高羽亭 楊 慧，2

(廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣東 東莞 523808)

PARP-1沉默對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響

高羽亭1楊 慧1，2

(廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣東 東莞 523808)

目的 探討沉默PARP-1對(duì)1，4-苯醌(PBQ)致大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)凋亡的影響。方法 以空載體BMSCs為對(duì)照組，以PARP-1沉默BMSCs為處理組，免疫印跡法檢測(cè)聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)-1蛋白表達(dá)量。磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解PBQ，分別以0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0和320.0 μmol/L PBQ染毒兩組細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果選擇合適染毒濃度后，應(yīng)用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞活力，Annexin V-PE/7-AAD標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)兩組細(xì)胞PARP-1基因表達(dá)。結(jié)果 沉默細(xì)胞PARP-1蛋白表達(dá)量〔(0.15±0.02)倍〕與對(duì)照組細(xì)胞〔(1.00± 0.03)倍〕相比，下降了85%(P<0.05)。PBQ染毒24 h后，相同劑量下兩組細(xì)胞的活力并無(wú)顯著性差異。隨著PBQ染毒劑量增加，兩組細(xì)胞PARP-1表達(dá)水平和凋亡率均明顯增高(P<0.05)，且相同劑量下PARP-1沉默細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05)。結(jié)論 PARP-1沉默BMSCs在PBQ作用下更易發(fā)生凋亡，PARP-1可能參與了PBQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1；1，4-苯醌；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；凋亡

1，4-苯醌(PBQ)又稱對(duì)苯醌，是苯的代謝終產(chǎn)物，在有機(jī)合成工業(yè)中廣泛應(yīng)用。PBQ作用于骨髓，能引起造血功能損害并導(dǎo)致白血病，但其毒性作用機(jī)制尚不完全清楚〔1〕。PBQ在體內(nèi)能通過(guò)形成多種DNA加合物誘導(dǎo)遺傳突變的產(chǎn)生，也能夠促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡〔2，3〕。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)作為真核細(xì)胞中的一種核酶，也是細(xì)胞凋亡核心成員caspase 的底物，在細(xì)胞凋亡中具有重要作用〔4〕。細(xì)胞DNA因環(huán)境不良因素作用損傷后，PARP-1能感受和傳遞DNA損傷信息，調(diào)控細(xì)胞的損傷修復(fù)〔5〕。本研究探討PARP-1在PBQ誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 PBQ、噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司)；Annexin V-PE/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(立陶宛Fementas公司)；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(德國(guó)Roche公司)；TRIzol Reagent (美國(guó)Invitrogene公司)；兔抗PARP-1一抗(美國(guó)Abcom公司)，鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國(guó)Santa cruz公司)；低糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 BMSCs細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠BMSCs細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存，以1×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、100%濕度條件下培養(yǎng)。

1.3 PARP-1沉默BMSCs細(xì)胞模型 PARP-1沉默BMSCs細(xì)胞由前期研究建立〔6〕。以空載體BMSCs(shRNA-CTR)細(xì)胞為對(duì)照組，以PARP-1沉默BMSCs細(xì)胞(PARP-1-shRNA)為處理組。

1.4 PBQ染毒劑量的選擇及細(xì)胞活力測(cè)定 shRNA-CTR和PARP-1-shRNA細(xì)胞按4×103個(gè)/孔接種于96孔板，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將PBQ配成系列終濃度，分別為0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0和320.0 μmol/L，體積為100 μl/孔，染毒24 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，4 h后吸出液體，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min后測(cè)定吸光度(A)值。細(xì)胞活力(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組) /(APBS組-A空白組)×100%。每個(gè)劑量設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) PARP-1-shRNA和shRNA-CTR細(xì)胞按4×105個(gè)/孔接種于6孔板中，貼壁后分別給予0、10.0、20.0、40.0 μmol/L PBQ進(jìn)行染毒。具體操作見(jiàn)文獻(xiàn)〔8〕。

1.6 PARP-1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

1.6.1 細(xì)胞總RNA提取 PARP-1-shRNA和shRNA-CTR細(xì)胞按4×105個(gè)/孔接種于 6孔板中，貼壁后給予0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L PBQ染毒24 h，TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè) PARP-1表達(dá) 以制備的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，qRT-PCR檢測(cè)PARP-1表達(dá)水平。PCR引物由上海英駿生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。用2-△△CT法定量分析，采用比較Ct值法，以管家基因ACTB為內(nèi)參基因，倍數(shù)改變=2-△△CT，其中△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)-△CT對(duì)照，△CT=CTPARP-1-CTACTB，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列

1.7 免疫印跡 細(xì)胞裂解液冰浴細(xì)胞5 min，提取總蛋白，Bradford法蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟丙烯(PVDF)膜，封閉0.5 h，一抗4℃過(guò)夜、洗脫，二抗孵育1 h、洗脫。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影X線膠片暗室曝光，掃描底片后定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0軟件進(jìn)行方差分析，t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 PARP-1沉默細(xì)胞的鑒定 PARP-1-shRNA細(xì)胞PARP-1蛋白表達(dá)量為(0.15±0.02)倍，比shRNA-CTR細(xì)胞〔(1.00 ± 0.03)倍〕下降了85%(P<0.05)，表明本實(shí)驗(yàn)室建立的細(xì)胞PARP-1沉默效果良好。見(jiàn)圖1。

圖1 shRNA-CTR和PARP-1-shRNA細(xì)胞中PARP-1蛋白的表達(dá)水平

2.2 PBQ染毒劑量的選擇及細(xì)胞活力測(cè)定 要保證細(xì)胞活力在75%以上，染毒劑量不能超過(guò)40 μmol/L。當(dāng)染毒劑量一定時(shí)，兩組細(xì)胞的活力并無(wú)顯著性差異。說(shuō)明PARP-1沉默對(duì)于細(xì)胞的活力無(wú)明顯影響。見(jiàn)圖2。

圖2 不同劑量PBQ染毒24 h后細(xì)胞活力變化

2.3 PBQ作用下細(xì)胞中PARP-1基因表達(dá) 隨著PBQ染毒劑量增加，兩種細(xì)胞PARP-1表達(dá)水平均呈上升的趨勢(shì)。當(dāng)染毒劑量為40.0 μmol/L時(shí)，兩組細(xì)胞PARP-1 mRNA的表達(dá)水平均達(dá)到最高。見(jiàn)圖3。

與PBS對(duì)照組比較:1)P<0.05;與相同處理組shRNA-CTR比較:2)P<0.05；下表同圖3 兩種細(xì)胞PBQ作用24 h后PARP-1mRNA表達(dá)水平

2.4 PBQ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用 隨著PBQ濃度增高，兩種細(xì)胞的凋亡率均逐漸升高。PBQ 10.0～40.0 μmol/L時(shí)，兩種細(xì)胞凋亡率比PBS對(duì)照組均明顯增高(P<0.05)；且相同劑量組的兩種細(xì)胞比較，PARP-1-shRNA比shRNA-CTR細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同劑量PBQ作用24 h后兩種細(xì)胞凋亡率的 變化

3 討 論

作為造血微環(huán)境的主要成分，BMSCs功能和結(jié)構(gòu)的完整性對(duì)于保持機(jī)體造血的穩(wěn)定性十分重要〔8〕。長(zhǎng)期接觸苯可增加患急性髓系白血病或再生障礙性貧血的風(fēng)險(xiǎn)。PBQ是苯在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，也是苯發(fā)揮毒性作用的關(guān)鍵物。研究發(fā)現(xiàn)，PBQ能夠抑制DNA 的復(fù)制，誘導(dǎo)DNA 單鏈的斷裂并可誘發(fā)癌變〔9〕。熊夢(mèng)禎等〔2〕報(bào)道，PBQ能誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)發(fā)生凋亡，且凋亡率隨著PBQ染毒濃度增高而升高。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明PBQ能誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞發(fā)生DNA的損傷。

作為DNA 損傷的分子感受器，PARP-1被抑制后能影響其與DNA斷端的結(jié)合，導(dǎo)致其喪失損傷修復(fù)能力〔10〕。本文結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)室建立的大鼠PARP-1沉默細(xì)胞株抑制PARP-1基因表達(dá)效果良好。PARP-1-shRNA在染毒劑量10.0～40.0 μmol/L時(shí)，凋亡率明顯升高，且在同一劑量組凋亡率比shRNA-CTR細(xì)胞明顯升高。說(shuō)明PAPR-1沉默BMSCs細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力明顯減弱，對(duì)環(huán)境有害因素更敏感。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PARP-1可能參與了PBQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。DNA損傷后修復(fù)不迅速會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，修復(fù)不正確會(huì)導(dǎo)致基因變異，誘發(fā)癌癥。PARP-1表達(dá)水平將影響DNA損傷修復(fù)的結(jié)局。Ling等〔11〕報(bào)道，PARP-1參與了DNA修復(fù)和細(xì)胞死亡等，PARP-1表達(dá)增高有利于DNA損傷的修復(fù)。雖然沉默細(xì)

胞中PARP-1本底值較低，PBQ仍能誘導(dǎo)其表達(dá)，但由于其水平較低，會(huì)影響DNA損傷的修復(fù)。也有研究表明，由于PAPR-1沉默會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞喪失部分修復(fù)能力和誘導(dǎo)細(xì)胞死亡能力，在環(huán)境有害因素作用下，帶有堿基損傷的細(xì)胞可能發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而生成腫瘤〔12〕。

綜上，PBQ能誘導(dǎo)BMSCs發(fā)生凋亡，PARP-1沉默BMSCs在PBQ作用下更易發(fā)生凋亡，PARP-1可能參與了PBQ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但PARP-1參與該凋亡過(guò)程的具體機(jī)制仍待深入研究。

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〔2016-01-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

廣東醫(yī)科大學(xué)科研基金(No.2XB13012)

高羽亭(1982-)，女，博士，講師，主要從事衛(wèi)生毒理學(xué)、間充質(zhì)干細(xì)胞研究。

R33

A

1005-9202(2017)03-0575-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.022

1 東莞市環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2 廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心