程蘭芳，丁潔瓊，高彥茹，何智斌

(1.武漢市武昌醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430063；2.武漢市武昌醫(yī)院痔瘺科；3.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室)

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無創(chuàng)性快速產(chǎn)前檢測染色體非整倍體方法的研究進展*

程蘭芳1，丁潔瓊3，高彥茹3，何智斌2*

(1.武漢市武昌醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430063；2.武漢市武昌醫(yī)院痔瘺科；3.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室)

染色體異常中約75%為非整倍體，最常見的為21三體。核型分析為診斷性檢測染色體非整倍體提供了金標(biāo)準(zhǔn)。然而，羊水、絨毛膜等標(biāo)本來源具有創(chuàng)傷性，且結(jié)果回報時間超過2周。妊娠母體血中存在胎兒DNA使無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測成為可能，其后發(fā)展了多種分子生物學(xué)技術(shù)快速診斷染色體非整倍體。近來，游離胎兒RNA、胎兒DNA甲基化、比較基因組雜交等技術(shù)也用于研究無創(chuàng)性快速產(chǎn)前檢測染色體非整倍體。本文就無創(chuàng)性快速產(chǎn)前檢測染色體非整倍體方法的研究進展做一綜述。

染色體非整倍體；核型分析；無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測；快速診斷方法

染色體異常是導(dǎo)致不育的主要原因，其中75%為染色體非整倍體，是由于基因遺傳排列紊亂導(dǎo)致染色體量的異常；13%為多倍體；8%為性染色體異常；4%為結(jié)構(gòu)失衡。常見的染色體非整倍體為21、13和18號染色體三體，21三體即唐氏綜合征[1]，是由于21號染色體發(fā)生了額外的全部或部分復(fù)制，發(fā)病率約為1/800～1/600，高齡產(chǎn)婦的發(fā)病率較高。唐氏綜合征患兒伴有智力障礙，嚴(yán)重的聽力困難，甚至由于長期健康問題如心臟疾病等導(dǎo)致死亡[2]，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。防止染色體非整倍體患兒的出生依賴于產(chǎn)前篩查及診斷，現(xiàn)今，最有效的篩選胎兒染色體非整倍體的方法是危險性評估。

1 篩查染色體非整倍體

篩查染色體非整倍體分兩步，第一步是進行21三體等染色體非整倍體的危險性評估。檢測妊娠母體血清中的生物標(biāo)志物[3]，如甲胎蛋白、未結(jié)合的雌三醇、絨毛膜促性腺激素、妊娠相關(guān)血清蛋白A、抑制素A等，同時超聲評估胎兒頸部半透明層厚度，并綜合考慮其它因素如母體年齡等。第二步是對危險性較高的患者進一步進行診斷性檢測。通過羊水穿刺或絨毛膜穿刺等創(chuàng)傷性方法收集胎兒物質(zhì)如羊水或絨毛膜，細胞培養(yǎng)后使用顯微鏡觀察染色體帶(核型)進行分析[4]。

然而，核型分析中羊水或絨毛膜標(biāo)本由創(chuàng)傷性程序獲得。這些創(chuàng)傷性診斷方法不僅價格昂貴，要求專業(yè)的技術(shù)人員參與，而且對胎兒有很大的危險，G帶核型技術(shù)分辨率為5～10Mb，不能鑒定更微小的微絲粒區(qū)域重排。另外，細胞培養(yǎng)過程中也可能由于外源性污染等導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，甚至選擇性地生長母體來源細胞。更重要的是，核型分析之前需要培養(yǎng)細胞10～14d，結(jié)果回報時間長。產(chǎn)前檢測主要需要解決兩個問題：①盡可能地避免不必要的創(chuàng)傷性檢測程序。②快速分子檢測以縮短結(jié)果回報時間。因此，很多研究致力于尋找新的無創(chuàng)性方法進行快速產(chǎn)前診斷染色體非整倍體，此研究在發(fā)現(xiàn)母體血循環(huán)中存在胎兒DNA之后有了重大突破。

2 母體血循環(huán)中存在胎兒DNA

無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的策略是基于觀察到血漿中存在游離循環(huán)核酸，且在癌癥患者血漿中增加。妊娠母體血循環(huán)中存在完整的胎兒細胞及游離的胎兒DNA，均可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。母體血循環(huán)中完整的胎兒細胞很少(約1mL母體血中1個細胞)，富集效率很低，分娩之后在母體循環(huán)中持續(xù)存在。游離的胎兒DNA來源于合體滋養(yǎng)層凋亡后碎片，代表了細胞外DNA，其平均大小為300bp或者更小。在分娩后從母體循環(huán)中快速被清除，平均半衰期為16min。因此，游離胎兒DNA較完整的胎兒細胞更有利于用于產(chǎn)前診斷。然而，游離胎兒DNA僅占血循環(huán)中游離DNA的3%～6%，大部分均為較大片段的母體游離DNA。近年來使用更精確的數(shù)字PCR技術(shù)表明游離胎兒DNA的百分比可能近10%。母體血漿與血清中均存在游離胎兒DNA，產(chǎn)前診斷優(yōu)先使用血漿，因為其包含較少的母體DNA背景。1997年，Lo等[5]報道，30名男性胎兒及13名女性胎兒母體血循環(huán)中使用10μL的血液樣本用于PCR，結(jié)果顯示血漿中檢測出24例Y染色體陽性信號，血清中檢測出21例Y染色體陽性信號。至此，一個新的無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測時代來臨。使用游離胎兒DNA在無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用包括以下幾個方面[6]：①決定胎兒性別；②決定胎兒RHD；③胎兒單基因常染色體紊亂；④胎兒標(biāo)志物；⑤妊娠并發(fā)癥；⑥無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體。

3 無創(chuàng)性快速產(chǎn)前檢測染色體非整倍體方法

母體血循環(huán)中存在胎兒DNA為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了基礎(chǔ)，而分子生物學(xué)檢測方法則對于降低檢測周期從1～2周至1～2d具有重要作用。快速非整倍體診斷(rapid aneuploidy detction，RAD)[7]方法包括熒光染色體原位雜交(fluorescence chromosomal in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(fluorescent quantitation polymerase chain reaction，QF-PCR)、多種多樣連接依賴的探針擴增(multiplex ligation dependent probe amplification，MLPA)等。同時，根據(jù)母體血循環(huán)中存在胎兒RNA、胎兒DNA和母體DNA差異性甲基化、比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH)、二代測序等方法也可用于無創(chuàng)性快速產(chǎn)前檢測染色體非整倍體。

3.1 FISH FISH用于快速產(chǎn)前檢測染色體非整倍體，在過去20年間得到快速發(fā)展。FISH使用羊水等樣本直接計數(shù)靶胎兒細胞內(nèi)可見的熒光信號。Jia等[8]報道，F(xiàn)ISH分析4210例羊水細胞標(biāo)本，并與經(jīng)典的核型分析結(jié)果比較，結(jié)果表明，97例為非整倍體，兩種方法的一致性為97.9%，其中兩種方法檢測21、13、18三體的一致性為100%。FISH易操作、快速、高度敏感，然而，商業(yè)化探針價格昂貴。間期FISH有兩個缺點，第一是FISH為高度密集型，耗費勞力。第二是可檢測的位點少于12個，不易用于大量樣本的臨床檢測。

3.2 PCR QF-PCR是基于檢測熒光信號，與產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物成比例。QF-PCR分析用于檢測染色體非整倍體首次報道于20世紀(jì)90年代[9]，用于快速診斷(1或2d)常見的非整倍體(13、18、21、三倍體及性染色體非整倍體)。使用熒光引物PCR擴增13、18、21、X和Y染色體中的高度多態(tài)性的短串聯(lián)重復(fù)序列，隨之由分析儀自動化分析熒光強度。QF-PCR的優(yōu)點包括自動化、便宜、快速而且敏感，可用于檢測低拷貝的DNA，可同時進行大量樣本檢測；缺點是多種引物配對則定量的可靠性較差。MLPA也是基于PCR擴增理論，首次報道于2002年[10]，可用于檢測基因定量異常。MLPA不是核酸而是探針加入樣品中用于擴增及定量。每個PCR產(chǎn)物的相對定量是與靶序列中拷貝數(shù)量成比例的。MLPA優(yōu)點：一個反應(yīng)管中可包括50個不同的靶序列；不需要培養(yǎng)細胞；不是勞動密集型；便宜；檢測可于30h內(nèi)完成。主要缺點是為了區(qū)別擴增產(chǎn)物，探針包含一個非雜交的填充序列。因此，MLPA限制了探針的數(shù)量。

3.3 RNA 除了游離的胎兒DNA，胎盤起源的游離胎兒RNA也存在于母體血漿。通過分析胎盤特異性的mRNA，可用于檢測胎兒染色體非整倍體，如定位于21號染色體的mRNA轉(zhuǎn)錄本(Placenta specific-4，PLAC4)和18號染色體的mRNA轉(zhuǎn)錄本(serpin peptidase inhibitor clade b2，SERBINB2)。PLAC4mRNA首次報道用于檢測21染色體三體[11]，可將10例21三體病例從56例健康病例中區(qū)別開來，敏感性為90.1%，物異性為96.0%。使用SERBINB2mRNA用于檢測18三體，四例18三體中有3例可鑒定為愛德華綜合征。胎盤miRNAs也可存在于母體血漿，miRNAs為短的、19～25個核苷酸、單鏈、非編碼的RNA。miRNAs可結(jié)合于靶mRNA的3' 端未翻譯區(qū)域進行調(diào)節(jié)，多種miRNAs可調(diào)節(jié)單個基因，同時一種miRNAs可調(diào)節(jié)多個基因。母體血漿中大量胎盤miRNAs可能提供了一種無創(chuàng)性的工具用于監(jiān)測胎盤中基因調(diào)節(jié)。

3.4 DNA甲基化 DNA甲基化是化學(xué)修飾的一種形式，將甲基添加到DNA分子上，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。使用差異性DNA甲基化的方法可用于區(qū)別不同起源的組織或細胞。使用母體與胎兒的差異性DNA甲基化用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷首次報道于2002年，乳腺絲氨酸蛋白酶抑制物(SERPINB5)，定位于18號染色體，在胎盤中低甲基化，但是在母體血中高甲基化[12]。因此，檢測SERPINB5基因的低甲基化與高甲基化比率可用于檢測胎兒18三體。人類PDE9A基因[13]，編碼cGMP特異性的磷酸二酯酶類(phosphodiesterases，PDEs)，定位于染色體21q22.3，表達于除血液外的大多數(shù)組織。Chim等[14]報道，PED9A在母體血中完全甲基化，但在胎兒組織(胎盤)中無甲基化。因此，PED9A標(biāo)志物可獨立于胎兒性別和基因型用于檢測胎兒染色體非整倍體。Papageorgiou等[15]報道，14例21三體病例及26例正常對照，在孕期11.1～14.4周，采用胎兒特異性的甲基化比例可正確診斷胎兒21三體。

3.5 CGH CGH是一種高效的細胞遺傳學(xué)技術(shù)，用于高分辨率、基因組范圍篩選基因片段的變異[16]。陣列CGH早期使用的形式是BAC基礎(chǔ)的陣列，基因組為BAC克隆(100～200kb)或者是合成的長度為25～75bp的寡核苷酸探針。陣列CGH的優(yōu)點是分辨率高，若CGH用于產(chǎn)前診斷，胎兒細胞是由無創(chuàng)性產(chǎn)前程序獲得，且不必要培養(yǎng)，因此結(jié)果回報可能更迅速。CGH檢測也可用于自動化及高通量分析[17]，缺點如下：①要求事先知道基因組序列；②交互性雜交存在于相似的序列中；③很難檢測低豐度的靶點；④樣本DNA要求微克級的?！暗诙被颉傍B槍法”測序則可解決以上這些問題。

3.6 二代測序 二代測序有如下特點：①知道基因組序列有幫助但不是必須的；②無實驗性偏倚及交互雜交問題；③二代測序方法同等適用于檢測樣本中低豐度和高豐度的靶點序列；④需要鈉克級而不是微克級樣本DNA。二代測序可用于直接分析母體血漿中胎兒游離DNA并用于檢測胎兒非整倍體。然而，高通量的DNA序列測定要求大量的生物信息用于分析，因此價格昂貴很難用于常規(guī)實驗。巨大的平行的DNA鳥槍法測序(massively parallel DNA shotgun sequencing，MPSS)游離胎兒DNA片段用于決定其特異性的染色體起源。如21號染色體片段的百分比略有升高則表明胎兒可能有21三體，也有報道MPSS用于評估18三體和13三體[18]。MPSS是從完整的基因組中隨機分析DNA，盡管前景不錯，但是較復(fù)雜且具有高昂的花費。然而，數(shù)字分析選擇性區(qū)域(Digital Analysis of Selected Regions，DANSR)可選擇性評估來源于胎兒游離DNA的特異性基因組片段，使測序結(jié)果更有效并降低了成本[19]。同時，與一種新型的分析公式相結(jié)合，即胎兒部分三體的最大風(fēng)險評估(Fetal-fraction Potimized Risk of Trisomy Evaluation，F(xiàn)ORTE)，這種信息能夠提供三體危險性的個體評估[20]。在最近發(fā)表的獨立研究中，來源于400個11～13孕周的染色體整倍體孕婦，使用DANSR和FORTE可用于鑒別所有的21三體及98%的18三體病例[21]。

4 展 望

近來，新的分子技術(shù)應(yīng)用于無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測染色體非整倍體領(lǐng)域。但是這些技術(shù)由于設(shè)備及價格昂貴，后續(xù)的生物信息分析難以完成，也要求考慮到倫理、法律和社會等問題[22]，很少用于臨床實踐中。因此，我們需要尋找大量的生物標(biāo)志物，明確個體的基因組差異，增加篩選的精確性，將檢測僅實施于高危險組。同時，我們需要將多種方法聯(lián)合檢測增強敏感性和特異性，最終實現(xiàn)無創(chuàng)性快速產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體的長期目標(biāo)。

[1]BRIGIDA A L，SINISCALCO D.Induced pluripotent stem cells as a cellular model for studying down syndrome[J].J Stem Cells Regen Med，2016，12(2):54

[2]MUNNANGI S，GROSS S J，MADANKUMAR R.et al.Pregnancy associated plasma protein-A2：a novel biomarker for Down syndrome[J].Placenta，2014，35(11):900

[3]TSUI N B，KADIR R A，CHAN K C，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of hemophilia by microfluidics digital PCR analysis of maternal plasma DNA[J].Blood，2011，117(13):3684

[4]LUI S，SONG L，CRAM D S，et al.Traditional karyotyping versus copy number variation sequencing for detection of chromosomal abnormalities associated with spontaneous miscarriage[J].Ultrasound Obstet Gynecol，2015，46(4):472

[5]LO Y M，CORBETTA N，CHAMBERLAIN PF，et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet，1997，350(9076):485

[6]DALEY R，HILL M，CHITTY L S.Non-invasive prenatal diagnosis：progress and potential[J].Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，2014，99(5):F426

[7]EMAD A，LAMOUREUX J，OUELLET A，et al.Rapid aneuploidy detection of chromosomes 13，18，21，X and Y using quantitative fluorescent polymerase chain reaction with few microdissected fetal cells[J].Fetal Diagn Ther，2015，38(1):65

[8]JIA C W，WANG S Y，MA Y M，et al.Fluorescence in situ hybridization in uncultured amniocytes for detection of aneuploidy in 4210 prenatal cases[J].Chin Med J(Engl)，2011，124(8):1164

[9]MANSFIELD E S.Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms.Hum Mol Genet，1993，2(1):43

[10]SCHOUTEN J P，MCELGUNN C J，WAAIJER R，et al.Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification.Nucleic Acids Res，2002，30(12):e57

[11]LO Y M，TSUI N B，CHIU R W，et al.Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection.Nat Med，2007，13(2):218

[12]FUTSCHER B W，OSHIRO M M，WOZNIAK R J，et al.Role for DNA methylation in the control of cell type specific maspin expression[J].Nat Genet，2002，31(2):175

[13]ALEXANDER M S，GASPERINI M J，TSAI P T，et al.Reversal of neurobehavioral social deficits in dystrophic mice using inhibitors of phosphodiesterases PDE5A and PDE9A[J].Transl Psychiatry，2016，6(9):e901

[14]CHIM S S，JIN S，LEE T Y，et al.Systematic search for placental DNA-methylation markers on chromosome 21：toward a maternal plasma-based epigenetic test for fetal trisomy 21[J].Clin Chem，2008，54(3):500

[15]PAPAGEORGIOU E A，KARAGRIGORIOU A，TSALIKI E，et al.Fetal-specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21[J].Nat Med，2011，17(4):510

[16]HUNG C C，LIN C H，LIN S Y，et al.Prenatal diagnosis of a fetus with a de novo trisomy 12p by array-comparative genomic hybridization(array-CGH)[J].Gene，2012，495(2):178

[17]SAGOO G S，MOHAMMED S，BARTON G，et al.Cost effectiveness of using array-CGH for diagnosing learning disability[J].Appl Health Econ Health Policy，2015，13(4):421

[18]PALOMAKI G E，DECIU C，KLOZA E M，et al.DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome：an international collaborative study[J].Genet Med，2012，14(3):296

[19]SPARKS A B，WANG E T，STRUBLE C A，et al.Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy[J].Prenat Diagn，2012，32(1):3

[20]SPARKS A B，STRUBLE C A，WANG E T，et al.Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood：evaluation for trisomy 21 and trisomy 18[J].Am J Obstet Gynecol，2012，206(4):319.e1

[21]ASHOOR G，SYNGELAKI A，WAGNER M，et al.Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first-trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18[J].Am J Obstet Gynecol，2012，206(4):322.e1

[22]DE JONG A，DONDORP W J，F(xiàn)RINTS S G，et al.Advances in prenatal screening：the ethical dimension[J].Nat Rev Genet，2011，12(9):657

武漢市衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床醫(yī)學(xué)科研項目(WX14C68)

R596.1

A

2095-4646(2017)03-0274-03

10.16751/j.cnki.2095-4646.2017.03.0274

2016-12-26)

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