張 丹 呂 亮 申興斌 趙 楊 邵雪齋

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院CT科，河北 承德 067000)

大腸癌中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的表達及意義

張 丹 呂 亮1申興斌2趙 楊2邵雪齋3

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院CT科，河北 承德 067000)

目的 研究Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3在大腸癌中的表達及臨床病理。方法 采用MaxVision免疫組織化學法分別檢測大腸腺癌、大腸腺瘤及正常大腸黏膜組織中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的表達，分析表達結果與患者的年齡、性別、腫瘤組織浸潤程度、分化程度、Dukes分期及淋巴結轉移之間的關系。結果 大腸腺癌組織中Survivin和NF-κB陽性表達(100%，100%)高于大腸腺瘤(80%，90%)及大腸正常黏膜組織(25%，35%，P<0.01，P<0.05)。大腸腺癌中I-κB和Caspase-3的陽性表達(22%，24%)明顯低于大腸腺瘤組織(80%，70%)及大腸正常黏膜組織(80%，85%，P<0.01)。大腸腺癌中NF-κB和I-κB的陽性表達與Dukes分期及淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。在大腸腺癌中Survivin的陽性表達與Caspase-3呈顯著負相關(r=-0.697，P<0.01)，與NF-κB呈顯著正相關(r=0.639，P<0.01)，與I-κB呈顯著負相關(r=-0.613，P<0.01)；Caspase-3的陽性表達與NF-κB呈顯著負相關(r=-0.601，P<0.01)，與I-κB呈顯著正相關(r=0.616，P<0.01)；NF-κB的表達與I-κB呈顯著負相關(r=-0.822，P<0.01)。結論 Survivin、NF-κB高表達及I-κB與Caspase-3低表達是大腸腺癌發(fā)生的必然事件，聯(lián)合檢測上述指標有助于大腸腺癌的診斷。NF-κB及I-κB在大腸腺癌的浸潤生長及遠處轉移過程中發(fā)揮著一定的作用。聯(lián)合檢測該四個因子不能用于全面評價大腸腺癌的預后。

大腸腺癌；Survivin；NF-κB；I-κB；Caspase-3

大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。大腸癌的發(fā)生發(fā)展是多基因參與，多途徑，多階段的過程，其中細胞增殖與凋亡失衡起著重要的作用〔1〕。Survivin和NF-κB是凋亡抑制因子，I-κB為NF-κB的免疫抑制劑，Caspase-3是內源性和外源性凋亡通路中與細胞凋亡關系最密切和必需的。這幾個因子均是細胞凋亡調控中的重要因子。目前，國內對Survivin、Caspase-3在大腸癌的表達研究較多，二者聯(lián)合NF-κB的研究較少，而再同時聯(lián)合檢測I-κB指標的研究尚無。本研究采用MaxVision免疫組化法在大腸正常黏膜、腺瘤及癌組織中共同檢測Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的表達，分析此四項指標在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年11月1日至2012年9月30日在承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院手術切除的大腸癌(大腸癌癌腫及距癌腫邊緣5 cm的癌旁組織)蠟塊標本50例，所有患者術前未進行放化療治療，男25例，女25例；年齡23～83(中位59.5)歲。收集大腸腺瘤標本10例，男7例，女3例；年齡43～73(中位57.6)歲。隨機收集上述50例大腸腺癌標本中的20例蠟塊標本的邊緣(距癌腫邊緣>5 cm以上，經病理證實為正常黏膜)作為大腸正常黏膜組。

1.2 主要試劑 兔抗人Survivin單克隆抗體、鼠抗人NF-κB單克隆抗體、鼠抗人I-κB多克隆抗體及兔抗人Caspase-3多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，即用型快捷免疫組化MaxVision試劑盒羊抗鼠/兔及即用型DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 實驗方法 石蠟切片(5 μm)，電熱恒溫箱80℃，烘烤50 min，二甲苯脫蠟至水。3%過氧化氫室溫孵育10 min。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，在微波爐里加熱0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)至沸騰后將上述組織切片放入，抗原熱修復15 min，室溫放置40 min，PBS沖洗3次，每次5 min。山羊血清封閉。滴加Ⅰ抗50 μl (Survivin工作液；Caspase工作液；NF-κB 1∶200工作液；I-κB 1∶200工作液)，4℃冰箱過夜。PBS洗3次，每次5 min。滴加Ⅱ抗(快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物)，室溫孵育15 min。PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色5 min，終止顯色，蒸餾水沖洗。蘇木精復染，透明、封片、鏡檢。

1.4 結果判定 采用陽性染色強度結合陽性細胞所占百分比進行判斷。采用Volm雙評分法進行判定〔2〕，在染色均勻的區(qū)域，在400倍視野下，每張切片隨機觀察4個視野，將切片中平均陽性比例及染色深淺分別計0～4分，切片中無陽性細胞0分，陽性細胞<25%計1分，25%～50%計2分，50%～75%計3分，>75%計4分；染色強度以多數細胞為準；無著色計0分，淺棕黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分，再按這兩項指標的積分相加將結果分為4級：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中度陽性()，5～6分為強陽性()。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行秩和檢驗、Pearson直線回歸及Spearman等級相關分析。

2 結 果

2.1 Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3在各組織中的陽性表達 見圖1。Survivin、I-κB及Caspase-3主要定位于細胞質，以細胞質內出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性反應；NF-κB主要定位于細胞核，以細胞核內出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性反應。在大腸正常黏膜組織、大腸腺瘤組織及大腸腺癌組織中，Survivin的陽性表達分別為25%、80%、100%，呈逐漸遞增趨勢； NF-κB的陽表達分別為35%、90%、100%，亦呈逐漸遞增趨勢；I-κB的陽性表達分別為80%、80%、22%，呈逐漸遞減趨勢；Caspase-3的陽性表達分別為85%、70%、24%，亦呈逐漸遞減趨勢。Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3在大腸腺癌組織中的陽性表達與大腸正常黏膜組與大腸腺瘤組比較有統(tǒng)計學差異(均P<0.01)；Survivin及NF-κB在大腸腺瘤組織中的陽性表達與大腸正常黏膜組比較亦有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；而I-κB及Caspase-3在大腸腺瘤組織中的表達與大腸正常黏膜組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

正常組織Survivin陰性

正常組織NF-κB陰性

正常組織I-κB陽性

正常組織Caspase-3陽性

腺癌組織Survivin陽性

腺癌組織NF-κB陽性

腺癌組織I-κB陽性

腺癌組織Caspase-3陰性

腺瘤組織Survivin陽性

腺瘤組織NF-κB陽性

腺瘤組織I-κB陰性

腺瘤組織Caspase-3陰性圖1 Survivin、NF-κB、I-κB、Caspase-3在大腸正常組織、腺癌組織及腺瘤組織中的表達(DAB,×200)

2.2 大腸腺癌中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的陽性表達與臨床病理指標間的關系 大腸腺癌組織中NF-κB與I-κB的陽性表達在Dukes分期A+B期與C+D期分組以及有無淋巴結轉移分組中的比較有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的陽性表達在患者性別、年齡、組織分化程度、腫瘤浸潤深度分組中的比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Survivin及Caspase-3的陽性表達在Dukes分期以及有無淋巴結轉移分組中亦無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

2.3 大腸腺癌組織Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3陽性表達相關性 大腸腺癌組織中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3陽性表達間均具有相關性(P<0.01)，見表2。

表1 大腸腺癌中Survivin、NF-κB、I-κB及Caspase-3的陽性表達與臨床病理特征的關系(n)

表2 大腸腺癌組織中Survivin、NF-κB、I-κB及 Caspase-3陽性表達的相關性

3 討 論

正常腸道黏膜存在著細胞凋亡，清除衰老的細胞，維持黏膜細胞的生理平衡。細胞凋亡受抑制，有利于腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的新成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子。Survivin具有抑制凋亡和調節(jié)細胞增殖的雙重作用〔3〕。NF-κB是一種核蛋白基因，它能參與機體的免疫應答，多種基因的調控以及細胞凋亡。目前多數研究表明Survivin及NF-κB與多種腫瘤有著密切的關系〔4～6〕。本研究結果提示Survivin及NF-κB的表達上調是大腸癌發(fā)生的必然事件，這也提示可將Survivin及NF-κB作為大腸癌的早期診斷的腫瘤標志物。研究顯示，Survivin及NF-κB在大腸癌中的高表達與大腸癌的臨床病理指標間或多或少的具有相關性〔7～10〕。而本研究顯示，NF-κB的表達雖然對大腸癌的發(fā)展程度有一定的提示意義，但是不能依靠Survivin及NF-κB的表達全面評估大腸癌的生物學行為，也可能因為本研究樣本量小，尚需大樣本進一步研究。

I-κB作為NF-κB的胞質抑制蛋白，本研究結果提示在大腸癌中，單獨檢測I-κB可以替代NF-κB，同樣具有診斷價值。但是Thompson等〔11〕認為不同的外界刺激通過一個或多個信號傳導途徑，作用于不同的I-κB可以引起NF-κB有差別的活化。而且，李道明等〔12〕研究顯示，食管鱗癌中NF-κBp65的表達低于I-κBα的表達，兩者之間無相關性，提示NF-κBp65蛋白與I-κBα蛋白的表達是各自獨立的事件。因此，在不同腫瘤組織中，I-κB與NF-κB可能不能相互替代檢測，這可能是NF-κB和I-κB兩個基因的家族成員之間關系的復雜性所致。

Caspase-3是Caspase蛋白酶家族成員之一，是已知內源性和外源性凋亡通路中與細胞凋亡關系最密切和必需的，被稱為凋亡的執(zhí)行者。多數學者〔13～15〕研究顯示Caspase-3在腫瘤組織中低表達，本研究亦顯示了這一特點，即Caspase-3在大腸正常黏膜、大腸腺瘤和大腸癌中的陽性表達呈遞減趨勢。本研究還顯示Caspase-3在大腸癌組織中的表達與患者的性別、年齡、腫瘤的分化程度、浸潤深度、Dukes分期及淋巴結轉移均無相關性，與多數學者〔15，16〕研究結論不符，推測原因是Caspase-3可能不直接參與及影響大腸癌的演變過程，只是大腸癌發(fā)生的一個結果，是其他因子引起大腸癌的一個必然過程，故無法應用Caspase-3的表達情況對大腸癌的進展情況及預后進行評估。本研究結果顯示大腸癌中Survivin、NF-κB均為高表達，而Caspase-3為低表達，Survivin、NF-κB分別與Caspase-3在大腸癌中的表達呈負相關，且三者之間均有相關性，那么可以推斷Survivin、NF-κB可能協(xié)同作用于Caspase-3而發(fā)揮抑凋亡、促增殖的作用。本研究還顯示，Survivin與I-κB呈負相關、Caspase-3與I-κB呈正相關，但尚無文獻報道兩者之間的關系，推斷機制可能為Survivin協(xié)同NF-κB抑制Caspase-3，而I-κB通過抑制NF-κB活性間接抑制了Survivin活性，但尚需進一步研究。

1 柴 漫.大腸癌中NF-κB及Livin蛋白表達與細胞凋亡指數的關系〔J〕.山東醫(yī)藥，2011；51(1)：48-9.

2 Volm M，Koomagi R.Mattern prognathic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer〔J〕.Int Cancer，1997；74(1)：64-8.

3 Tamm I，Wang Y，Sausville E，etal.IAP-family protein Survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95)，Bax，caspases，and anticancer drugs〔J〕.Cancer Res，1998；58(23)：5315-20.

4 常玉珍，李秀梅，封 敏，等.Survivin、NF-κB和STAT3 mRNA在宮頸癌中的表達及其臨床意義〔J〕.癌變·畸變·突變，2014；26(3)：189-92.

5 龐雅青.Survivin、NF-κB、VGEF-C與食管癌血管形成的關系〔J〕.河南醫(yī)學研究，2010；19(2)：249-52.

6 Wu YF，Liang XJ，Liu YY，etal.Antisenseoligo nucleotide targeting Survivin inhibits growth by inducing apoptosis in human osteo sarcoma cells MG-63〔J〕.Neoplasma，2010；57(6)：501-6.

7 鄭國文.大腸癌中LIVIN和Survivin的表達及相關性研究〔J〕.實用醫(yī)院臨床雜志，2014；11(2)：86-7.

8 楊志誠，趙云剛，劉明雨.Survivin、NF-κB在結直腸癌中的表達及臨床意義〔J〕.河北醫(yī)藥，2013；35(12)：1834-5.

9 Jin Li，Xiaonian Cao，Yu Deng，etal.Immunohistochemical study of nuclear factor-κB activity in colorectal cancer〔J〕.Chin-German J Clin Oncol，2011；10(7)：406-9.

10 李 佽，陳志英.NF-κB及COX-2在大腸癌中表達相關性〔J〕.四川醫(yī)學，2013；34(8)：1102-4.

11 Thompson JE，Phillips RJ，Erdjument H.I kappa B-beta regulates the persistent response in a biphasic activation of NF-kappa B〔J〕.Cell，1995；80(4)：573-82.

12 李道明，李珊珊，趙志華，等.核轉錄因子κBp65蛋白及其抑制蛋白IκBα表達與食管鱗癌浸潤轉移的關系〔J〕.中國腫瘤臨床，2005；32(9)：497-512.

13 王文娟，高玉彤.PUMA、COX-2、Caspase-3在結直腸癌中的表達及臨床意義〔J〕.山東醫(yī)藥，2011；51(11)：15-7.

14 常方芝，田字彬.FHIT、Caspase-3及Survivin在結直癌組織中的表達及其臨床意義〔J〕.大連醫(yī)科大學學報，2011；33(4)：330-4.

15 樊勇軍，馮一中，李 海，等.Survivin、Caspase-3及AKT1在大腸癌中的表達及意義〔J〕.實用癌癥雜志，2010；25(1)：26-30.

16 袁德漢，康舉齡，蘇艷桃，等.Caspase-3在正常結腸黏膜、結腸腺瘤及結腸癌中的表達及其臨床意義〔J〕.中國醫(yī)師進修雜志，2012；35(32)：4-6.

〔2015-09-23修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

申興斌(1969-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事病理診斷研究。

張 丹(1974-)，女，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事影像診斷研究。

R735.3

A

1005-9202(2017)03-0549-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.012

1 承德護理職業(yè)學院醫(yī)學技術系

2 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科

3 承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科