于盛竹，成華峰

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，哈爾濱 150030； 2.黑龍江省家畜遺傳資源保護中心 150069)

豬性控精子的篩選方法介紹

于盛竹1，成華峰2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱150030； 2.黑龍江省家畜遺傳資源保護中心150069)

細胞染色技術的改進以及采用熒光染料標記活精子的DNA為篩選X或Y精子，進而生產(chǎn)性控后代提供了重要的技術保障。采用流式細胞儀/細胞分選系統(tǒng)篩選精子，雖然其原理依然是X和Y精子DNA含量不同，但對細胞分選系統(tǒng)進行一定程度的改進，以便能夠更準確地測定X和Y精子DNA含量的差別。以前的“標準”細胞分選系統(tǒng)樣品是在0.84 kg/cm2的壓力下測定的，分選速度為350 000個精子/h。后來人們改進了細胞分選系統(tǒng)，樣品是在0.84～4.22 kg/cm2的壓力下篩選的，分選速度為每小時6×106個X精子和6×106個Y精子，如果只分選X精子(純度為85%)或Y精子(純度為90%)，則分選速度可達到1.1×107個/h。

1 篩選精子性別進行性控的基本方法

精子樣品的制備：最為關鍵的是制備過程中對精子的損傷越小，分選的精子數(shù)量越多，受精能力越強。制樣過程中可能對精子造成損傷的環(huán)節(jié)主要有精液中加入染料、精子進入分選系統(tǒng)時壓力的變化等。采用高速分選系統(tǒng)時，可將精液制備成每毫升含1.5億個精子，標準分選系統(tǒng)時其量加大10倍，按比例以8 μL/mL(5 mg/mL母液)的速度加入Hoechst 33342，然后在35℃條件下溫育1 h，以便使染料能均勻通過細胞膜，減少測定誤差。

分選精子的收集：收集分選精子時最為重要的是精子活力的保存。在精子分選過程中樣品的稀釋倍數(shù)應該越小越好。分選精液的精子濃度應該低于1.5億/mL(射出精液的濃度一般為：豬3億/mL；牛10億/mL)。當熒光染色的精子進入流式細胞儀測定室時，其周圍包有一層由含0.1%BSA的PBS組成的保護層，PBS可以增加稀釋效果，BSA可以減少精子的凝集。分選時可將精子分選進入含卵黃的稀釋液中，20%的TEST-卵黃的稀釋效果更好。標準分選系統(tǒng)可采用0.5 mL小管(含50 μL 20%TEST-卵黃)，高速分選系統(tǒng)可用15 mL試管(含500 μL 20%TEST-卵黃)。分選時，精子進入該試管，而活精子則繼續(xù)其向下運動進入試管底部的TEST-卵黃稀釋液中。分選結束后將收集的精液樣品以(350～750)g的速度離心10 min，然后精液就可用來進行AI后IVF。整個分選是在室溫下進行的。分選的精子要進行IVF時，TEST-卵黃中卵黃的比例可降低到5%以下，太高將會干擾IVF時的受精過程。一般采用的卵黃濃度為2%。在分選系統(tǒng)的稀釋液中也可加入同種動物的精清，但有研究表明，在2%的TEST-卵黃加入10%的精清可使表現(xiàn)頂體反應精子的百分比降低。分選的精子會提前獲能，這種情況與豬精子在冷凍時的反應相似。雖然發(fā)生這種變化不利于精子的保存，但由于事實上精子已經(jīng)是獲能的，因此可馬上用來進行IVF。采用這種技術篩選的精子純度可以達到95%。對一些DNA含量差異大的動物，例如南美栗鼠，為7.5%，純度可以達到100%。一般來說，DNA含量差別超過3.5%時可以獲得很高的純度，但死精子、形態(tài)異常的精子及精子頭部的形狀可能會影響篩選結果。

篩選精子性別的驗證：在分選過程中或在其完成之后，可用一預先用BSA浸泡過的試管收集部分分選過的樣品，但不需要加入TEST-卵黃，然后用超聲波處理除去精子尾部，加入Hoechst 33342并保持染色的均勻性，再用流式細胞儀測定精子性別。也可采用FISH技術測定攜帶Y微衛(wèi)星DNA的Y精子鑒別，兩者之間的準確性沒有明顯差別。此外，也可采用PCR技術。但FISH和PCR技術需要3～4 h，而測定DNA含量的流式細胞儀方法只需要30 min。

2 分選精子的生育能力

在豬采用輸卵管內(nèi)輸精及IVF技術進行試驗，所產(chǎn)仔豬均為預選性別。采用IVF技術后卵裂率為56%，將2～4細胞階段的胚胎移植，所有移植的胚胎均為篩選的X精子IVF所得，所產(chǎn)仔豬均為雌性。在采用分選精子進行IVF時應該注意，在精子分選后盡快進行IVF，因為分選過程可能加快了精子的獲能。雖然也可在分選后較長時間進行IVF，但精子活力明顯降低。

性控精子在養(yǎng)豬業(yè)和養(yǎng)牛業(yè)中具有極其廣泛的應用前景。結合采用IVF/ET技術就可以產(chǎn)生一窩同性別的豬，在豬也可采用手術輸精和腹腔鏡輸精的方法將性控精液輸?shù)绞芫课?。豬的常規(guī)AI技術每輸精劑量需要3億精子，這一劑量基本不可能在性控精液中采用，因此目前人們正在研究采用低劑量輸精的技術，例如可采用內(nèi)窺鏡將少量精液輸?shù)綄m-管結合部。目前取得的結果是比較令人滿意的，也可采用這種技術用性控精液輸精。對豬受精最少需要精子數(shù)量的研究表明，如果將精液輸?shù)阶訉m遠端，則只需要1千萬個精子。從這些研究結果可以看出，如果在養(yǎng)豬業(yè)中采用AI技術，就很有必要對最少的輸精劑量進行研究，如果能將每次輸精的精子數(shù)量降低到5百萬以下，則完全可以采用性控精液。

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2017-07-04