莊景燊 朱思遠(yuǎn) 黃玉圣 徐 平 陳建庭 鐘招明

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510515)

·基礎(chǔ)研究·

晚期氧化蛋白終產(chǎn)物對破骨細(xì)胞分化的影響

莊景燊 朱思遠(yuǎn) 黃玉圣 徐 平 陳建庭 鐘招明

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510515)

目的 探討晚期氧化蛋白終產(chǎn)物(AOPPs)對破骨細(xì)胞分化的影響。方法 體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓單核細(xì)胞，分為空白對照組、陰性對照組(RSA)、AOPPs組、陽性對照組(RANKL)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制劑組(AOPPs+夾竹桃麻素)，干預(yù)6 d后，通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色觀察TRAP陽性多核細(xì)胞，鬼筆環(huán)肽熒光染色觀察F肌動蛋白(F-actin)環(huán)，甲苯胺藍(lán)染色觀察骨磨片的骨吸收陷窩。此外，AOPPs刺激2 h后，通過DCFH-DA熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成。結(jié)果 AOPPs 及陽性對照組RANKL 均可誘導(dǎo)TRAP陽性多核細(xì)胞、F-actin環(huán)及骨吸收陷窩形成，并且AOPPs刺激后細(xì)胞ROS生成明顯增多。AOPPs所致以上效應(yīng)均能被NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素阻斷。結(jié)論 AOPPs可誘導(dǎo)大鼠骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化。

晚期氧化蛋白終產(chǎn)物；骨髓單核細(xì)胞；破骨細(xì)胞；分化

晚期氧化蛋白終產(chǎn)物(AOPPs)是體內(nèi)蛋白質(zhì)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下生成的一類雙酪氨酸蛋白質(zhì)交聯(lián)物〔1〕，不但是氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物，而且參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展〔2，3〕。前期研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)AOPPs升高，血清AOPPs蓄積水平與腰椎骨密度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系〔4〕；大鼠體內(nèi) AOPPs 蓄積水平與增齡性骨量丟失呈負(fù)相關(guān)關(guān)系〔5〕；AOPPs體內(nèi)干預(yù)可加速老齡大鼠骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)退化，增強(qiáng)氧化應(yīng)激水平〔6〕；AOPPs體外干預(yù)可抑制成骨樣細(xì)胞增殖、降低成骨分化活性〔7〕。這些研究表明AOPPs可能是一類新的致病介質(zhì)，參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展。破骨細(xì)胞分化增加及骨吸收功能增強(qiáng)，易導(dǎo)致骨量丟失增加、加速骨代謝失衡。本研究擬通過體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓單核細(xì)胞，并用AOPPs刺激，觀察AOPPs對其向破骨細(xì)胞分化的影響，以期進(jìn)一步闡明AOPPs在骨質(zhì)疏松中的致病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大鼠血清白蛋白(RSA，Sigma)；次氯酸鈉(分析純,PanEra LifeScience)；冰醋酸(分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司)；氯胺-T(Sigma);2',7'-二氫二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA熒光探針，Sigma)；重組大鼠RANKL蛋白(RANKL，Abcam)；巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF,PeproTech)；胎牛血清(FBS，Sigma)；夾竹桃麻素(Apocynin，Sigma)；大鼠淋巴細(xì)胞分離液(Panera)；骨磨片(南方醫(yī)院骨與軟骨再生醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈)；激光共聚焦顯微鏡(日本歐林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會社，F(xiàn)V10i)；酶標(biāo)儀(美國MDS公司，M5)；倒置顯微鏡(德國Leica儀器股份有限公司，DM IL LED)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng) 取雄性4周齡SD大鼠，無菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨和脛骨；超凈臺中剔除骨組織周圍的軟組織，剪開干骺端，用5 ml無菌注射器抽取無血清α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)柔沖骨髓腔4次，收集沖洗液以450 r/min離心15 min，棄上清，以80% 標(biāo)準(zhǔn)FBS α-MEM培養(yǎng)液懸浮沉淀，制成細(xì)胞濃度為 2×108～1×109/ml的單細(xì)胞懸液備用。先加入與骨髓單細(xì)胞懸液等量的分離液，用移液槍小心吸取骨髓單細(xì)胞懸液樣本加于分離液液面上，注意保持二者分界液面平穩(wěn)，450 r/min離心25 min。離心后，用移液槍小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一15 ml離心管中，向離心管中加入10 ml清洗液，輕柔混勻，250 r/min離心10 min。棄上清，重復(fù)清洗步驟2次。用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS、50 ng/ml M-CSF 的α-MEM培養(yǎng)液10 ml重懸單核細(xì)胞后接種于100 mm培養(yǎng)皿。

1.2.2 骨髓單核細(xì)胞鑒定 接種后3 d的原代骨髓單核細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化下來，計數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為106個/ml，離心以去除培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次后加入100 μl PBS重懸，并標(biāo)記為1、2管。1管為陰性對照，2管加入2 μl CD14直標(biāo)熒光抗體，冰上靜置反應(yīng)30 min。離心后加入PBS清洗1次，每管加入400 μl的2%多聚甲醛，轉(zhuǎn)移到流式管后上機(jī)檢測。

1.2.3 AOPPs體外制備 根據(jù)前期報道的體外制備AOPPs的方法〔8〕，將RSA(20 mg/ml)與40 mmol/L的次氯酸等體積混合，室溫下放置反應(yīng)30 min，制備出來的RSA與次氯酸摩爾比為1/70。制備的AOPPs在無內(nèi)毒素PBS 中透析24 h，以除去游離的次氯酸。用 0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存。20 mg/ml RSA與PBS等體積混合，作為對照組。采用氯胺-T法測量制備的AOPPs濃度：AOPPs與PBS按1∶5稀釋，氯胺-T同法稀釋RSA與PBS混合物作空白對照，加入1.16 mmol/L碘化鉀(KI)10 ml及乙酸20 ml后立刻在340 nm處檢測吸收值，AOPPs濃度以氯胺-T含量表示(μg/ml)。

1.2.4 細(xì)胞干預(yù)條件 為了觀察AOPPs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的作用，取對數(shù)生長期骨髓單核細(xì)胞接種于96孔板中，4 000個細(xì)胞/孔。過夜預(yù)培養(yǎng)(37℃、5%CO2)后，分別設(shè)置為空白對照組，RSA組(100 μg/ml)，陽性對照組(RANKL，50 ng/ml)，AOPPs刺激組(100 μg/ml)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制劑組(AOPPs 100 μg/ml+夾竹桃麻素100 μmol/L)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。每2 d換一次液，持續(xù)誘導(dǎo)6 d。

為了觀察AOPPs對細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成的影響，取對數(shù)生長期骨髓單核細(xì)胞接種于96孔板中，4 000個細(xì)胞/孔。過夜預(yù)培養(yǎng)(37℃、5%CO2)后，分別設(shè)置空白對照組、RSA組(100 μg/ml)、AOPPs 50 μg/ml刺激組、AOPPs 100 μg/ml刺激組、AOPPs 150 μg/ml刺激組、NADPH氧化酶抑制劑組(AOPPs 100 μg/ml +夾竹桃麻素100 μmol/L)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，刺激2 h后測量ROS生成。

1.2.5 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 TRAP是破骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志酶，TRAP染色是鑒定破骨細(xì)胞的常用方法之一〔8〕。TRAP染色液的配制：取0.5 ml快速石榴石型堿溶液與0.5 ml亞硝酸鹽溶液，輕輕混勻30 s，室溫靜置2 min。取預(yù)熱(37℃)去離子水45 ml，分別加入上述混合溶液，0.5 ml萘酚 AS-BI磷酸溶液(Naphthol AS-BI Phosphate Solution)，2.0 ml醋酸鹽溶液，1.0 ml酒石酸鹽溶液混合備用。

骨髓單核細(xì)胞被誘導(dǎo)6 d后，細(xì)胞經(jīng)PBS洗3次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄多聚甲醛，預(yù)熱(37℃)去離子水洗細(xì)胞3遍。將配制好的TRAP染液加入細(xì)胞中，水浴(37℃)避光孵育60 min，去離子水徹底清洗后蘇木素復(fù)染2 min，堿性自來水沖洗至出現(xiàn)藍(lán)色的細(xì)胞核。TRAP染色陽性多核細(xì)胞為胞質(zhì)呈大量酒紅色顆粒，細(xì)胞大小不一，有許多細(xì)長的偽足樣突起，細(xì)胞形態(tài)呈油煎蛋形等多邊形，胞核多，細(xì)胞核>3個為破骨細(xì)胞。

1.2.6 羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色 F肌動蛋白(F-actin)環(huán)形成是成熟破骨細(xì)胞被激活發(fā)揮骨吸收功能的標(biāo)志，羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色是判斷F-actin環(huán)形成的有效方法〔8〕。

取對數(shù)生長期骨髓單核細(xì)胞4×105個/皿接種于共聚焦皿中，誘導(dǎo)6 d后，棄培養(yǎng)基，預(yù)溫(37℃)PBS清洗細(xì)胞2次，5 min/次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗3次、10 min/次。5%Triton室溫透膜5 min，PBS清洗3次，10 min/次后每皿加入500 μl羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Rhodamine Phalloidin) 室溫避光孵育30 min，PBS清洗3次，5 min/次。加500 μl DAPI染液染色10 min，PBS清洗3次，5 min/次，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 骨吸收染色 取對數(shù)生長期的骨髓單核細(xì)胞以4×104個/孔接種于預(yù)置骨磨片的48孔板中，過夜預(yù)培養(yǎng)(37℃、5%CO2)，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置空白對照組，RSA組(100 μg/ml)，陽性對照組(RANKL，50 ng/ml)，AOPPs刺激組(100 μg/ml)，NADPH氧化酶抑制劑組(AOPPs 100 μg/ml+夾竹桃麻素100 μmol/L)，每組設(shè)置3個復(fù)孔。誘導(dǎo)6 d后取出各組骨磨片，0.25%氫氧化銨超聲5 min/次×3次，經(jīng)梯度酒精(40%，70%，80%，90%，100%)脫水后自然晾干，預(yù)熱56℃ 0.5%甲苯胺藍(lán)染色10 min，去離子水清洗后光學(xué)顯微鏡下觀察骨吸收陷窩。

1.2.8 ROS生成檢測 取對數(shù)生長期骨髓單核細(xì)胞以4 000個/孔接種于96孔板中，過夜預(yù)培養(yǎng)(37℃、5%CO2)，待細(xì)胞貼壁后，分別設(shè)置空白對照組、RSA組(100 μg/ml)、AOPPs 50 μg/ml刺激組、AOPPs 100 μg/ml刺激組、AOPPs 150 μg/ml刺激組、NADPH氧化酶抑制劑組(AOPPs 100 μg/ml +夾竹桃麻素100 μmol/L)，預(yù)培養(yǎng)2 h，PBS輕柔徹底清洗細(xì)胞以除去牛血清，加入DCFH-DA熒光探針，37℃孵育30 min，用PBS清洗2次，熒光酶標(biāo)儀激發(fā)光為488 nm，吸收光為525 nm檢測。

取對數(shù)生長期的骨髓單核細(xì)胞以4×105個/皿接種于共聚焦皿中，過夜預(yù)培養(yǎng)(37℃、5%CO2)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入完全培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基+RSA，完全培養(yǎng)基+AOPPs，完全培養(yǎng)基+AOPPs+夾竹桃麻素，預(yù)培養(yǎng)2 h，PBS輕柔徹底清洗細(xì)胞以除去牛血清，加入DCFH-DA熒光探針，37℃30 min，用PBS清洗2次，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD法檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓單核細(xì)胞鑒定 CD14陽性細(xì)胞即為大鼠骨髓單核細(xì)胞，約占檢測細(xì)胞的50%。

2.2 AOPPs 誘導(dǎo)TRAP染色陽性多核細(xì)胞形成 誘導(dǎo)6 d后的骨髓單核細(xì)胞經(jīng)TRAP染色，倒置顯微鏡觀察，AOPPs組及RANKL陽性對照組均見TRAP染色陽性多核細(xì)胞形成，而空白對照組、RSA組及AOPPs +夾竹桃麻素組未見TRAP染色陽性多核細(xì)胞形成。見圖1。

2.3 AOPPs 誘導(dǎo) F-actin環(huán)形成 誘導(dǎo)6 d后的骨髓單核細(xì)胞行羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，AOPPs組及RANKL陽性對照組均見呈圓形或類圓形的F-actin環(huán)形成，而空白對照組、RSA組、AOPPs +夾竹桃麻素組中未見明顯的F-actin環(huán)。見圖2。

2.4 AOPPs增加骨吸收陷窩形成 骨吸收實(shí)驗(yàn)表明，誘導(dǎo)6 d后，甲苯胺藍(lán)染色示RANKL組及AOPPs組的骨磨片上出現(xiàn)類圓形藍(lán)色骨吸收陷窩。相比之下，空白對照組、RSA組、AOPPs +夾竹桃麻素組中的骨磨片則無明顯骨吸收陷窩形成。見圖3。

圖1 AOPPs 誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞向TRAP陽性多核細(xì)胞形成

圖2 AOPPs 誘導(dǎo)F-actin環(huán)形成(箭頭標(biāo)示)

圖3 AOPPs增加骨吸收陷窩形成

2.5 AOPPs 增加ROS生成 予 50、100、150 μg/ml AOPPs 刺激骨髓單核細(xì)胞，顯示隨著劑量濃度的增加,細(xì)胞 ROS 的生成逐漸增加〔分別為(251.58±43.89)%，(297.35±4.59)%，(284.41±19.99)%〕,其中 100 μg/ml AOPP 產(chǎn)生的 ROS 濃度最高，且各濃度組與對照組〔(97.47±9.31)%〕之間差異顯著，加入夾竹桃麻素可明顯抑制 AOPPs誘導(dǎo)的 ROS 生成〔(112.64±16.52)%〕(P<0.05)。

在共聚焦顯微鏡中觀察AOPP 刺激骨髓單核細(xì)胞產(chǎn)生ROS量的變化，細(xì)胞質(zhì)中可見到綠色的熒光顆粒，即為ROS的表達(dá)，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，表明胞內(nèi)ROS表達(dá)越高。與空白對照組、RSA組相比，AOPPs組的熒光強(qiáng)度明顯較強(qiáng)，而夾竹桃麻素能有效地抑制AOPPs導(dǎo)致的這一效應(yīng)。見圖4。

圖4 激光共聚焦分析AOPPs對骨髓單核細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響(×10)

3 討 論

AOPPs是體內(nèi)蛋白質(zhì)氧化修飾損傷的產(chǎn)物，也是氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志物。在慢性腎臟疾病、肥胖、糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征等慢性疾病患者中，血清AOPPs水平升高〔9〕。研究證實(shí)AOPPs能激活細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶，促使ROS生成，激活敏感的信號通道(如MAPK，NF-kappa B)，上調(diào)腫瘤壞死因子(TNF)-α 等炎癥因子表達(dá)〔10～13〕。因此，AOPPs是一類新型的致病介質(zhì)，可通過誘發(fā)氧化應(yīng)激參與多種疾病的病理過程。

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨的微結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鳎瑢?dǎo)致骨脆性增加容易發(fā)生骨折的全身性骨病〔14〕。在病理?xiàng)l件下，骨吸收超過骨形成，骨代謝失去平衡，發(fā)生骨質(zhì)疏松。破骨細(xì)胞作為骨吸收的主要細(xì)胞，對于骨量的變化具重要作用〔15〕。破骨前體細(xì)胞的分化成熟和成熟破骨細(xì)胞的活化是骨吸收作用的前提，破骨細(xì)胞分化研究對骨質(zhì)疏松的機(jī)制探討及其防治具有重要意義。前期研究證實(shí)AOPPs與骨質(zhì)疏松存在相關(guān)性，并且可抑制成骨樣細(xì)胞增殖、降低成骨分化活性〔4～7〕，但是 AOPPs是否參與調(diào)控破骨細(xì)胞分化及活性尚不清楚。TRAP 為破骨細(xì)胞特異性的標(biāo)志酶，在成熟破骨細(xì)胞和融合前單核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)。既往研究證實(shí)RANKL是破骨細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞(如骨髓單核細(xì)胞，外周血單核細(xì)胞，RAW264.7 細(xì)胞)向TRAP染色陽性細(xì)胞分化，即誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成〔16〕。本研究結(jié)果表明AOPPs可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。

破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收時，形成一個富含F(xiàn)-actin環(huán)的縫合區(qū)錨定在骨質(zhì)上，分泌質(zhì)子和蛋白酶，溶解和降解骨基質(zhì)〔17〕。因此，F(xiàn)-actin環(huán)形成是成熟破骨細(xì)胞被激活后發(fā)揮骨吸收活性的標(biāo)志。F-actin環(huán)可以通過羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色顯示出來〔8〕。已證實(shí)AOPPs干預(yù)骨髓單核細(xì)胞可誘導(dǎo)F-actin環(huán)形成，這一效應(yīng)與陽性對照RANKL組類似，而空白對照組及陰性對照組未發(fā)現(xiàn)F-actin環(huán)形成。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AOPPs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化及骨吸收活性，本研究檢測AOPPs誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化后骨吸收作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AOPPs能促進(jìn)破骨細(xì)胞骨吸收功能，這一作用與RANKL組效應(yīng)類似。因此，AOPPs可誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟，并發(fā)揮骨吸收功能。

NADPH 氧化酶表達(dá)于大多數(shù)細(xì)胞，包括破骨前體細(xì)胞以及破骨細(xì)胞，是細(xì)胞內(nèi) ROS 產(chǎn)生的主要途徑之一〔18〕。NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS為破骨細(xì)胞分化過程必需的信號分子。本研究發(fā)現(xiàn)，AOPPs可促進(jìn)骨髓單核細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素顯著降低AOPPs誘導(dǎo)的ROS生成，說明NADPH氧化酶在該效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。夾竹桃麻素也能抑制AOPPs誘導(dǎo)的TRAP陽性細(xì)胞及F-actin環(huán)形成。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可能在AOPPs誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟中發(fā)揮重要作用。總之，AOPPs作為一類新型的致病介質(zhì)，能促進(jìn)骨髓單核細(xì)胞內(nèi)ROS生成，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟，發(fā)揮骨吸收功能。這些發(fā)現(xiàn)為探索骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了新的思路。

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〔2016-03-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

Advanced oxidation protein products induced the osteoclast differentiation of rat bone marrow mononuclear cells in vitro

ZHUANG Jing-Shen，ZHU Si-Yuan，HUANG Yu-Sheng，etal.

Department of Orthopedic and Spinal Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China

Objective To evaluate the effect of advanced oxidation protein products (AOPPs) on osteoclast differentiation in vitro.Methods Rat bone marrow mononuclear cells were isolated and cultured in vitro, and divided into the blank control，negative control(RSA), positive control(RANKL), AOPPs, NADPH oxidase inhibitor groups (AOPPs+ Apocynin). After treatment for 6 days, the TRAP-positive multinuclear cells were observed by using tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining，the F-actin ring by phalloidine fluorescence staining，the bone resorption pits on bone slices by toluidine blue. Furthermore, intracellular reactive oxygen species (ROS) generation were detected by DCFH-DA fluorescent probe after AOPPs stimulation for 2 hours.Results The TRAP-positive multinuclear cells, F-actin ring and bone resorption pits on bone slices were observed in AOPPs and RANKL positive control groups. Meanwhile, AOPPs stimulation increased ROS generation. However,the above effects of AOPPs challenge were abolished by the apocynin, a NADPH oxidase inhibitor.Conclusions AOPPs could induce the osteoclast differentiation of rat bone marrow mononuclear cells in vitro, which provides a new sight in understanding the pathogenic basis of osteoporosis.

Advanced oxidation protein products; Bone marrow mononuclear cells; Osteocalst; Differentiation

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81000785,81472135)

鐘招明(1946-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

莊景燊(1994-)，男，碩士，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

R681

A

1005-9202(2017)03-0521-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.001