文雪梅 陳 瑛 李 婷 宋雪妮 王 妮

(西藏民族大學附屬醫(yī)院婦產科，陜西 咸陽 712082)

白花蛇舌草對宮頸癌細胞增殖、凋亡及Ki-67表達的影響

文雪梅 陳 瑛1李 婷2宋雪妮3王 妮3

(西藏民族大學附屬醫(yī)院婦產科，陜西 咸陽 712082)

目的 探討白花蛇舌草對Hela細胞增殖、凋亡及Ki-67表達的影響。方法 運用動物血清學方法制備白花蛇舌草藥物血清，MTT檢測白花蛇舌草血清濃度為10%、20%、40%，作用時間為24、48、72 h后的Hela細胞的存活率，并計算藥物的抑制率。原位末端標記法(TUNEL)檢測白花蛇舌草血清濃度為10%、20%、40%，作用時間為24、48、72 h后的Hela細胞的凋亡率，進一步驗證白花蛇舌草抑制宮頸癌細胞增殖是否與促進細胞凋亡有關。RT-PCR檢測白花蛇舌草血清濃度為10%、20%、40%，作用時間為24、48、72 h后的Hela細胞中Ki-67 mRNA水平。免疫組化檢測白花蛇舌草血清濃度為10%、20%、40%，作用時間為24、48、72 h后的Hela細胞中抗原Ki-67的表達情況。結果 白花蛇舌草藥物血清作用后的Hela細胞與對照組相比細胞生長增殖明顯受到抑制，隨著藥物作用濃度和藥物作用時間的增加，Hela細胞抑制率也明顯增加。TUNEL檢測結果顯示，白花蛇舌草藥物血清作用后的Hela細胞凋亡率比對照組增多，藥物作用濃度越高，凋亡率也越高；藥物作用時間越長，凋亡率越高。RT-PCR結果顯示，與對照組相比，白花蛇舌草藥物血清作用后的Hela細胞中Ki-67 mRNA的表達量隨著作用時間和作用濃度的增加而減小。免疫組化結果顯示，白花蛇舌草藥物血清作用后的Hela細胞中抗原Ki-67的表達量與對照組相比明顯降低。白花蛇舌草藥物血清可以明顯降低Hela細胞中Ki-67的表達。結論 白花蛇舌草對宮頸癌細胞Hela的增殖具有抑制作用，可以促進細胞凋亡，抑制Ki-67基因表達。

白花蛇舌草；宮頸癌；增殖；凋亡

手術治療、放射治療和化學療法是目前常用的治療宮頸癌的方法，但這些治療方法效果具有局限性，預后差〔1〕。白花蛇舌草是一種我國傳統(tǒng)的中草藥，具有抗腫瘤作用〔2〕，在臨床上已經(jīng)得到廣泛應用，多用于治療支氣管癌、直腸癌、淋巴癌、鼻咽癌等。但目前對白花蛇舌草抗宮頸癌的作用機制尚未研究。Ki-67基因表達與癌細胞增殖有密切關系，在癌細胞增殖分化過程中具有重要意義，編碼的Ki-67蛋白是癌細胞增殖過程中必需的一種DNA結合蛋白〔3〕。本研究利用動物血清學原理制備了白花蛇舌草藥物血清，與宮頸癌Hela細胞作用后，觀察細胞增殖分化及凋亡情況，并分析Ki-67 mRNA水平，初步探討白花蛇舌草對宮頸癌細胞增殖分化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 Hela細胞本實驗室保存，成年雌性SD大鼠20只購于中科院上海實驗動物中心，鼠齡為90日齡，體重260～290 g。主要儀器和試劑：酶標儀(美國sigma)，水浴鍋(蘇州精密儀器公司)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，PCR儀(美國PE)，倒置顯微鏡(日本尼康)，離心機(上海醫(yī)用設備廠)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國Sigma)，PBS(鼎國生物試劑有限公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青有限公司)，MTT(碧云天生物技術有限公司)，青鏈霉素(美國Sigma)，胰蛋白酶(美國Sigma)，反轉錄試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，細胞RNA提取試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，TUNEL試劑盒(北京中山生物科技有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma)，Ki-67單克隆抗體(北京中山生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Hela細胞用含有10% FBS的RPMI1640細胞生長液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞傳代用0.125%的胰蛋白酶消化。

1.2.2 制備白花蛇舌草血清 取300 g白花蛇舌草加入1 000 ml水中，小火煎制2 h，棄渣后濃縮為300 ml，配制成白花蛇舌草的灌胃水。每天給予20只成年雌性大鼠2次灌胃，每次4 ml，持續(xù)給藥3 d。第3天給藥后1 h用乙醚麻醉大鼠，在大鼠腹主動脈處采血，1 500 r/min離心10 min，分離的血清滅活后分別稀釋含藥血清倍數(shù)為10、5、2.5倍，制成濃度10%、20%、40%的白花蛇舌草血清，分裝，保存于4℃冰箱備用。

1.2.3 噻唑藍(MTT)法檢測Hela細胞增殖 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的宮頸癌Hela細胞，棄去細胞生長液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入胰蛋白酶消化細胞后，1 000 r/min離心10 min，棄酶消化液，加PBS重懸細胞，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入細胞生長液，在顯微鏡下調整細胞濃度為6×104個/ml，取混合均勻的細胞懸浮液100 μl接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，將細胞培養(yǎng)板置于5%CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)時間大約為24 h，觀察細胞貼壁后，分別在細胞中加入白花蛇舌草血清。實驗組中加入終濃度為10%、20%、40%的白花蛇舌草血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為24、48、72 h。為了減小誤差，每組設置8個復孔，同時設置陰性對照組和空白組，陰性對照組中不加含藥血清，只加入等量的細胞生長液；空白組中無細胞加入等量的含藥血清。含藥血清作用時間結束后，在細胞中加入體積20 μl、濃度5 mg/ml的MTT溶液，置于37℃反應4 h，棄含藥培養(yǎng)基后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液，避光條件孵育充分反應10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測492 nm處各孔的吸光度(OD值)，計算每組Hela細胞抑制率。

存活率=100%×(實驗組OD值-空白組OD值)/(陰性對照組OD值-空白組OD值)。抑制率=1-細胞存活率。

1.2.4 原位末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡 終濃度為10%、20%、40%的白花蛇舌草血清與Hela細胞作用24、48、72 h后，用濃度為4%的多聚甲醛在室溫下固定細胞30 min，吸除上清，加入適量的PBS洗滌細胞3次，每次3 min，加入3%的H2O2甲醇阻斷劑，孵育30 min，阻斷內源性氧化物酶，PBS洗片。加入含有0.1%TritonX-100的枸櫞酸鈉溶液作為通透液，放置于冰盒中孵育2 min，小心吸除液體，加入轉化劑POD 50 μl，蓋上蓋玻片，37℃于濕盒中反應30 min，洗片。加入100 μl顯色劑二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，在室溫下結合反應15 min，酒精脫水后用二甲苯透明封片。同時設置對照組。顯微鏡下觀察細胞核為棕紅色為陽性，計算凋亡率。凋亡率的計算方法：胞核為紅棕色的細胞數(shù)與總細胞的數(shù)量百分比。

1.2.5 RT-PCR檢測藥物作用細胞后Ki-67 mRNA水平 對數(shù)生長期的Hela細胞經(jīng)終濃度為10%、20%、40%的白花蛇舌草血清培養(yǎng)基作用24、48、72 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，放置于冰上，加入300 μl冰預冷的勻漿液變性，移液槍緩慢吹打細胞，觀察細胞裂解后，轉移至EP管中，加入2 mol/L的pH4.0的醋酸鈉溶液60 μl，上下顛倒EP管5次混勻，再加入600 μl的氯仿和酚的混合液，上下顛倒EP管5次混勻，在振蕩器上震蕩15 s。放置于4℃孵育15 min，4℃，14 000 r/min離心20 min。吸取水相層至新EP管中，加入與水相層相等體積的異丙醇，上下顛倒EP管5次混勻，置于-30℃靜置60 min。4℃，14 000 r/min，離心15 min，棄上清，在RNA沉淀中加入500 μl 冰預冷的80%乙醇混勻，置于-30℃、靜置60 min。4℃，14 000 r/min離心15 min，棄上清，將EP管放置于超凈工作臺中晾干，加入RNase-free 水溶解保存。提取的RNA按照反轉錄試劑盒操作說明書反轉錄合成Ki-67 mRNA的cDNA。觀察分析細胞中Ki-67水平 。

1.2.6 藥物作用后Hela細胞Ki-67抗原檢測 對數(shù)生長期的Hela細胞經(jīng)終濃度為10%、20%、40%的白花蛇舌草血清培養(yǎng)基作用24、48、72 h后，棄含藥培養(yǎng)基，加入PBS洗滌3次，每次3 min。放置于室溫下30 min，待風干后，加入4%多聚甲醛固定30 min，空氣中干燥5 min，PBS洗滌3次，每次3 min，加入0.5% Triton X-100孵育15 min，洗片，加入封閉血清孵育20 min。Ki-67抗體用抗體稀釋液以1∶100稀釋后，加入封閉后的細胞爬片中，37℃反應60 min，PBS洗片。加入ploymer Helper放置于37℃中孵育20 min，PBS洗片。加入poly peroxicase-anti-rabbit IgG后37℃反應30 min，PBS洗片，加入DAB顯色，置于顯微鏡下觀察至棕色，5 min后自來水洗，分別用75%、85%、95%的酒精脫水，每個濃度梯度3 min。二甲苯透明2次，每次3 min，中性樹膠封片。同時設置對照組，對照組中不加Ki-67抗體，加等量的PBS液。計算細胞核呈棕紅色的細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值為抗原表達率。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1 MTT檢測藥物作用后細胞抑制情況 10%、20%、40%白花蛇舌草血清作用后的Hela細胞抑制率與對照組相比差異顯著(P<0.05)。相同藥物濃度，藥物作用時間為72 h的Hela細胞與作用時間48 h相比差異顯著(P<0.05)；相同藥物濃度，藥物作用時間為48 h的Hela細胞與作用時間24 h相比差異不顯著(P>0.05)。隨著藥物濃度的增加，抑制率呈上升趨勢；隨著作用時間的增加，抑制率逐漸上升。見表1。

表1 MTT法檢測白花蛇舌草血清作用后的Hela 細胞抑制率

與對照組比較：1)P<0.05；與48 h比較：2)P<0.05；表2同

2.2 TUNEL檢測白花蛇舌草藥物血清作用后Hela細胞凋亡情況 白花蛇舌草血清作用后的Hela細胞凋亡率與對照組相比差異顯著(P<0.05)。相同作用濃度的白花蛇舌草血清作用72 h后Hela細胞凋亡率較作用時間為48 h的凋亡率差異顯著(P<0.05)；隨著作用時間的增加，藥物作用后的Hela細胞凋亡率也明顯增加；隨著作用濃度的增加，藥物作用后的Hela細胞凋亡率顯著增加。說明白花蛇舌草血清通過促進Hela細胞凋亡而抑制細胞增殖。見表2。

表2 TUNEL法檢測白花蛇舌草血清 作用后的Hela細胞凋亡率

2.3 RT-PCR檢測白花蛇舌草作用后Hela細胞中Ki-67 mRNA水平 白花蛇舌草血清作用后的Hela細胞中Ki-67水平與對照組相比差異顯著(P<0.05)。40%的白花蛇舌草血清作用時間為72 h組比作用時間為48 h組Hela細胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)；40%的白花蛇舌草血清作用時間為48 h組比作用時間為24 h組Hela細胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)。20%的白花蛇舌草血清作用時間為72 h組比作用時間為48 h組Hela細胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)；20%的白花蛇舌草血清作用時間48 h比作用時間為24 h的Hela細胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)。10%的白花蛇舌草血清作用時間72 h組比作用時間為48 h組Hela細胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)；10%的白花蛇舌草血清作用時間48 h組比作用時間為24 h組Hela細胞中Ki-67水平降低很多(P<0.05)。藥物作用后的Hela細胞中Ki-67 mRNA水平隨著藥物濃度和作用時間的增加而減小。見表3。

2.4 免疫組化檢測白花蛇舌草血清作用后的Hela細胞Ki-67的表達情況 白花蛇舌草血清作用后的Hela細胞與對照組相比Ki-67抗原表達量受到明顯抑制作用(P<0.05)。10%白花蛇舌草血清作用24、48、72 h后抗原Ki-67的表達率依次為0.612 3±0.060 1，0.547 8±0.045 1，0.507 9±0.042 1。20%白花蛇舌草血清作用24、48、72 h后抗原Ki-67的表達率依次為0.534 6±0.051 1，0.471 6±0.041 2，0.426 8±0.040 2。40%白花蛇舌草血清作用24、48、72 h后抗原Ki-67的表達率依次為0.442 6±0.041 2，0.390 6±0.035 1，0.325 0±0.029 1。對照組中作用時間為24、48、72 h后抗原Ki-67的表達率依次為0.792 4±0.07，0.801 7±0.082 0，0.785 9±0.074 1。白花蛇舌草血清藥物濃度越高，Hela細胞抗原Ki-67表達量越小，藥物作用時間越長，Hela細胞抗原Ki-67表達量越小。這與RT-PCR檢測的Ki-67 mRNA表達結果一致，說明白花蛇舌草血清可以減少Ki-67的表達。

表3 RT-PCR檢測白花蛇舌草作用后的細胞中 Ki-67表達率

與相同作用時間對照組比較：1)P<0.05；與相同作用濃度作用時間24 h比較：2)P<0.05

3 討 論

宮頸癌是一種常見的惡性腫瘤，我國每年宮頸癌死亡人數(shù)在全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。宮頸癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌。在農村的發(fā)病率明顯高于城市，發(fā)展中國家的發(fā)病率高于發(fā)達國家〔4〕。30～40歲年齡階段的女性是宮頸癌高發(fā)人群，20歲以下宮頸癌發(fā)病率較少〔5〕。白花蛇舌草屬于茜草科植物，廣泛生長于亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布在長江以南地區(qū)，具有抗腫瘤、消炎、滅菌、增加免疫力等多種功效〔6〕。白花蛇舌草的抗腫瘤作用在食道癌、淋巴癌、直腸癌、胃癌中已經(jīng)得以證實。研究表明白花蛇舌草具有抑制癌細胞增殖分化、促進癌細胞凋亡、調控細胞凋亡信號等多種作用〔7〕。

細胞凋亡是細胞正常情況下的一種程序性死亡，在維持內環(huán)境穩(wěn)定中起到重要作用。細胞凋亡是一系列復雜的過程，受多種相關因子和蛋白的多重調控作用?；駼cl-2、Bax、p53等在細胞的凋亡過程中起重要作用。Bcl-2是一種抑癌基因，在細胞凋亡過程中具有抗凋亡的作用；而Bax、p53基因在細胞凋亡過程中起到促進作用。細胞凋亡過程中，鈣離子濃度的改變與凋亡信號傳遞有關〔8〕。白花蛇舌草可以顯著提高癌細胞內鈣離子濃度，增加細胞內游離鈣的濃度，從而發(fā)揮抑癌作用。

本研究通過TUNEL〔9〕檢測細胞凋亡情況，結果顯示，白花蛇舌草血清作用后的Hela細胞凋亡率明顯增高，且隨著作用濃度的增加和作用時間的增加，凋亡率增加。白花蛇舌草可以促進宮頸癌Hela細胞凋亡。

Ki-67增多標志著細胞處于增殖狀態(tài)，是臨床上常用的一種評價細胞增殖的指標。Ki-67表達增多表示癌細胞增長分化處于活躍狀態(tài)。Ki-67蛋白是一種擁有200多個的磷酸化的部位的非組蛋白，很容易受到相關蛋白酶的作用，這為提取和分離該蛋白帶來了困難。Ki-67半衰期短，擁有3個酰肽化部位，19個豆蔻?；瘏^(qū)域和50個富含谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸的部位〔10〕。Ki-67蛋白是由兩個大小分別約為8 000 bp和9 000 bp的相關mRNA編碼的蛋白質。Ki-67的cDNA由15個外顯子和14個內含子組成。研究表明，細胞中Ki-67不表達的時候，細胞周期循環(huán)不受影響，說明Ki-67不是細胞增殖必需的。已經(jīng)有研究表明，Ki-67可以作為膀胱癌患者中診斷腫瘤分級的一個重要指標，Ki-67可以作為早期前列腺癌和前列腺增生的診斷依據(jù)，另外Ki-67可以作為診斷大腸腫瘤良性還是惡性的指標〔11〕。本研究通過RT-PCR檢測藥物作用后的Hela細胞中Ki-67 mRNA的表達情況，藥物作用后的Hela細胞中Ki-67 mRNA的表達受到抑制。免疫組化結果顯示，藥物作用后的Hela細胞中Ki-67抗原表達降低，說明白花蛇舌草抑制宮頸癌Hela細胞增殖與Ki-67有關。

綜上所述，白花蛇舌草可以抑制宮頸癌細胞的增殖分化，促進細胞凋亡，抑制機制與Ki-67的表達有關。本研究通過體外實驗觀察白花蛇舌草的作用機制，為進一步研究白花蛇舌草在宮頸癌治療和診斷中的價值提供了理論依據(jù)。

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〔2016-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

文雪梅(1966-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦產科疾病研究。

R739.5

A

1005-9202(2017)03-0561-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.016

1 武警西藏總隊醫(yī)院婦產科

2 信陽市中心醫(yī)院

3 西藏民族大學臨床醫(yī)學院婦產科