劉 峰， 龔德才

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 科技史與科技考古系文物保護科學(xué)基礎(chǔ)研究中心，合肥 230026)

研究與技術(shù)

蠶絲蛋白殘留物提取與鑒定方法的改進研究

劉 峰， 龔德才

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 科技史與科技考古系文物保護科學(xué)基礎(chǔ)研究中心，合肥 230026)

考古遺址土壤中的古代絲綢殘留物提取與蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定分析，可以為絲綢起源等考古學(xué)研究提供重要的信息。針對樣品透析可能存在小分子蛋白殘留物流失的問題，以六安戰(zhàn)國荒帷絲綢樣品為研究對象，通過改變透析膜的截留分子量(MWCO)來優(yōu)化提取方法。應(yīng)用尺寸排阻色譜(SEC)分析兩種透析方法，得到蠶絲蛋白提取液的相對分子質(zhì)量分布，并比較兩種透析方法對蠶絲蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果的影響。SEC結(jié)果顯示，LA2000樣品中保留更多的相對分子質(zhì)量較小的蛋白殘留物。經(jīng)過生物質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫比對后，LA14000樣品中只檢測到來自絲素蛋白重鏈亞基的4種不同的多肽片段，而LA2000樣品中則檢測到7種。說明改進后的方法可以顯著提高古代蠶絲蛋白的提取效率，從而增強生物質(zhì)譜鑒定方法的準(zhǔn)確性和靈敏度。

蠶絲蛋白；殘留物；透析；生物質(zhì)譜；六安荒帷

絲綢的發(fā)明在中國輝煌燦爛的歷史文化中有著舉足輕重的地位，對促進世界文明的發(fā)展有著突出的貢獻。研究分析古代絲綢殘留物能夠提供豐富的信息，對考古學(xué)研究尤其是蠶桑農(nóng)業(yè)起源等問題具有十分重要的意義[1]。但是，絲綢的原料為蠶絲蛋白，在數(shù)千年的地下埋藏過程中很容易發(fā)生降解而難以保存下來。如何在絲綢蛋白降解嚴(yán)重的情況下鑒定絲綢存在的證據(jù)，成為研究早期絲綢的關(guān)鍵問題。在這種情況下，生物質(zhì)譜技術(shù)為解決這一問題提供了可能。

目前，生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個重要組成部分。在古蛋白殘留物的研究方面，雖然生物質(zhì)譜技術(shù)尚屬于新興技術(shù)，但已經(jīng)得到了一些有價值的科研成果，例如，Solazzo等[2]利用肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting)對銅器表面礦化紡織品殘留物的鑒定分析，證明了這一方法在蛋白質(zhì)類紡織品材質(zhì)鑒定中的可靠性；Nirmala等[3]利用生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定了繭絲中的數(shù)條相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)，表明這一方法也適用于蠶絲蛋白的相關(guān)研究。但對古代蠶絲蛋白殘留物的生物質(zhì)譜鑒定分析研究，目前比較匱乏，仍然處于方法的探索和優(yōu)化階段。

李力[1]在博士論文《賈湖遺址墓葬土壤中蠶絲蛋白殘留物的鑒定與分析》中建立了一套基于生物質(zhì)譜檢測和生物信息學(xué)分析的蠶絲蛋白殘留物提取與鑒定基本實驗流程，并通過這一方法成功從賈湖先民遺骸下腹部土壤中鑒定出了多條蠶絲絲素蛋白重鏈殘基。但該方法中使用的是截留分子量(MWCO)為14000的透析膜，實驗過程中可能會丟失大量的重要信息，而這也導(dǎo)致了其實驗結(jié)果遭受質(zhì)疑。本研究以此為基礎(chǔ)，以六安戰(zhàn)國荒帷絲綢殘片樣品為研究對象，在不改變該方法的其他條件的前提下，將提取過程中使用的透析膜換為截留分子量較小的透析膜。即將原方法中的MWCO14000換為MWCO2000，通過改變透析膜的MWCO對提取方法的透析脫鹽環(huán)節(jié)進行改進優(yōu)化。采用尺寸排阻色譜(SEC)分析兩種透析方法，得到古代蠶絲蛋白的相對分子質(zhì)量分布，直觀地評價優(yōu)化效果。并分別將改進前后的提取方法得到的蠶絲蛋白提取液進行生物質(zhì)譜分析，從數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果來評價改進效果。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

六安荒帷絲綢殘片樣品(樣品編號LA)，取自安徽省六安市白鷺洲戰(zhàn)國M585墓葬出土荒帷，該墓葬屬于戰(zhàn)國時期墓葬(公元前475—前221)[4]。六安戰(zhàn)國荒帷樣品及掃描電鏡圖如圖1所示。

圖1 六安戰(zhàn)國荒帷樣品及掃描電鏡圖Fig.1 Sample of the silk pall from the Warring States Period in Lu’an city and its SEM picture

試劑：碳酸鈉、氯化鈣、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、疊氮化鈉等均為分析純(上海國藥集團)；尺寸排阻色譜標(biāo)準(zhǔn)品采用一系列單分散聚苯乙烯磺酸鈉鹽，相對分子質(zhì)量分別為4300、6800、17000、32000、77000，純度為色譜純(Sigma-Aldric公司)；質(zhì)譜分析中使用洗脫溶液為色譜純級甲醇及甲酸溶液(Sigma-Aldric公司)。

鈣醇溶液：氯化鈣、乙醇、水按摩爾比1︰2︰8配制而成[5]，用于溶解蠶絲蛋白。

主要儀器：真空濃縮儀(Concentrator Plus，德國Eppendorf公司)，透析袋(截留分子量2000和14000)，Amicon-Ultra-15超濾管、LTQ-Qrbitrap XL質(zhì)譜儀(美國熱電)。

尺寸排阻色譜儀系統(tǒng)包含以下幾個部分：高效液相色譜泵(LC-20AT，島津)，柱溫箱(CTO-20A，島津)，紫外檢測器(SPD-20A，島津)，三根色譜柱(PROTEIN KW-803，shodex)串聯(lián)使用。

1.2 方 法

1.2.1 尺寸排阻色譜

1.2.1.1 流動相

磷酸二氫鈉(80.8 g)、磷酸二氫鉀(35.2 g)和疊氮化鈉(4.0 g)溶于500 mL超純水中，作為儲備液。取50 mL儲備液稀釋至2 000 mL作為尺寸排阻色譜流動相。

1.2.1.2 色譜條件

進樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動相流速1 mL/min，檢測波長210 nm。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測

分別稱取一系列單分散聚苯乙烯磺酸鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)品0.003～0.004 g，溶于5 mL流動相溶液中[6]。將標(biāo)樣進樣檢測制作校正曲線。

1.2.2 不同截留分子量透析袋透析效果比較

分別稱取兩份六安荒帷絲綢殘片樣品各1 mg(分別編號LA2000和LA14000)，用去離子水清洗，去除表面污染物，低溫烘干。將清洗后的樣品加入預(yù)先配置好的0.5%Na2CO3水溶液中(水浴比1︰100)，95 ℃水浴脫膠30 min，重復(fù)一次后，用去離子水清洗，低溫烘干。

烘干后取相同質(zhì)量的絲綢殘片分別放入2 mL預(yù)先配好的鈣醇溶液中，95 ℃加熱至完全溶解。將LA2000溶液使用截留分子量2000的透析袋透析24 h(每4 h更換一次去離子水)。將LA14000溶液使用截留分子量14000的透析袋透析24 h(每4 h更換一次去離子水)。

將透析后的LA2000和LA14000溶液用45 μm纖維素微孔濾膜過濾，濃縮至100 μL，取50 μL進行尺寸排阻色譜檢測。

1.2.3 生物質(zhì)譜檢測結(jié)果比較

分別取蛋白提取液50 μL，加入1 μg胰凝乳蛋白酶，25 ℃恒溫過夜(16～20 h)。在10 000 r/min下離心10 min，取上清液。

分別取10 μL上清液注入毛細管柱中，以600 nL/min的速度進行梯度洗脫分離(洗脫溶液A為添加有0.1%甲酸的純水溶液，溶液B為色譜純級甲醇)。分離使用二氧化硅C18反向?qū)游雒毠苤Ｌ荻认疵摲蛛x后樣品進入質(zhì)譜儀，使用正離子模式，離子阱分辨率為60 000。每次掃描取強度最高的5個母離子進行二級質(zhì)譜檢測，每隔90 s會將之前掃描過的高強度離子進行動態(tài)淘汰。為了消除樣品間可能存在的殘留污染，每次實驗前均添加空白對照。

使用Proteome Discoverer 1.2 (ThermoFisher Scientific)軟件分析獲得的數(shù)據(jù)。軟件選取SEQUEST算法對各數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)庫比對。所使用的數(shù)據(jù)庫來自National Center for Biotechnology Information(NCBI)，為B.mori.fasta 和fibroin.fasta (B.mori.fasta：發(fā)布日期01/10/2012；fibroin.fasta：發(fā)布日期01/10/2012)。對于每一個多肽的母離子其絕對質(zhì)量誤差應(yīng)<3×10-6，對應(yīng)的二級碎片離子的質(zhì)量誤差應(yīng)<0.8 Da。除特殊情況，所有被認(rèn)同的SEQUEST輸出結(jié)果其Δscore均應(yīng)≥0.1。

將檢測結(jié)果上傳至NCBI進行BLAST(basic local alignment search tool)檢索以確認(rèn)其來源。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同截留分子量透析袋透析效果比較

對LA2000和LA14000樣品采用相同的實驗條件進行SEC檢測，得到如圖2所示的檢測結(jié)果。

圖2 六安荒帷絲綢樣品蠶絲蛋白SEC檢測結(jié)果Fig.2 SEC detection result of fibroin fromLu’an silk pall samples

根據(jù)SEC校正曲線對兩個古代樣品的檢測結(jié)果進行平均相對分子質(zhì)量計算，得到結(jié)果如表1所示。

表1 LA樣品的蠶絲蛋白相對分子質(zhì)量Tab.1 Relative molecular weight of fibroin fromLA silk pall samples

尺寸排阻色譜的原理是根據(jù)不同相對分子質(zhì)量的保留時間不同而進行相對分子質(zhì)量的測定，相對分子質(zhì)量大的大分子較快通過凝膠色譜柱進入檢測器當(dāng)中，保留時間較短，同理相對分子質(zhì)量越小的分子則保留時間越長。如圖2所示，分別采用截留分子量2000和截留分子量14000的透析膜透析的相同樣品，經(jīng)過24 h透析后，LA2000與LA14000相比，在保留時間30 min之前的相對分子質(zhì)量較大的區(qū)域內(nèi)的含量基本相同，而在30 min之后的小分子區(qū)域的含量，LA2000樣品則明顯多于LA14000樣品。這說明溶解得到的六安荒帷絲綢蠶絲蛋白提取液中一部分蛋白分子已經(jīng)降解至相對分子質(zhì)量14000之下，所以采用截留分子量較小的透析袋透析可以獲得更多的小分子蛋白殘留物。從表1的結(jié)果同樣可以說明這一結(jié)論，由于LA2000樣品中包含更多的相對分子質(zhì)量較小的蛋白分子，所以拉低了LA2000樣品的平均相對分子質(zhì)量，使得LA2000樣品的數(shù)均相對分子質(zhì)量和重均相對分子質(zhì)量皆小于LA14000樣品。

透析袋的截留分子量的選擇對于最后提取到的殘留物蛋白含量的影響是非常明顯的。古代文物樣品經(jīng)歷了上千年的地下埋藏，受到各種環(huán)境因素影響而降解嚴(yán)重，蠶絲蛋白經(jīng)過降解相對分子質(zhì)量嚴(yán)重下降。所以在透析脫鹽過程中如果采用截留分子量較大的透析袋，則會使得溶液中的小分子蛋白透析出去而大量流失，這部分蛋白信息的流失則會嚴(yán)重影響最后的生物質(zhì)譜檢測結(jié)果。所以，經(jīng)過對比研究發(fā)現(xiàn)，對于降解嚴(yán)重的古代絲綢樣品(如六安荒帷絲綢殘片樣品)，大部分的蠶絲蛋白已經(jīng)降解至相對分子質(zhì)量14000以下。對于此類樣品的提取，采用截留分子量2000的透析袋可以大幅度提高提取效率。

2.2 六安荒帷絲綢殘片樣品生物質(zhì)譜檢測結(jié)果比較

六安荒帷樣品為絲綢殘片，雖然保留了一定的蠶絲纖維形態(tài)，但保存狀況較差，絲綢纖維的強度很低，稍微觸碰便會掉粉掉渣。在脫膠過程中殘片也極為脆弱，很容易破碎變?yōu)榉勰?，所以過程中應(yīng)注意對樣品的回收。由此可以看出，六安戰(zhàn)國荒帷絲綢樣品中的古代蠶絲蛋白已經(jīng)嚴(yán)重老化降解[7-8]。表2和表3分別為LA14000和LA2000的生物質(zhì)譜檢測結(jié)果。

表2 樣品LA14000生物質(zhì)譜檢測結(jié)果Tab.2 Biomass spectrometry result of LA14000 sample

表3 樣品LA2000生物質(zhì)譜檢測結(jié)果Tab.3 Biomass spectrometry result of LA2000 sample

根據(jù)表2的結(jié)果可以看出，在LA14000樣品中共檢測到4種不同的多肽片段，均屬于絲素蛋白重鏈亞基。而根據(jù)表3的結(jié)果判斷，在LA2000樣品中共檢測到7種不同的多肽片段，也全部來自絲素蛋白重鏈亞基。通過比較可以發(fā)現(xiàn)，采用優(yōu)化后的方法可以檢測到更多的多肽片段，得到更豐富的蠶絲蛋白殘留物信息。

在本次實驗中，LA2000樣品共檢測出7種多肽片段，較LA14000樣品多出3種，即GAGAGVGY、GAGAGSGAASGAGAGAGAGTGSSGFGPY和EYAWSSDF。將這三條肽段數(shù)據(jù)上傳至NCBI，使用BLAST檢索對其可能來源進行驗證，結(jié)果如表4所示。

表4 肽段BLAST檢索結(jié)果Tab.4 Blast search result of the peptides

檢測結(jié)果表明，額外檢出的三種多肽片段中，除GAGAGVGY外，另外兩種均單一來源于蠶絲絲素蛋白重鏈亞基。作為對比，在最初檢測出的四條多肽片段中，僅有GAGAGSGAASGAGAGAGAGAGTGSSGFGPY這一種多肽片段單一來源于絲素蛋白重鏈亞基，其余三種均存在多種來源，需進行進一步排除分析才能確定檢測結(jié)果。對于古代絲綢文物樣品，尤其是保存狀況差、降解嚴(yán)重的古代絲綢殘留物樣品的生物質(zhì)譜鑒定，往往由于提取方法的問題而嚴(yán)重影響最后的檢測結(jié)果。目前在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，一般認(rèn)為，通過質(zhì)譜檢測的結(jié)果中出現(xiàn)兩條或兩條以上的多肽來自同一個蛋白時，即可認(rèn)為樣品中含有此蛋白[9]。本實驗中使用改進方法額外檢測出的三種多肽片段，尤其是兩種單一來源的多肽片段，大大提高了檢測結(jié)果的可信度。同時這也表明，實驗中改進原始方法對于絲綢蛋白殘留物的鑒定研究具有很大的幫助，可以使結(jié)論更準(zhǔn)確更具有說服力。

在絲綢的地下埋藏過程當(dāng)中，包裹絲素的可溶性絲膠蛋白首先溶失或降解，使絲素蛋白暴露在環(huán)境當(dāng)中。絲素蛋白中存在著結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)，結(jié)晶區(qū)肽鏈排列緊密，非結(jié)晶區(qū)肽鏈較為松散。在各種環(huán)境因素下，非結(jié)晶區(qū)首先發(fā)生降解，結(jié)晶區(qū)之間連接減少，使得絲素蛋白肽鏈斷裂，相對分子質(zhì)量下降[10]。游離的結(jié)晶區(qū)繼續(xù)降解，使得絲素蛋白殘留物的相對分子質(zhì)量繼續(xù)下降，甚至降解至14000以下。所以，如果選用截留分子量較大的透析膜進行透析，則會使得大量小分子多肽流失，從而影響生物質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

3 結(jié) 論

本研究改進透析袋的截留分子量來優(yōu)化古代蠶絲蛋白殘留物的提取方法，以六安荒帷絲綢殘片樣品為實驗對象，以求達到提高提取效率的目的。采用SEC法研究不同截留分子量透析袋透析后溶液的相對分子質(zhì)量分布，檢測結(jié)果顯示采用MWCO2000比MWCO14000透析后得到的蛋白平均相對分子質(zhì)量更小。從SEC譜圖中也可以明顯地看出，在小分子區(qū)域LA2000樣品的峰高明顯高于LA14000樣品，說明保留了更多小分子蛋白產(chǎn)物。對提取得到的蠶絲蛋白提取液進行特異性酶切和生物質(zhì)譜檢測，結(jié)果顯示，采用優(yōu)化前后的提取方法提取到的樣品中分別檢測到4條和7條特征多肽片段。同時，對特征多肽的BLAST檢索結(jié)果表明，改進后的實驗結(jié)果與原結(jié)果相比可信度有了很大的提高。這一結(jié)果表明優(yōu)化后的提取方法可以提取到更多的蠶絲蛋白殘留物信息，對古代蠶絲蛋白殘留物的鑒定具有十分重要的價值和意義。

總之，通過對蠶絲蛋白生物質(zhì)譜鑒定技術(shù)中蛋白質(zhì)提取環(huán)節(jié)的優(yōu)化，可以顯著增強鑒定技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確性，使得這項技術(shù)更加適用于降解非常嚴(yán)重的古代殘留物樣品，為考古發(fā)掘樣品絲綢殘留物的鑒定研究奠定基礎(chǔ)。

[1]李力.賈湖遺址墓葬土壤中蠶絲蛋白殘留物的鑒定與分析[D].合肥:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué),2015:1-2. LI Li. The Identification and Analysis of the Silk Residues in the Tomb Soils from Jiahu Site[D]. Hefei: University of Science and Technology of China,2015:1-2.

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Improvement research of methods to extract and determine for fibroin residues

LIU Feng, GONG Decai

(Basic Research Center of Heritage Conservation Science, Department of Scientific and Technical History and Archaeology,
University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China)

The extraction and proteomics identification of the ancient fibroin residues in the soil of archaeological site can provide important information for the archaeological study on the origin of silk. Since sample dialysis may has the problem of small molecular protein residue loss, a silk pall sample from the Warring States Period in Lu’an City was applied as research subjects to improve the extraction methods by changing the molecular weight cut off (MWCO) of membranes. Size exclusion chromatography (SEC) was used to analyze the molecular weight distribution of silk protein extracts obtained from two dialysis methods, and the effect of the two dialysis methods on the identification results of silk protein was compared by biomass spectrometry analysis. SEC results show that LA2000 samples retain more protein residues with small molecular weight. After the analysis of biomass spectrometry and database search, only 4 kinds of polypeptide fragments from silk fibroin heavy chain are detected in LA14000 samples, and 7 kinds of polypeptide fragments are detected in LA2000 samples. This indicates that the improved method can significantly improve the extraction efficiency of the ancient silk protein, thus enhancing the accuracy and sensitivity of the biomass spectrometry identification method.

silk fibroin; residues; dialysis; bio-mass spectrometry; silk pall in Lu’an

10.3969/j.issn.1001-7003.2017.02.001

2016-03-17;

2016-12-09

國家文物局文化遺產(chǎn)保護領(lǐng)域科學(xué)和技術(shù)研究項目(2013-YB-HT-029)

劉峰(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為古代殘留物分析研究。通信作者：龔德才，教授，gdclucky@ustc.edu.cn。

TS195.644

A

1001-7003(2017)02-0001-05 引用頁碼: 021101