA-responsivenessMotifIIb水稻Oryzasativa1333+CCGCCGCGCT脫落酸反應(yīng)元件Abscisicacidresponsiveelement

2.5TaLEAsm基因啟動(dòng)子的功能分析

以含有TaLEAsm基因的BAC質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了TaLEAsm起始密碼子ATG上游5′側(cè)翼序列1 637 bp，構(gòu)建了啟動(dòng)子表達(dá)載體(TaLEAsmPro::GUS)。采用花序轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化擬南芥，選取T3代純合體進(jìn)行GUS表達(dá)分析。1/2MS培養(yǎng)基、16% PEG6000和400 mmol·L-1Mannitol處理的擬南芥幼苗在子葉中均能觀察到顯示GUS活性的藍(lán)色。與在1/2MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)的擬南芥幼苗相比，16% PEG6000和400 mmol·L-1Mannitol處理均導(dǎo)致擬南芥幼苗子葉的藍(lán)色明顯加深(圖6)。GUS染色結(jié)果表明，TaLEAsm基因啟動(dòng)子存在組成型表達(dá)，滲透脅迫處理能夠明顯提高其表達(dá)水平，因此，TaLAEsm啟動(dòng)子為滲透脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

圖6 TaLEAsmPro::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色

3 討 論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，面臨著多種非生物逆境脅迫，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，植物形成了一系列的抵御機(jī)制，從而減輕或消除各種逆境脅迫對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響。已有研究表明，逆境脅迫誘導(dǎo)植物第3組LEA蛋白基因上調(diào)表達(dá)，轉(zhuǎn)第3組LEA蛋白基因能夠提高植物的抗逆性[6-13,22]。低溫、高鹽和干旱等非生物逆境脅迫均誘導(dǎo)小麥第3組LEA蛋白基因 TaLEAL3、 TaDRLea3-2和 TaLEAsm的上調(diào)表達(dá)，但其誘導(dǎo)表達(dá)譜呈現(xiàn)不同特征[10,23]，這些結(jié)果表明，第3組LEA蛋白基因可能通過(guò)不同機(jī)制參與小麥逆境脅迫響應(yīng)。

第3組LEA蛋白的11-氨基酸基序可形成兼性α-螺旋，其親水表面與過(guò)量的離子“螯合”，從而減輕胞質(zhì)中高濃度離子對(duì)細(xì)胞的毒害。其疏水面可結(jié)合膜結(jié)構(gòu)或蛋白,從而維持膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和阻止蛋白聚集變性[4]。作物第3組LEA蛋白的11-氨基酸基序的拷貝數(shù)相差較大，少則5個(gè)(棉花D-7)，多則27個(gè)(胡蘿卜DC8)[5]。小麥TaLEAsm屬于典型的第3組LEA蛋白基因，編碼蛋白含有10個(gè)11-氨基酸基序，這些基序以串聯(lián)重復(fù)形式分3組分布在TaLEAsm序列中，占蛋白長(zhǎng)度的一半以上。第3組LEA蛋白11-氨基酸基序與植物抗逆性有關(guān)，但其拷貝數(shù)與植物抗逆性強(qiáng)弱之間是否相關(guān)缺乏試驗(yàn)證據(jù)，尚待深入研究。

TaLEAsm和 TaLEAL3啟動(dòng)子含有的逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件不同，前者為ABRE、CE3等，而后者為ABRE、DRE、DRE/CRT 和DPBF 等，這表明TaLEAsm和 TaLEAL3可能通過(guò)依賴(lài)ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與小麥逆境脅迫響應(yīng)，同時(shí)也為二者對(duì)不同逆境的響應(yīng)差異提供了佐證。

第3組LEA蛋白參與植物多種非生物逆境脅迫響應(yīng)，隨著對(duì)其研究的不斷深入，第3組LEA蛋白有望在作物抗逆分子育種中發(fā)揮更為重要的作用。TaLEAsm及其啟動(dòng)子的克隆為小麥抗逆轉(zhuǎn)基因育種提供了新的選擇[15-20,24]。TaLEAsm對(duì)低溫、鹽害和干旱脅迫響應(yīng)強(qiáng)烈，其啟動(dòng)子為干旱強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，暗示該基因能夠提高小麥的非生物逆境抗性，但其逆境響應(yīng)機(jī)制尚需深入探討。

[1] 楊 杞,尹佳佳,王 穎,等.檸條錦雞兒 CkLEA1基因克隆及表達(dá)分析[J].中國(guó)生物工程雜志,2013,33(5):93.

YANG Q,YIN J J,WANG Y,etal.Cloning and expression analysis of CkLEA1 gene inCaraganakorshinskiiKom [J].ChinaBiotechnology,2013,33(5):93.

[2]DURE L,CHLAN C.Developmental biochemistry of cottonseed embryogenesis and germination:XII.Purification and properties of principal storage proteins [J].PlantPhysiology,1981,68(1):180.

[3]XIONG L,ZHU J K.Molecular and genetic aspects of plant responses to osmotic stress [J].Plant,Cell&Environment,2002,25(2):131.

[4]DURE L.A repeating 11-mer amino acid motif and plant desiccation [J].PlantJournal,1993,3:363.

[5] 孫海丹,蘭 英,劉 昀,等.LEA蛋白質(zhì)11-氨基酸基序與植物抗旱性[J] .東北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,36(3):85.

SUN H D,LAN Y,LIU Y,etal.11-amino acid motif in late embryogenesis abundant protein (LEA) and plant desiccation tolerance [J].JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition),2004,36(3):85.

[6]NDONG C,DANYLUK J,WILSON K E,etal.Cold-regulated cereal chloroplast late embryogenesis abundant-like proteins:molecular characterization and functional analyses [J].PlantPhysiology,2002,129:1368.

[7]LAL S,GULYANI V,KHURANA P.Overexpression of HVA1 gene from barley generates tolerance to salinity and water stress in transgenic mulberry (Morusindica) [J].TransgenicResearch,2008,17:651.

[8]XU D,DUAN X,WANG B,etal.Expression of a late embryogenesis abundant protein gene, HVA1,from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice [J].Plantphysiology,1996,110:249.

[9] 胡廷章,吳應(yīng)梅,陳再剛,等.水稻 OsLEA19a基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2011,26(6):73.

HU T Z,WU Y M,CHEN Z G,etal.Molecular cloning,expression character and bioinformatics analysis of OsLEA19a from rice [J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,2011,26(6):73.

[10] 閔東紅,趙 月,陳 陽(yáng),等.小麥脅迫相關(guān)基因 TaLEAL3的克隆及分子特性分析[J].作物學(xué)報(bào),2012,38(10):1847.

MIN D H,ZHAO Y,CHEN Y,etal.Isolation and molecular characterization of stress-related TaLEAL3 gene in wheat [J].ActaAgronomicaSinica,2012,38(10):1847.

[11] 馬 婧,孫文婷,王 晶,等.蠟梅胚胎晚期豐富蛋白基因CpLEA的克隆及表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào),2014,41(8):1663.

MA J,SUN W T,WANG J,etal.Cloning and expression analysis of a late embryogenesis abundant protein geneCpLEAfromChimonanthuspraecox[J].ActaHorticulturaeSinica,2014,41(8):1663.

[12]LIU Y,WANG L,XING X,etal. ZmLEA3,a multifunctional group 3 LEA protein from maize (ZeamaysL.),is involved in biotic and abiotic stresses [J].PlantandCellPhysiology,2013,54:944.

[13]LIU Y,LIANG J,SUN L,etal.Group 3 LEA protein, ZmLEA3,is involved in protection from low temperature stress [J].FrontiersinPlantScience,2016,7:1011.

[14]LI F,HAN Y Y,FENG Y,etal.Expression of wheat expansin driven by the RD29 promoter in tobacco confers water-stress tolerance without impacting growth and development [J].JournalofBiotechnology,2013,163(3):281.

[15] 霍秀文,米福貴,云錦鳳,等.轉(zhuǎn)錄因子CBF4誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆及功能分析[J].分子植物育種,2005,3(3):363.

HUO X W,MI F G,YUN J F,etal.Cloning and functional analysis of an induced promoter of transcriptional factor CBF4 fromArabidopsis[J].MolecularPlantBreeding,2005,3(3):363.

[16]XU W,YU Y,DING J,etal.Characterization of a novel stilbene synthase promoter involved in pathogen- and stress-inducible expression from Chinese wildVitispseudoreticulata[J].Planta,2010,231(2):475.

[17] 楊 梅,熊立仲.水稻干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Oshox24P的分離與鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,30(5):525.

YANG M,XIONG L Z.Isolation and characterization of a drought-inducible promoter Oshox24P in rice [J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity,2011,30(5):525.

[18]LEE S C,KIM S H,KIM S R.Drought inducible OsDhn1 promoter is activated by OsDREB1A and OsDREB1D [J].JournalofPlantBiology,2013,56(2):115.

[19] 張新宇,趙蘭杰,李艷軍,等.鹽脅迫對(duì)擬南芥 AtPUB18基因的誘導(dǎo)表達(dá)及其啟動(dòng)子分析[J].西北植物學(xué)報(bào),2014,34(1):54.

ZHANG X Y,ZHAO L J,LI Y J,etal.Expression of AtPUB18 after salt stress treatment and analysis of its promoter fromArabidopsisthaliana[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2014,34(1):54.

[20]TAO Y,WANG F T,JIA D M,etal.Cloning and functional analysis of the promoter of a stress-inducible gene( ZmRXO1) in maize [J].PlantMolecularBiologyReporter,2014,33(2):1.

[21]CLOUGH S I,STEVEN I,BENT A F.Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsisthaliana[J].PlantJournal,1998,16(6):735.

[22]VASEVA I I,GRIGOROVA B S,SIMOVA-STOILOVA L P,etal.Abscisic acid and late embryogenesis abundant protein profile changes in winter wheat under progressive drought stress [J].PlantBiology,2010,12:698.

[23] 梁雅珺,于正陽(yáng),強(qiáng)智全,等.小麥 TaDRLea3-2基因的克隆及脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析[J].西北植物學(xué)報(bào)，2016,36(6):1091.

LIANG Y J,YU Z Y,QIANG Z Q,etal.Cloning of a new gene TaDRLea3-2 from wheat and its expression under different stresses treatments [J].ActaBotanyBoreal-OccidentSinica,2016,36(6):1091.

[24] 李孟軍,李亞青,張 楠,等.小麥 TaDHN2基因及其啟動(dòng)子的克隆與功能研究[J].麥類(lèi)作物學(xué)報(bào),2015,35(8):1031.

LI M J,LI Y Q,ZHANG N,etal.Cloning and functional analysis of coding and promoter regions of TaDHN2 gene in wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2015,35(8):1031.

Isolation and Functional Analysis of Coding and Promoter Regions ofLEAsmGene in Wheat

LI Mengjun,LI Yaqing,ZHANG Shichang,ZHANG Nan,SHI Zhanliang

(Shijiazhuang Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Shijiazhuang,Hebei 050041,China)

Late embryogenesis abundant (LEA) proteins are a family of small highly hydrophilic proteins that accumulate markedly in plants under stress conditions and protect plants from the damage caused by stress. LEA proteins can be classified into seven groups,in which group 3 LEA proteins are characterized as a repeating motif of eleven amino acids. In order to analyze the mechanism of group 3 LEA proteins in response to stress conditions deeply,an osmotic-stress induced gene,TaLEAsm,was screened in DNA microarrays for wheat expression profiles. One BAC clone was isolated from Shimai 15 BAC library using primers designed based onTaLEAsmcDNA sequence.TaLEAsmand its promoter sequence were cloned by sequencing walking using BAC clone plasmid as template. Only an 105 bp intron was identified inTaLEAsm. The open reading frame ofTaLEAsmis 675 bp long,encoding 224 amino acids.TaLEAsm belonged to group 3 LEA protein containing ten repeating motifs of eleven amino acids.TaLEAsmwas strongly up-regulated induced by low temperature,high salt and osmotic stress,showing different expression patterns in root and leaf of wheat. Fourteen stress-responsecis-elements were predicted in 1 500 bp sequence upstream ofTaLEAsmstart codon.TaLEAsmpromoter could lead to the expression ofGUSgene,which was induced by osmotic stress inArabidopsis.The results above indicatedTaLEAsmmay be a dehydration-response gene and its promoter was an inducible promoter.

Triticumaestivum;TaLEAsm; Promoter; Cloning; Functional analysis

時(shí)間：2017-01-16

2016-09-27

2016-11-18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0101802)；國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201203012)；河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(16226320D)

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史占良(E-mail:shizhanl@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)02-0145-08

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