郭東艷 范 妤 趙曉平 覃鴻恩

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

健腦益智膠囊不同純化工藝對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠腦組織炎癥反應(yīng)的影響

郭東艷 范 妤 趙曉平1覃鴻恩

(陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

目的 研究不同純化工藝制備的健腦益智膠囊對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡的影響。方法 120只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、原藥液組、醇沉組、殼聚糖組、膜分離組，給藥組提前給藥1 w(給藥劑量按健腦益智膠囊內(nèi)容物為0.6 g·100 g-1·d-1，給藥體積為1 ml·100 g-1·d-1)。建立大腦中動(dòng)脈缺血(MCAO)再灌注損傷模型，尼氏染色后觀察大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)變化；檢測(cè)缺血側(cè)腦組織白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1的含量；免疫組化法檢測(cè)腦組織中凋亡相關(guān)蛋白Fas、FasL的表達(dá)。結(jié)果 不同純化工藝制備的健腦益智膠囊均能保護(hù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，減輕神經(jīng)元損傷，顯著降低腦組織中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的含量，下調(diào) Fas、FasL蛋白的表達(dá)，其中醇沉組改善作用更為明顯。結(jié)論 健腦益智膠囊通過抑制炎癥反應(yīng)，阻斷神經(jīng)細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)組作用。

健腦益智膠囊；腦缺血再灌注損傷；炎癥因子；凋亡

健腦益智膠囊由水蛭、葛根、郁金、石菖蒲、白茅根等藥味組成，具有豁痰開竅、活血化瘀、通脈益智的功效，臨床上主要用于預(yù)防和治療外部顱腦損傷、缺血性腦損傷、腦震蕩及腦水腫等腦部疾病〔1～4〕。為了提高健腦益智膠囊質(zhì)量，降低臨床服藥量，本實(shí)驗(yàn)擬在前期提取工藝研究的基礎(chǔ)上〔5〕，考察不同純化工藝制備的健腦益智膠囊對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品 葛根(批號(hào)：121101；產(chǎn)地： 廣西)、白茅根(批號(hào)：130401 ；產(chǎn)地：陜西)、郁金(批號(hào)：130101；產(chǎn)地： 廣西)、石菖蒲(批號(hào)：130401 ；產(chǎn)地：四川)，以上飲片均購自西安盛興中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院王繼濤老師鑒定，分別為葛根為葛根豆科植物野葛(Willd.)的干燥根，白茅根為禾本科植物白茅(Nees)的干燥根莖，郁金為姜科植物溫郁金的干燥塊根，石菖蒲為天南星科植物石菖蒲的干燥根莖；葛根素對(duì)照品(供含量測(cè)定用，批號(hào)：110752-201313)來源于中國食品藥品檢定研究院；殼聚糖(69047438，生化試劑BR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.2 儀器 UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)，L-520型離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)有限公司)，恒溫水浴鍋(HH-2型，北京科偉永興儀器有限公司)，梅特勒電子天平(GB204 瑞士)，生物顯微鏡(Leica DM4000B，德國徠卡公司)，GQ76管式離心機(jī)(上海市離心機(jī)械研究所有限公司)，PFT-A500電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 白細(xì)胞介素(IL)-1β、 腫瘤壞死因子(TNF)-α和細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；Fas、FasL一抗、SABC試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠120只，體重300～350 g，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)，購于西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(陜)2013-003。

1.5 方法

1.5.1 不同純化工藝健腦益智膠囊的制備 按處方比例稱取白茅根、葛根、郁金和石菖蒲，其中郁金、石菖蒲兩味藥材加入10倍量的水，浸泡2 h，提取揮發(fā)油6 h，收集揮發(fā)油和水溶液備用；藥渣與白茅根、葛根兩味加入10倍量水，煎煮2次，每次2 h，水煎液和蒸餾后的水溶液合并，過濾，即得水提液。將水提液分成4等份，一份備用，其余3份進(jìn)行醇沉〔6〕、殼聚糖〔7〕和膜分離〔8〕三種工藝處理，另將揮發(fā)油分成四等份，分別加入原水提液及三種不同精制工藝后的溶液中，混勻。按處方比例稱取水蛭，分成兩份，一份粉碎，過40目篩，用60%乙醇回流提取1 h，提取2次，濾過，濾液濃縮至無醇味，分成4等份，分別加入上述四種溶液中，混勻；取另一份水蛭，粉碎，過100目篩，分成4等份，分別加入上述四種溶液中，混勻、干燥、粉碎、填充、即得不同純化工藝制備的健腦益智膠囊。

1.5.2 動(dòng)物分組與給藥 120只大鼠隨機(jī)分成6組，即假手術(shù)組、模型組、原藥液組、醇沉組、殼聚糖組、膜分離組，每組20只。給藥組提前給藥1 w，給藥劑量按健腦益智膠囊內(nèi)容物為0.6 g·100 g-1·d-1，給藥體積為1 ml·100 g-1·d-1。

1.5.3 大鼠腦缺血再灌注損傷模型的制備 將經(jīng)1.5.2方法處理后的大鼠提前禁食12 h，照常給水。參照Zea Longa改良法建立左側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血(MCAO)模型：大鼠稱重后腹腔注射10% 水合氯醛 3 ml/kg麻醉，于頸部偏右側(cè)切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎右CCA近心端、ECA及其分支動(dòng)脈。分離右側(cè)ICA，沿ICA向下分離翼顎動(dòng)脈，根部結(jié)扎該動(dòng)脈分支。在CCA近心端備線，另一端加動(dòng)脈夾，在距離頸動(dòng)脈分叉0.5 cm處剪開一小口，將處理后的漁線經(jīng)ECA插入ICA進(jìn)入大腦中動(dòng)脈分支處，以阻斷大腦中動(dòng)脈所有血流來源。缺血1.5 h后，拔出漁線，再灌注48 h。假手術(shù)組只做動(dòng)脈分離暴露，不插拴線，其余步驟相同。手術(shù)過程中大鼠保持體溫在37℃左右。

1.5.4 尼氏染色檢測(cè)腦組織病理學(xué)變化 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，快速斷頭取出大腦，置于10%甲醛溶液中固定，包埋切片，脫蠟至水后，0.1%甲苯胺藍(lán)染色10 min，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察并拍照，觀察神經(jīng)元胞體內(nèi)尼氏體變化。正常細(xì)胞不同程度的含有尼氏體，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后呈藍(lán)色，細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)尼氏體減少甚至消失。

1.5.5 ELISA法檢測(cè)大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的含量 取備用血清，嚴(yán)格按照 ELISA 試劑盒說明操作，測(cè)定 450 nm吸光度值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)標(biāo)本均采用復(fù)孔，復(fù)孔測(cè)定的吸光度值取均數(shù)減去零標(biāo)準(zhǔn)孔吸光度值的均數(shù)作為該濃度標(biāo)準(zhǔn)濃度或檢測(cè)標(biāo)本的測(cè)定值，進(jìn)一步通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋倍數(shù)計(jì)算出濃度。

1.5.6 免疫組化法檢測(cè)缺血側(cè)腦組織Fas、FasL表達(dá)水平 大鼠灌流固定后，取缺血側(cè)腦組織,常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋后，制作標(biāo)本切片，采用免疫組化SABC法染色,DAB顯色，光鏡(×400)下觀察陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。每張切片隨機(jī)取大腦皮質(zhì)5個(gè)不重疊視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)不分細(xì)胞種類。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同純化工藝健腦益智膠囊對(duì)腦缺血再灌注后大鼠腦組織病理變化的影響 缺血側(cè)大腦皮質(zhì)尼氏染色后光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)元胞體內(nèi)尼氏體變化，結(jié)果顯示：假手術(shù)組神經(jīng)元胞體內(nèi)尼氏體清晰可辨，呈紫藍(lán)色斑塊狀，數(shù)量多，體積大；模型組尼氏體明顯減少呈細(xì)顆粒狀，染色淺，部分神經(jīng)元內(nèi)尼氏體消失；與模型組比較，不同純化工藝制備的健腦益智膠囊預(yù)處理組尼氏體明顯增多，體積增大，紫藍(lán)色染色清晰。膜分離組尼氏體數(shù)量較少。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織尼氏染色(甲苯胺，×200)

2.2 不同純化工藝健腦益智膠囊對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織IL-1β、IL-6和ICAM-1的影響 腦缺血再灌注48 h后腦組織中IL-1β、TNF-α和ICAM-1水平均顯著升高(P<0.01)，健腦益智膠囊不同純化工藝組均能降低腦組織中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的表達(dá)(P<0.05)，其中，醇沉組對(duì)IL-1β和TNF-α的表達(dá)抑制作用更為明顯(P<0.01)。見表1。

2.3 不同純化工藝健腦益智膠囊對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織Fas、FasL表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組Fas、FasL蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，健腦益智膠囊不同純化工藝組均能減低Fas、FasL蛋白的表達(dá)(P<0.05)。見表2。圖2。

表1 健腦益智膠囊對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織IL-1β、 TNF-α和ICAM-1的影響

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01

表2 健腦益智膠囊對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織Fas、 FasL表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

圖2 大鼠大腦皮質(zhì)中Fas的陽性表達(dá)(×400)

3 討 論

腦缺血及再灌注損傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為存在多種機(jī)制相互作用形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括炎癥損害、自由基損傷、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等，直接或間接導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡或死亡，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。 大量研究表明炎癥反應(yīng)與腦缺血再灌注損傷關(guān)系密切。在炎癥反應(yīng)中，有許多炎性因子參與，IL-1和TNF-α是由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的單核因子〔9〕。IL-1可以協(xié)助白細(xì)胞遷移和刺激內(nèi)皮細(xì)胞的各種反應(yīng),通過激活血管內(nèi)皮細(xì)胞而增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(ECAM)表達(dá),增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，破壞血腦屏障的通透性，加重腦組織損傷；同時(shí)TNF-α與細(xì)胞膜上的死亡受體結(jié)合細(xì)胞膜死亡受體結(jié)合，激活Fas/FasL凋亡蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔10，11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：健腦益智膠囊不同純化工藝組均能降低腦缺血再灌注大鼠腦組織中炎性細(xì)胞因子IL-1、TNF-α和ICAM-1的含量，下調(diào)凋亡蛋白Fas/FasL的表達(dá)，說明健腦益智膠囊通過降低炎性因子與黏附分子的含量抑制炎癥反應(yīng)，阻斷神經(jīng)細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)腦缺血再灌注后的神經(jīng)保護(hù)功能。

1 張寶麗，范小璇，趙曉平.健腦益智膠囊對(duì)基底節(jié)區(qū)腦出血術(shù)后的療效觀察〔J〕.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007；30(5):10-1.

2 范小璇，趙曉平，梁格婷.健腦益智膠囊對(duì)外傷性腦出血患者IgG-CSF的影響〔J〕.中國中醫(yī)急癥，2011；20(10):1552-4.

3 周振國，范小璇，趙曉平，等.健腦益智膠囊對(duì)顱腦損傷大鼠血漿 NPY 含量的影響〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012；21(31):3437-9.

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7 楊偉平，郭東艷，覃鴻恩，等.殼聚糖澄清劑對(duì)健腦益智膠囊水提部位的純化工藝研究〔J〕.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2014;34(6)：70-2.

8 郭東艷，覃鴻恩，趙曉平，等.ZrO2無機(jī)陶瓷膜微濾技術(shù)精制健腦益智膠囊水提部位的研究〔J〕.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2014；34(5)：69-72.

9 袁立霞.當(dāng)歸拈痛湯對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)理及配伍的實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

10 王 軍，張紅霞，賈士奇，等.生姜對(duì)全腦缺血再灌注大鼠腦組織炎性細(xì)胞因子和黏附分子含量的影響〔J〕.醫(yī)藥論壇雜志,2011；32(15):12-4,18.

11 劉永剛,李芳君,王 婧,等.銀杏內(nèi)酯B對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影響〔J〕.中藥材，2010；33(4)：578-80.

〔2015-08-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

陜西省科技廳資助項(xiàng)目(No.2011KTCL03-02)

郭東艷(1973-)，女，教授，博士，主要從事中藥提取工藝及其藥效學(xué)研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)03-0538-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.007

1 陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院