周 華 張 敏 李 華 張 晟 張 平 姜文濤

(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室，安徽 合肥 230601)

參苓白術(shù)散治療大鼠脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制

周 華 張 敏 李 華 張 晟 張 平 姜文濤

(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室，安徽 合肥 230601)

目的 探討參苓白術(shù)散對脾虛濕困型潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上鈣池調(diào)控的鈣離子通道(SOC)介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流變化的影響及可能機(jī)制。方法 64只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、柳氮磺吡啶組、參苓白術(shù)散組， 每組16只。首先復(fù)制脾虛濕困型UC大鼠模型；采用fura-2熒光測定各組細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的變化；用生物信號采集系統(tǒng)記錄各組結(jié)腸平滑肌收縮張力的變化；用免疫組織化學(xué)的方法觀察各組結(jié)腸平滑肌上瞬時受體電位陽離子通道(TRPC)1蛋白質(zhì)表達(dá)情況。結(jié)果 ①在無鈣4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液中，模型組〔Ca2+〕i低于正常對照組(P<0.05)。在引入兩種不同的含鈣HEPES緩沖液后，模型組低于正常對照組(P<0.05)，而柳氮磺吡啶組與參苓白術(shù)散組均高于模型組(P<0.05)。②模型組結(jié)腸平滑肌張力低于正常對照組(P<0.05)，而柳氮磺吡啶組與參苓白術(shù)散組張力高于模型組(P<0.05)。③各組結(jié)腸平滑肌上均有TRPC1細(xì)胞表達(dá)，其中模型組結(jié)腸組織TRPC1表達(dá)的平均光密度低于正常對照組(P<0.05)，而柳氮磺嘧啶組和參苓白術(shù)散組高于模型組(P<0.05)。結(jié)論 參苓白術(shù)散通過促進(jìn)SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流治療脾虛濕困型UC，其分子實質(zhì)是上調(diào)TRPC1的表達(dá)。

參苓白術(shù)散；鈣通道；脾虛濕困；潰瘍性結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)主要侵及結(jié)腸黏膜，是一種慢性非特異性炎性疾病，多首發(fā)于左半結(jié)腸，常呈進(jìn)行性加重累及結(jié)腸近端及全結(jié)腸〔1〕。目前西醫(yī)對于本病的治療，一般多采取以水楊酸類藥物、激素、免疫抑制劑等為主的藥物治療〔2〕。由于作用局限，毒副作用大，病人難以堅持治療。國內(nèi)多采用中醫(yī)藥進(jìn)行干預(yù)〔3〕。中醫(yī)治療常采用參苓白術(shù)散，具有健脾滲濕之效，取得了良好的效果。研究證實，在結(jié)腸平滑肌上鈣池調(diào)控鈣離子通道(SOC)有瞬時受體電位陽離子通道(TRPC)1的表達(dá)〔4〕。本研究探討參苓白術(shù)散對脾虛濕困型UC大鼠結(jié)腸平滑肌中SOC介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流變化的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級Wistar大鼠64只， 雌雄均可，體質(zhì)量(210±20)g，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、柳氮磺吡啶組、參苓白術(shù)散組，每組 16只，室溫控制 在18℃～25℃， 大鼠適應(yīng)性常規(guī)喂養(yǎng)3 d。參苓白術(shù)散水煎液組方嚴(yán)格按照《藥典》執(zhí)行；柳氮磺吡啶腸溶片購自上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司。 主要試劑和儀器：TRPC1 IgG兔抗人多克隆抗體(美國生物科技公司)、二抗試劑盒PV-6000 (北京欣興唐生物科技有限公司)、恒溫干燥箱(上海火諾電爐設(shè)備有限公司)、電子天平(常州市宏衡電子儀器廠)、生物信號采集系統(tǒng)(安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)。960MC-熒光分光光度計(上海現(xiàn)科分光儀器有限公司) 。

1.2 脾虛濕困型UC大鼠模型制備 借鑒環(huán)境與飲食干預(yù)聯(lián)合2，4，6-三硝基苯磺酸鈉(TNBS)/乙醇灌腸法,每天保證大鼠在2 cm深的水中和有效睡眠時間均為8 h。單雙日不規(guī)律飲食，造成脾胃功能失調(diào)。如單日禁食, 只灌服4℃生理鹽水2 ml，雙日則保證充足飼料供給，并灌服4 ml豬油，此種干預(yù)方式連續(xù)3 w。 在最后1 d,大鼠禁食不禁水, 用10%水合氯醛麻醉,然后將TNBS與乙醇混合物注入肛門上段, 隨即將大鼠頭部向下持續(xù)倒置約60 s，保證溶液進(jìn)入大鼠腸腔內(nèi),待自然清醒后自由飲食。

1.3 干預(yù)措施 正常對照組：常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水2 ml。并參照造模方法給予肛門灌腸相同劑量的生理鹽水。 模型組：常規(guī)飼養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水2 ml。參苓白術(shù)散組：參苓白術(shù)散煎劑灌胃，劑量為12 g·kg-1·d-1。柳氮磺吡啶組：柳氮磺吡啶灌胃，劑量為0.5 g·kg-1·d-1,均連續(xù)14 d。

1.4 平滑肌〔Ca2+〕i的變化 采用酶解法并結(jié)合密度離心法分離4組(每組選6只)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(SMC),制備新鮮結(jié)腸SMC懸液，通過錐蟲藍(lán)排斥試驗，證明細(xì)胞成活率≥90%。標(biāo)記fura-2熒光染料后，將細(xì)胞懸液分別置于無鈣4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液中，并分別向其中加入1 μmol/L毒胡蘿卜內(nèi)酯sigargin預(yù)處理30 min，然后再引入濃度分別為1.5和3.0 mmol/L的含鈣HEPES緩沖液，從而引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+上升被認(rèn)為是SOC功能的一個指標(biāo)，定義為〔Ca2+〕i。

1.5 結(jié)腸平滑肌收縮張力的變化 每組6只大鼠擊頭致昏后，立即進(jìn)行解剖，暴露腹腔后，在距肛門約5 cm處采集一段約2 cm的結(jié)腸，放入4℃Krebs液中，并持續(xù)通入混有95%O2和5% CO2的氣體。去除腸管黏膜層后沿縱向肌制備成規(guī)格為10 mm×5 mm的肌條標(biāo)本，兩端用手術(shù)線扎牢后將其置入含有37℃ Krebs 液的恒溫浴槽中，用95% O2和5% CO2混合氣體飽和。標(biāo)本兩端分別固定在浴槽底部和張力換能器上。收縮張力信號通過后者與生理記錄儀相連，并通過電腦顯示出來。標(biāo)本前負(fù)荷為0.5 g，每20 min換液一次，平衡1 h后，將結(jié)腸平滑肌條置于無鈣Krebs溶液中，并分別用1 μmol/L毒胡蘿卜內(nèi)酯預(yù)處理35 min，然后再加入含2.5 mmol鈣Krebs溶液，所引起的張力幅度的明顯增加，即由SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流所致。

1.6 結(jié)腸平滑肌TRPC1蛋白質(zhì)表達(dá)情況 每組處死4只大鼠，開腹，截取距大鼠肛門約5 cm處的結(jié)腸組織，然后放入10%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切成約5 μm 的組織薄片，常規(guī)脫蠟，采用非生物素二步法免疫組化檢測試劑盒(PV6001)測定TRPC1蛋白的表達(dá)。分別滴加一抗和二抗，其中一抗?jié)饪s型TPRC1 IgG兔抗人多克隆抗體工作濃度為1∶300,二抗采取的是通用型二抗PV-6000，顯色后脫水、封片，用光鏡觀察，采集圖像，并計算每100個細(xì)胞中的平均光密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行多組間單向方差分析，兩兩比較LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組平滑肌〔Ca2+〕i的變化 在無鈣HEPES緩沖液中，模型組〔Ca2+〕i明顯較正常對照組低。在引入兩種不同的含鈣HEPES緩沖液后，各組〔Ca2+〕i均有所增加，與正常對照組相比，模型組較低(P<0.05)。與模型組相比，柳氮磺吡啶組與參苓白術(shù)散組較高(P<0.05)。柳氮磺吡啶組與參苓白術(shù)散無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組不同緩沖液中平滑肌〔Ca2+〕i的變化

組別無鈣HEPES含鈣HEPES(1.5mmol/L)含鈣HEPES(3.0mmol/L)正常對照組269.34±5.45403.32±9.671002.55±7.65模型組150.54±2.121)368.34±12.231)723.33±6.651)柳氮磺吡啶組265.23±12.542)398.34±8.572)993.65±5.602)參苓白術(shù)散組268.32±10.432)405.45±9.592)998.65±5.602)

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 各組結(jié)腸平滑肌收縮張力的變化 模型組結(jié)腸平滑肌張力〔(40.22±23.31)mN/mm2〕比正常對照組〔(90.01±12.35)mN/mm2〕低(P<0.05);柳氮磺吡啶組〔(88.23±19.34)mN/mm2〕與參苓白術(shù)散組〔(89.83±17.54)mN/mm2〕較模型組高(P<0.05)。

2.3 各組結(jié)腸平滑肌TRPC1蛋白表達(dá)情況 結(jié)腸平滑肌中TRPC1的陽性細(xì)胞多表達(dá)于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，多呈棕黃色或褐色表達(dá)。模型組結(jié)腸組織TRPC1表達(dá)的平均觀密度較正常對照組低(P<0.05)，柳氮磺嘧啶組和參苓白術(shù)散組比模型組高(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1 各組結(jié)腸平滑肌TRPC1蛋白表達(dá)(SP，×400)表2 各組結(jié)腸平滑肌TRPC1蛋白表達(dá)平均 光密度比較

組別陽性細(xì)胞數(shù)平均光密度正常對照組21.45±4.670.791±0.079模型組12.34±5.231)0.412±0.0251)柳氮磺吡啶組19.34±5.242)0.785±0.0842)參苓白術(shù)散組18.57±2.592)0.779±0.0752)

3 討 論

UC一般以慢性復(fù)發(fā)型居多，病變大多局限，經(jīng)治療預(yù)后較好。小于20歲或超過60歲的患者由于病情癥狀較重，病變范圍廣，若不及時治療，具有極高的致死率〔5〕。然而，UC的臨床癥狀并不典型，常錯過最佳治療時機(jī)，且病程超過10年以上者，具有極高的癌變可能〔6〕。關(guān)于的UC的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，目前認(rèn)為其與感染、免疫、遺傳等因素有關(guān)，治療上多采用消炎、免疫抑制等療法〔7〕。中醫(yī)學(xué)里并無UC一說，本病在中醫(yī)領(lǐng)域?qū)儆凇按箴埂狈懂牎?〕，目前臨床分型尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，多認(rèn)為脾虛濕盛為本病的發(fā)病關(guān)鍵，所以治療上也以健脾滲濕為主則〔9〕。鈣通道參與大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮〔10〕。UC發(fā)病時腸道動力紊亂與SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流下降有一定的相關(guān)性。在結(jié)腸平滑肌細(xì)胞上，胞內(nèi)鈣庫耗竭后才可激活細(xì)胞膜上兩種Ca2+通道〔11〕，即L-型Ca2+通道和SOC。為排除L-型Ca2+通道對本文結(jié)果的干擾，把新鮮結(jié)腸平滑肌細(xì)胞懸液分別置于無鈣HEPES緩沖液中，并分別預(yù)處理后再引入含鈣HEPES緩沖液，導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Ca2+上升即被認(rèn)為是反映SOC通道功能的一個指標(biāo)。本實驗提示脾虛濕盛型UC大鼠的結(jié)腸平滑肌收縮力下降的確與SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流減少有關(guān)。本文再次佐證鈣通道參與大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮。由SOC介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流是胃腸道平滑肌對許多激素或遞質(zhì)生理反應(yīng)的一部分〔12～14〕，平滑肌收縮性下降可能與SOC功能低下有關(guān)。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度可以治療炎癥性腸病所致的黏膜出血，并愈合黏膜表面創(chuàng)口〔15〕。Yang等〔16〕探討TRPA1 通道是否參與冷刺激引起的大鼠結(jié)腸平滑肌收縮及其可能機(jī)制，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)發(fā)現(xiàn)在大鼠升結(jié)腸和降結(jié)腸的平滑肌層均有TRPA1的mRNA表達(dá)。本文結(jié)果提示脾虛濕困型UC 大鼠結(jié)腸組織TPRC1表達(dá)明顯減弱，而經(jīng)過柳氮磺嘧啶和參苓白術(shù)散治療可顯著增強(qiáng)其TRPC1的表達(dá)水平。

綜上，脾虛濕盛型UC大鼠的結(jié)腸平滑肌收縮力下降與SOC通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流減少有關(guān)，其分子實質(zhì)是TRPC1的下調(diào)。而參苓白術(shù)散可能上調(diào)TRPC1的表達(dá)水平。

1 Ho GT，Boyapati R，Satsangi J.Ulcerative colitis〔J〕.Medicine，2015；43(5)：276-81.

2 Rogler G.Chronic ulcerative colitis and colorectal cancer〔J〕.Cancer Lett，2014；345(2)：235-41.

3 龍再菊，關(guān)露春.參苓白術(shù)散加味治療潰瘍性結(jié)腸炎臨床觀察〔J〕.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014；16(3)：173-4.

4 Kassan M，Zhang W，Aissa KA，etal.Differential role for stromal interacting molecule 1 in the regulation of vascular function〔J〕.Pflügers Arch Eur J Physiol，2015；467(6)：1195-202.

5 Willenbucher RF，Zelman SJ，F(xiàn)errell LD，etal.Chromosomal alterations in ulcerative colitis-related neoplastic progression〔J〕.Gastroenterology，2014；113(3)：791-801.

6 Dulai PS，Mosli M，Khanna R，etal.Vedolizumab for the treatment of moderately to severely active ulcerative colitis〔J〕.Pharmacotherapy，2015；35(4)：412-23.

7 Macken L，Blaker PA.Management of acute severe ulcerative colitis (NICE CG 166)〔J〕.Clin Med，2015；15(5)：473-6.

8 辛 群，孫 擎，葛現(xiàn)才，等.參苓白術(shù)散與美沙拉嗪對潰瘍性結(jié)腸炎患者血清IL-17、IL-23及TNF-α水平的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015；15(9)：1663-5.

9 穆麗萍，肖 明.參苓白術(shù)散治療潰瘍性結(jié)腸炎長期應(yīng)用的療效與安全性〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2016；43(2)：309-11.

10 柯道平，周 華，李忠穩(wěn)，等.庫容性Ca2+內(nèi)流介導(dǎo)大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸平滑肌收縮〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2006；22(3)：344-8.

11 楊 勇.鈣庫操縱的鈣內(nèi)流在老年動物平滑肌細(xì)胞中的改變及其對收縮功能的影響〔D〕.合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2015.

12 Peng G，Li S，Hong W，etal.Corrigendum：chronic hypoxia increases intracellular Ca2+concentration via enhanced Ca2+entry through receptor-operated Ca2+channels in pulmonary venous smooth muscle cells〔J〕.Circ J，2015；79(9)：2058-68.

13 Yan M，Peng Z，Jie L，etal.Epoxyeicosatrienoic acids act through TRPV4-TRPC1-K Ca 1.1 complex to induce smooth muscle membrane hyperpolarization and relaxation in human internal mammary arteries〔J〕.Biochim Biophys Acta，2015；1852(3)：552-9.

14 Cully TR，Choi RH，Shannon TR，etal.Ryanodine receptor activity regulates the levels of Ca2+extrusion and store-operated Ca2+entry in skeletal muscle〔J〕.Biophys J，2016；110(3)：183.

15 Magro CG，Recio LE.Fit model between participation statement of exhibitors and visitors to improve the exhibition performance〔J〕.Intangible Capital，2015；11(2)：234-44.

16 董 楊，石海蓮，施建蓉，等.瞬時感受器電位A1通道參與冷刺激引起的離體大鼠結(jié)腸平滑肌收縮〔J〕.生理學(xué)報，2010；62(4)：349-56.

〔2015-07-19修回〕

(編輯 苑云杰)

安徽省優(yōu)秀青年人才基金重點項目(No.2013SQRL118ZD)

周 華(1979-)，女，碩士，講師，主要從事消化道生理與藥理研究。

R965

A

1005-9202(2017)03-0547-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.011