杜理華，徐亮亮，成柄灼

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

一種脂肪酶催化柚皮苷酯化反應(yīng)的研究

杜理華，徐亮亮，成柄灼

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

為了增加柚皮苷的脂溶性從而使其具有更好的生物利用度,首次用脂肪酶lipase TL IM (Thermomyceslanuginosus)催化，以乙酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯和棕櫚酸乙烯酯等乙烯酯類為?；w,對柚皮苷進(jìn)行選擇性酯化.系統(tǒng)地研究了有機(jī)介質(zhì)中固定化脂肪酶催化合成柚皮苷脂肪酸酯的影響因素，實驗先對有機(jī)溶劑的體積比和底物的摩爾比進(jìn)行探討，再對反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間進(jìn)行研究.結(jié)果表明：溶劑、底物摩爾比、溫度及反應(yīng)時間等方面對柚皮苷酯化反應(yīng)有不同程度上的影響，在最佳條件下，酯化產(chǎn)物產(chǎn)率可高達(dá)85%.

柚皮苷；酯化反應(yīng)；脂肪酶；催化

柚皮苷又名柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，是一種雙氫黃酮類化合物，它具有抗氧化活性[1-2]、抗癌活性[3]和預(yù)防冠心病[4]等多種生理活性，在醫(yī)藥、食品和精細(xì)化工等行業(yè)中已有應(yīng)用.但是由于溶解性低，穩(wěn)定性差對其應(yīng)用受到限制.對柚皮苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，可改善其水溶性或脂溶性，或提高其生理活性、增加新的功能等，成為新藥研制的有效途徑之一.對黃酮類化合物進(jìn)行酯化，接入脂肪酸基團(tuán)后，其生理活性的提高已被一些研究證實[5].但是由于黃酮結(jié)構(gòu)中羥基較多，容易形成副產(chǎn)物，影響其反應(yīng)的產(chǎn)率和選擇性.因此，尋找低毒、少污染、高選擇以及高效[6]的柚皮苷酯化反應(yīng)方法顯得尤為重要.

當(dāng)今社會正在提倡采用合適的催化劑催化合成有機(jī)產(chǎn)品,減少合成步驟,提高產(chǎn)率的綠色有機(jī)合成方法[7].現(xiàn)已有文獻(xiàn)報道了關(guān)于酶促柚皮苷酯化反應(yīng)的方法，Banieli等酶法催化柚皮苷酯化反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)在枯草桿菌蛋白酶(來源于Bacillus licheniformis)的催化下，柚皮苷酰基化的位置在3″-OH和4″-OH位上[8]，產(chǎn)物為單酯、二酯的化合物；而在脂肪酶B(來源于Candida antarctica)的催化下，?；奈恢脛t在6″-OH位上[9].Nakajima[10]等選擇多種脂肪酶，在不同的有機(jī)溶劑中催化黃酮苷(異槲皮苷、柚皮苷、蘆丁等)和肉桂酸反應(yīng)，生成天然黃酮類酯化物轉(zhuǎn)化率很低.Gayot等用Novozym 435[11]脂肪酶催化柚皮苷和棕櫚酸的酯化反應(yīng)，在柚皮苷的糖苷鏈的6′′羥基上引入脂肪酸長鏈，實驗反應(yīng)55 h，產(chǎn)率達(dá)43%.由于酶法合成與化學(xué)法合成相比具有高度的區(qū)域選擇性、立體選擇性[12]、環(huán)境污染少、反應(yīng)條件溫和和反應(yīng)速度快[13]等優(yōu)點，可實現(xiàn)多官能團(tuán)底物的衍生化，適合柚皮苷酯化反應(yīng)的進(jìn)行.酶源的不同，對于同一反應(yīng)體系的選擇性也存在差異，尋找合適的酶對催化反應(yīng)很關(guān)鍵.本實驗研究了一種脂肪酶TL IM催化柚皮苷與乙烯酯類化合物(乙酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕櫚酸乙烯酯)酯化反應(yīng)的新方法，脂肪酶TL IM首次被應(yīng)用于催化柚皮苷酯化反應(yīng)，反應(yīng)時間為12 h，產(chǎn)率最高可達(dá)85%.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

柚皮苷，叔戊醇(AR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑)，DMSO (AR，無錫海碩生物公司),Lipozyme TL IM(Novo Nordisk)，乙酸乙烯酯(AR，江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司)，棕櫚酸乙烯酯(AR，東京仁成工業(yè)株式會社)，月桂酸乙烯酯(AR，東京仁成工業(yè)株式會社)，硅膠薄板(G60，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)，柱層析硅膠(300～400目，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)，玻璃點樣毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠)，其他主要試劑都為分析純.

1.2 實驗器材

電子天平(BS224，賽多利斯科學(xué)儀器廠)，真空干燥箱(XMTD-8222，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，磁力攪拌器(85-1，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司)，數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(SHA-C，金壇市江南儀器廠)，三用紫外分析儀(ZF-I,上海顧村電光儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000，上海亞榮生化儀器廠)，高效液相色譜儀HPLC(依利特P230Ⅱ，大連依利特分析儀器有限公司)，核磁共振儀NRM(AVANCE Ⅲ,瑞士Bruker公司，TMS內(nèi)標(biāo))，質(zhì)譜儀(Agilent 6210 TOF，美國Agilent公司)，傅立葉變換紅外分光光度計(Avater 370，美國熱電設(shè)備公司).

1.3 實驗方法

本實驗主要考察反應(yīng)條件對酶促柚皮苷酯化反應(yīng)的影響，從而得出最佳反應(yīng)條件，獲得最高的產(chǎn)量.實驗以酶促柚皮苷與月桂酸乙烯酯的反應(yīng)作為柚皮苷酯化反應(yīng)的模型反應(yīng)，按照下述實驗方法對酯化反應(yīng)的有機(jī)溶劑體積比、底物摩爾比、溫度和時間等條件分別進(jìn)行研究.

實驗步驟：取一個10 mL的錐形瓶，加入0.1 mmol柚皮苷，加入4 mL的溶劑到錐形瓶中，在52 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，以200 rev/min的速度振蕩20 min.再加入一定量的乙烯酯類(乙酸乙烯酯，月桂酸乙烯酯，棕櫚酸乙烯酯)，使其充分混合后再加入0.18 g TL IM酶，放入52 ℃恒溫振蕩箱中開始反應(yīng)，反應(yīng)過程用TLC定性監(jiān)測，展開劑為V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)=25∶3.6∶1.反應(yīng)結(jié)束后，過濾酶并用冰水和乙酸乙酯萃取除去DMSO，減壓蒸餾乙酸乙酯，經(jīng)柱層析分離提純后得到產(chǎn)物，再通過1H NMR，13C NMR，ESI-MS表征分析.其反應(yīng)式為其中：Ⅰ為柚皮苷；Ⅱ為乙烯酯類；Ⅲ為柚皮苷酯化物.n=0時得到柚皮苷乙酸酯；n=10得到柚皮苷月桂酸酯；n=14得到柚皮苷棕櫚酸酯.

2 實驗結(jié)果及分析

在研究脂肪酶TL IM催化的柚皮苷酯化反應(yīng)的過程中，為了促進(jìn)酯化反應(yīng)的進(jìn)行和抑制不必要副反應(yīng)，實驗系統(tǒng)討論溶劑、底物摩爾比、溫度及反應(yīng)時間對柚皮苷酯化反應(yīng)的影響.實驗選擇以酶促柚皮苷與月桂酸乙烯酯的反應(yīng)作為柚皮苷酯化反應(yīng)的模型反應(yīng)，進(jìn)行各種條件的優(yōu)化.

2.1 反應(yīng)溶劑對酶催化柚皮苷酯化的影響

有機(jī)溶劑作為非水相反應(yīng)的介質(zhì)，對酶催化起著一定的影響作用，它主要通過與酶的必需水作用、與底物和產(chǎn)物作用、改變酶蛋白的結(jié)構(gòu)與柔性等方式直接或間接地影響酶的各種特性.有機(jī)溶劑的極性會影響底物和產(chǎn)物在其中的溶解性，因此實驗在選擇反應(yīng)介質(zhì)時，既要考慮底物在有機(jī)溶劑中應(yīng)具有一定的溶解度，又要考慮有機(jī)溶劑分子和底物分子之間的結(jié)合不能太強(qiáng)，而產(chǎn)物容易溶解于有機(jī)相，這樣就有利于底物從有機(jī)溶劑中的析出和產(chǎn)物向有機(jī)相的遷移.根據(jù)文獻(xiàn)查詢，本實驗選擇的有機(jī)溶劑為叔戊醇與DMSO的混合溶劑，并進(jìn)行溶劑比的研究，反應(yīng)結(jié)果如圖1所示.

圖1 反應(yīng)溶劑比對柚皮苷酯化反應(yīng)的影響Fig.1 The influence of solvent ratio of on the reaction

2.2 底物摩爾比對酶促柚皮苷酯化的影響

在理論上，n(月桂酸乙烯酯)∶n(柚皮苷)=1∶1進(jìn)行反應(yīng).當(dāng)?；w摩爾濃度大于柚皮苷摩爾濃度時有利于酯化反應(yīng)向著生成酯的方向進(jìn)行，用過量脂肪酸反應(yīng)對酯化反應(yīng)較為有利.更高的月桂酸乙烯酯與柚皮苷的摩爾比意味著獲得更大的酰化供體摩爾濃度，從而提高反應(yīng)速率，獲得更高的酯化率.另一方面，底物摩爾比的不同可能也會影響反應(yīng)體系的極性，影響底物在酶催化中心附近的分布，從而影響酶促反應(yīng)的速率和酯化率.本實驗研究了當(dāng)n(?；w)∶n(柚皮苷)=1∶1上升到9∶1時的反應(yīng)情況，實驗結(jié)果如圖2所示.當(dāng)?shù)孜锬柋葹?∶1時，反應(yīng)產(chǎn)率最佳，繼續(xù)增加月桂酸乙烯酯的量，不但沒有進(jìn)一步提高反應(yīng)的產(chǎn)率，反而引起副反應(yīng)的發(fā)生而影響反應(yīng)的產(chǎn)率，所以該方法的最佳底物比為7∶1.

圖2 底物摩爾比對柚皮苷酯化反應(yīng)的影響Fig.2 The influence of substrate ratio of on the reaction

2.3 反應(yīng)溫度對酶促柚皮苷酯化的影響

反應(yīng)溫度是影響酶促反應(yīng)的一大重要因素.當(dāng)溫度過高時，酶容易受熱變性造成活力下降；當(dāng)溫度過低時，酶活力小，導(dǎo)致反應(yīng)速度慢.一種酶的最適溫度不是完全固定的，它與作用時間長短有關(guān)，反應(yīng)時間增長時，最適溫度向數(shù)值較低的方向移動.因此，實驗研究了酶促柚皮苷酯化反應(yīng)的最適溫度，研究了40，45，50，52，55 ℃條件下反應(yīng)的進(jìn)行情況，實驗結(jié)果如圖3所示.研究發(fā)現(xiàn)溫度在52 ℃時，反應(yīng)的產(chǎn)率最好，此時如果溫度繼續(xù)升高，酶失去活力，導(dǎo)致產(chǎn)率明顯下降，所以表明該實驗的最適溫度為52 ℃.

圖3 反應(yīng)溫度比對柚皮苷酯化反應(yīng)的影響Fig.3 The influence of reaction temperature on the reaction

2.4 反應(yīng)時間對酶促柚皮苷酯化的影響

本實驗在n(月桂酸乙烯酯)∶n(柚皮苷)=7∶1，溶劑為V(叔戊醇)∶V(DMSO)=6∶1，反應(yīng)溫度為52 ℃，脂肪酶TL IM催化下的搖床中進(jìn)行酯化反應(yīng).不同時間的實驗結(jié)果如圖4所示，實驗數(shù)據(jù)表明，反應(yīng)隨著時間的延長，產(chǎn)率逐漸變高，反應(yīng)12 h后，反應(yīng)的產(chǎn)率幾乎沒有變化，說明12 h反應(yīng)已完全，產(chǎn)率達(dá)到85%.

圖4 反應(yīng)時間對柚皮苷酯化反應(yīng)的影響Fig.4 The influence of reaction time on the reaction

3 柚皮苷區(qū)域選擇性酯化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

本實驗介紹的是柚皮苷與乙烯酯類化合物(乙酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯)在搖床中脂肪酶催化的酯化反應(yīng).經(jīng)柱層析分離提純得到3個酯化產(chǎn)物，并且每個化合物都通過1H NMR，13C NMR，ESI-MS等表征數(shù)據(jù)分析及驗證.

柚皮苷和乙酸乙烯酯酯化反應(yīng)為

6″-O-乙酰基-柚皮苷(Ⅲ)：黃色粉末，熔點127～128 ℃，Rf=0.30；1H NMR(DMSO-d6,δ,ppm):12.04(s,H5)，9.62(s，H4′)，7.33(d，2H，J=8.5 Hz，H2′and H6′)，6.79(d，2H，J=8.5 Hz，H3′and H5′)，6.11(d，2H，J=25.5 Hz，H6and H8)，5.49(m，1H，H2)，5.44(m,1H,H1″)，5.41(m，1H，2?-OH of naringin)，5.17(m，1H，H1?)，5.10(d，1H，J=5.1 Hz，4?-OH of naringin)，4.74(d，1H，J=4.8 Hz，4″-OH of naringin)，4.69(d，1H，J=4.4 Hz，3″-OH of naringin)，4.50(d，1H，J=5.8 Hz，3?-OH of naringin)，4.26(d，1H，J=11.9 Hz，H-6″acylated)，4.04(m，1H，H6″acylated)，3.73～3.16(8H，H of rhamnoglucosyl)，3.22(m，1H，H3)，2.73(d，1H，J=3.2 Hz，H3)，1.97

(m，3H，COCH3)，1.19(m，3H of CH3of rhamnosyl)；13C NMR (DMSO-d6，δ，ppm)：18.2(C-6?)，22.7(COCH3)，42.2(C-3)，63.3(C-6″)，68.5(C-5?)，70.5(C-4″)，70.1 and 70.6(C-2? and C-3?)，71.9(C-5″)，73.8(C-4?)，76.2(C-2″)，77.0(C-3″)，78.7(C-2)，95.8(C-6)，96.6(C-8)，97.5(C-1″)，100.7(C-1?)，104.5(C-10)，115.9(C-3′ and C-5′)，126.9(C-1′)，128.6(C-2′ and C-6′)，158.2(C-4′)，163.5(C-9)，164.8(C-5)，168.8(C-7)，170.45(C=O)，197.5(C-4)；IR(KBr, cm-1)：3 408(OH)，1 736(C=O)，1 640(C=C)；ESI-MS(m/z)：657(M1+2H2O-H)-，M1為6″-O-乙酰基-柚皮苷的摩爾質(zhì)量.

柚皮苷和月桂酸乙烯酯酯化反應(yīng)為

6″-O-月桂酰-柚皮苷(Ⅲ)：黃色粉末，熔點108～110 ℃，Rf=0.45；1H NMR(DMSO-d6，δ，ppm)：12.04(s，H5)，9.62(s，H4′)，7.33(d，2H，J=8.5 Hz，H2′and H6′)，6.79(d，2H，J=8.5 Hz，H3′and H5′)，6.11(d，2H，J=25.5 Hz，H6and H8)，5.49(m，1H，H2)，5.44(m，1H，H1″)，5.41(m，1H，2?-OH of naringin)，5.17(m，1H，H1?)，5.10(d，1H，J=5.1 Hz，4?-OH of naringin)，4.74(d，1H，J=4.8 Hz，4″-OH of naringin)，4.69(d，1H，J=4.4 Hz，3″-OH of naringin)，4.50(d，1H，J=5.8 Hz，3?-OH of naringin)，4.26(d，1H，J=11.9 Hz，H6″acylated)，4.04(m，1H，H6″acylated)，3.73～3.16(8H，H of rhamnoglucosyl)，3.22(m，1H，H3)，2.73(d，1H，J=3.2 Hz，H3)，2.22(m，2H，CH2CO)，1.49(m，3H of CH3of rhamnosyl)，1.26

(m，18H of (CH2)9of lauroyl)，0.85(t，3H，J=7.0 Hz, CH3)；13C NMR(DMSO-d6，δ，ppm)：14.4(CH3)，18.2(C-6?)，22.7～31.8(COCH2(CH2)9CH3)，33.8(COCH2)，42.2(C-3)，63.3(C-6″)，68.5(C-5?)，70.5(C-4″)，70.9 and 71.2(C-2? and C-3?)，71.9(C-5″)，73.8(C-4?)，76.2(C-2″)，77.0(C-3″)，78.7(C-2)，95.8(C-6)，96.6(C-8)，97.5(C-1″)，100.7(C-1?)，104.5(C-10)，115.9(C-3′ and C-5′)，126.9(C-1′)，128.6(C-2′ and C-6′)，158.2(C-4′)，163.5(C-9)，164.8(C-5)，168.8(C-7)，173.5(C=O)，197.5(C-4)；IR(KBr, cm-1)：3 415(OH)，1 738(C=O)，1 647(C=C)；ESI-MS(m/z)：797(M1+2H2O-H)-，M1為6″-O-月桂酰-柚皮苷的摩爾質(zhì)量.

柚皮苷和棕櫚酸乙烯酯酯化反應(yīng)為

6″-O-棕櫚酰-柚皮苷(Ⅲ)：黃色粉末，熔點65～67 ℃，Rf=0.48；1H NMR(DMSO-d6，δ，ppm)；12.04(s，H5)，9.62(s，H4′)，7.33(d，2H，J=8.5 Hz，H2′and H6′)，6.79(d，2H，J=8.5 Hz，H3′and H5′)，6.11(d，2H，J=25.5 Hz，H6and H8)，5.49(m，1H，H2)，5.44(m，1H，H1″)，5.41(m，1H, 2?-OH of naringin)，5.17(m，1H，H1?), 5.10(d，1H，J=5.1 Hz，4?-OH of naringin)，4.74(d，1H，J=4.8 Hz，4″-OH of naringin)，4.69(d，1H，J=4.4 Hz，3″-OH of naringin)，4.50(d，1H，J=5.8 Hz，3″-OH of naringin)，4.26(d，1H，J=11.9 Hz，H6″acylated)，4.04(m，1H，H6″acylated)，3.73～3.16(8H，H of rhamnoglucosyl)，3.22(m，1H，H3)，2.73(d，1H，J=3.2 Hz，H3)，2.22(m，2H，CH2CO)，1.49(m，3H of CH3of rhamnosyl)，1.24(m，26H of (CH2)13of palmitoyl)，0.85(t，3H，J=7.0 Hz，CH3)；13C NMR(DMSO-d6，δ，ppm)：14.4(CH3)，18.2(C-6?)，22.6～31.8(COCH2(CH2)CH3)，33.9(COCH2)，42.3(C-3)，63.3(C-6″)，68.5(C-5?)，70.5(C-4″)，70.9 and 71.2(C-2?and C-3?)，71.9(C-5″)，73.8(C-4?)，76.2(C-2″)，77.0(C-3″)，78.7(C-2)，95.8(C-6)，96.6(C-8)，97.5(C-1″)，100.7(C-1?)，104.5(C-10)，115.9(C-3′ and C-5′)，126.9(C-1′)，128.6(C-2′ and C-6′)，158.2(C-4′)，163.6(C-9)，164.9(C-5)，168.8(C-7)，173.5(C=O)，197.5(C-4)；IR(KBr, cm-1)：3 415(OH)，1 740(C=O)，1 643(C=C)；ESI-MS(m/z)：853(M1+2H2O-H)-，M1為6″-O-棕櫚酰-柚皮苷的摩爾質(zhì)量.

4 結(jié) 論

本實驗主要研究了固定化脂肪酶TL IM催化柚皮苷與乙烯酯類化合物酯化反應(yīng)的新方法，并對該反應(yīng)的最適條件進(jìn)行了研究.脂肪酶TL IM是一種成本低、反應(yīng)條件溫和及催化效果好的固定化酶，而且后期處理簡便，環(huán)境污染小，符合現(xiàn)代生產(chǎn)理念和趨勢，廣泛應(yīng)用于有機(jī)綠色化學(xué)反應(yīng).與先前文獻(xiàn)報道相比，本實驗首次把脂肪酶TL IM應(yīng)用于催化

柚皮苷與乙烯酯類化合物的酯化反應(yīng)，獲得了較高的產(chǎn)率.

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A study on lipase catalyzed esterification of naringin

DU Lihua, XU Liangliang, CHENG Bingzhuo

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

In order to increase the fat-soluble of naringin which can make it obtain better bioavailability, vinyl esters (vinyl acetate, vinyl laurate, vinyl palmitate) were as the acyl donor to attack the naringin, the selective esterification were catalyzed by lipase TL IM from thermomyces lanuginosus. The volume ratio of solvents, mole ratio of substrate, temperature and time of the reaction were taken as the influence factors and explored systematically. As a result, all of factors can influence the reaction in different degrees and under the optimum condition the yield can reach about 85%.

naringin; esterification reaction; lipase; catalyze

(責(zé)任編輯：劉 巖)

2016-05-17

國家自然科學(xué)基金資助項目(21306172)；國家948計劃資助項目(2014-4-29)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY17B020010)；浙江省公益農(nóng)業(yè)計劃項目(2014C32094)

杜理華(1979—)，女，河南安陽人，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為藥物合成新技術(shù)，E-mail：orgdlh@zjut.edu.cn.

R931.6

A

1006-4303(2017)01-0051-05