羅 敏，傅曉鐘,肖 濤，張文政，李 靜，陳 雅，劉 亭

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院、2.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3.民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004;4.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004)

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

人寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體1轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞與轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的比較研究

羅 敏1,3,4，傅曉鐘1,3,肖 濤1,3，張文政1,3，李 靜1,3，陳 雅1,3,4，劉 亭1,2

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院、2.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3.民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004;4.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的 篩選出更適宜的轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，提高構(gòu)建人寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體1(human peptide transporter 1，hPepT1)高表達(dá)細(xì)胞系的效率。方法 利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1(+)-hPepT1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)MDCK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞，并進(jìn)行單克隆細(xì)胞的挑選和擴(kuò)大培養(yǎng)。通過(guò)qRT-PCR與Western blot技術(shù)來(lái)檢測(cè)兩種受體細(xì)胞中hPepT1 mRNA與蛋白的表達(dá)水平，并利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對(duì)兩種單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞的hPepT1典型底物甘氨酰肌氨酸(Glysar)攝取能力進(jìn)行考察。 結(jié)果 MDCK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，hPepT1 mRNA與蛋白表達(dá)水平以及Glysar的攝取能力均明顯高于其野生型細(xì)胞(P<0.05)；雖然Glysar在HeLa細(xì)胞中的攝取量高于MDCK細(xì)胞，但MDCK-hPepT1細(xì)胞中hPepT1 mRNA與蛋白表達(dá)水平以及Glysar的攝取能力卻高于HeLa-hPepT1細(xì)胞。結(jié)論 在hPepT1穩(wěn)定高表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的構(gòu)建中，為提高h(yuǎn)PepT1的轉(zhuǎn)染效率，從而獲得更高效的轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，以MDCK細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞可能是更為適宜的選擇。

馬丁-達(dá)比犬腎上皮細(xì)胞；子宮頸癌細(xì)胞；人寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染；qRT-PCR；Western blot；Glysar攝取

人寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體1(human peptide transporter 1，hPepT1)是一種主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物小腸上皮刷狀緣膜基頂側(cè)[1]的腸肽轉(zhuǎn)運(yùn)體，能夠介導(dǎo)二肽、三肽化合物以及擬肽類(lèi)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收[2]，其對(duì)藥物在腸道的吸收和分布過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在很多新藥研發(fā)中，利用hPepT1為靶點(diǎn)進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)以改善藥物細(xì)胞膜透過(guò)性，從而提高藥物的生物利用度成為研究的熱點(diǎn)。此外，hPepT1在一些中藥單體的透腸吸收篩選中也具有重要意義。因此，如何高效快速地構(gòu)建一個(gè)hPepT1穩(wěn)定高表達(dá)的有效體外細(xì)胞模型，對(duì)以hPepT1為靶點(diǎn)的新藥合成研究以及某些中藥單體的篩選和吸收機(jī)制研究提供良好工具具有重要意義。目前，研究hPepT1介導(dǎo)的藥物吸收機(jī)制常用的體外細(xì)胞模型有hPepT1高表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型以及瘦素誘導(dǎo)的 Caco-2 細(xì)胞模型。而MDCK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞在hPepT1高表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的構(gòu)建中成為應(yīng)用最為廣泛的兩種受體細(xì)胞。MDCK-hPepT1細(xì)胞系與HeLa-hPepT1細(xì)胞系被廣泛用于hPepTl底物的研究[3-6]。但是，對(duì)于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞的選擇，究竟MDCK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞，哪一種細(xì)胞作為hPepT1轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞更為適宜，更有利于hPepT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立以及應(yīng)用，未見(jiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。因此，本實(shí)驗(yàn)分別構(gòu)建了MDCK-hPepT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系與HeLa-hPepT1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并對(duì)兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中hPepT1的表達(dá)水平、hPepT1典型底物甘氨酰肌氨酸(Glysar)的攝取能力進(jìn)行了驗(yàn)證比較，旨在找到更為適宜的轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，從而提高h(yuǎn)PepT1細(xì)胞模型的構(gòu)建效率穩(wěn)定性，也為今后以hPepT1為靶點(diǎn)的新藥合成研究中藥物的篩選和吸收機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 pcDNA3.1(+)-hPepT1質(zhì)粒由京博邁德基因技術(shù)有限公司構(gòu)建；AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit(批號(hào)0811北4KA1)購(gòu)于AxyGen公司；TRIzol試劑(批號(hào)15596026)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào)1657828)購(gòu)自Invitrogen公司； EastepTM總RNA提取試劑盒(批號(hào)7020001018)購(gòu)于上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞、RIPA裂解液(批號(hào)20151020)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)20150413)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號(hào)20160118)、ECL超敏發(fā)光液(批號(hào)20151020)均購(gòu)于Solarbio公司；PrimeScript RT試劑盒(批號(hào)AK5402)購(gòu)于TaKaRa公司；一抗rabbit IgG(批號(hào)L7342)購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司；二抗goat anti rabbit IgG(H+L)(批號(hào)GR231489-3)購(gòu)于Abcam公司；β-actin引物上游5′-CCCCTGAATCCCAAAGCC-3′，引物下游5′-GATGTCACGCACGATCTCCC-3′；hPepT1引物上游5′-GCTCTTATCGCCGACTCGTG-3′，引物下游5′-GGGTTTGATTCCTCCAGTCC-3′由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成；DMEM高糖培養(yǎng)基(批號(hào)8114031)、胎牛血清(FBS，批號(hào)1227694)、胰蛋白酶(批號(hào)J130049)、G418(批號(hào)G8160)均購(gòu)于Gibco公司；LB肉湯購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；肌肽、甘氨酰肌氨酸購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；異煙肼購(gòu)于中國(guó)生物制品檢定所。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Heraeus Fresco17冷凍高速離心機(jī)、Biomate3S蛋白核酸分析儀購(gòu)于Thermo Scientific公司；Modle680酶標(biāo)儀、PowerPac Basic電泳儀、Trans-Blot Turbo蛋白快速轉(zhuǎn)印儀、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、ChemiDoc XRS+凝膠成像儀均購(gòu)于Bio Rad公司；Acugity-TDQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜購(gòu)于Waters公司。

1.2 pcDNA3.1(+)-hPepT1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化擴(kuò)增、提取純化 質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hPepT1作為表達(dá)載體，用TOP10感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增質(zhì)粒。在無(wú)菌環(huán)境下，取100 μL TOP10感受態(tài)細(xì)胞置于1.5 mL無(wú)菌離心管中，向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入5 μL pcDNA3.1(+)-hPepT1質(zhì)粒，輕輕混勻后冰浴放置30 min，將離心管置于42 ℃水浴中60～90 s，然后快速轉(zhuǎn)移到冰浴中放置2～3 min。向離心管中加入500 μL無(wú)菌無(wú)抗的LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)1 h，使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。然后取100 μL已轉(zhuǎn)化的TOP10感受態(tài)細(xì)胞涂布于含Ampicillin抗生素(100 mg·L-1)LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h后，挑取單克隆菌體接種于含Ampicillin抗生素(100 mg·L-1)的無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1震蕩培養(yǎng)12 h。參照AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取純化pcDNA3.1(+)-hPepT1質(zhì)粒。

1.3 MDCK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞培養(yǎng) MDCK細(xì)胞(購(gòu)于ATCC細(xì)胞庫(kù))與HeLa細(xì)胞(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))所用培養(yǎng)液均為含10%胎牛血清，不含抗生素的高糖DMEM，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)至80%～90%融合度時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.4 G418最佳篩選濃度的確定及MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分別將MDCK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞以2×105個(gè)每孔種于24孔板，生長(zhǎng)24 h后，加入G418濃度分別為400、500、600、700、800、 900 mg·L-1的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，以14 d細(xì)胞全部死亡的濃度為最佳篩選濃度,最終確定最佳篩選濃度為800 mg·L-1。

分別將MDCK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞以3×105個(gè)每孔種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%左右融合度時(shí)，將LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑與pcDNA3.1(+)-hPepT1質(zhì)粒按2 ∶1的體積質(zhì)量比轉(zhuǎn)染進(jìn)MDCK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后加入含800 mg·L-1G418的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，以800 mg·L-1的濃度培養(yǎng)14 d。

1.5 挑選單克隆細(xì)胞 將G418篩選14 d的轉(zhuǎn)染的MDCK細(xì)胞與HeLa細(xì)胞，用胰酶消化后離心，培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)。采用有限稀釋法，利用96孔板挑選出單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中hPepT1 mRNA的表達(dá) 使用TRIzol與EastepTM總RNA提取試劑盒分別提取MDCK-hPepT1單克隆細(xì)胞(DH-m細(xì)胞)與HeLa-hPepT1(DH-h細(xì)胞)單克隆細(xì)胞中總RNA，測(cè)定RNA濃度后，分別取適量RNA與逆轉(zhuǎn)錄試劑在37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將獲得的cDNA及合成的引物進(jìn)行qRT-PCR，PCR反應(yīng)體系如下：

SYBR Premix Ex TaqⅡ 10.0 μL

hPepT1上游引物 0.8 μL

hPepT1下游引物 0.8 μL

cDNA模板 2.0 μL

ddH2O 6.4 μL

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的反應(yīng)(94 ℃ 30 s ，56 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s)，以β-actin作為內(nèi)參。

1.7 Western blot檢測(cè)分析hPepT1的表達(dá) 分別對(duì)DH-m細(xì)胞與DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析。收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，以適量RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)吹打混勻，在冰上放置30 min(每隔10 min渦旋1次)，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清(總蛋白)，-80 ℃保存。SDS-PAGE 凝膠電泳用10%分離膠，5%濃縮膠，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔總蛋白上樣量為50 μg，90 V電泳15 min，120 V電泳60 min。PVDF膜在1 A條件下轉(zhuǎn)膜20 min，TBST洗滌3次(每次5～10 min)，5% BSA室溫封閉1～2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜(一抗是兔抗人的hPepT1多克隆抗體IgG 1 ∶500 稀釋)，TBST洗滌3次(每次5～10 min)，二抗[山羊抗兔IgG(H+L)]1 ∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次(每次5～10 min)，最后用ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑A液、B 液按1 ∶1混勻，取適量滴加在PVDF膜上后，利用ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描曝光。

1.8 BCA法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度 參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定細(xì)胞裂解中蛋白濃度。測(cè)定步驟如下：根據(jù)所要測(cè)定的樣品數(shù)量，取適量的BCA試劑與Cu試劑按50 ∶1的體積比配制成BCA工作液，混勻后室溫放置。工作曲線制備：取適量BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，用PBS稀釋液稀釋至濃度為0.5 g·L-1。分別取0、1、2、4、8、12、16、20 μL標(biāo)準(zhǔn)液至96孔板，加PBS稀釋液補(bǔ)足至20 μL。待測(cè)樣品的制備：將提取的總蛋白用PBS稀釋液稀釋至初始濃度的0.1，取稀釋后的待測(cè)樣品20 μL至96孔板中。待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)蛋白液各加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20 min后，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值A(chǔ)570，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品蛋白濃度。曲線方程為Y=0.056 3X+0.075 35(R2=0.997 1)。計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)量濃度時(shí)，取吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的稀釋樣品，曲線方程法計(jì)算樣品質(zhì)量濃度。

1.9 Glysar的攝取研究

1.9.1 Glysar在DH-m、DH-h細(xì)胞及野生型細(xì)胞中的攝取研究 分別將DH-m、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞以密度2×105個(gè)每孔種于6孔板，生長(zhǎng)48 h后，進(jìn)行攝取實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞用37 ℃ HBSS (pH 7.4)洗3遍，37 ℃預(yù)孵育15 min后除去孵育液，對(duì)照組(野生型細(xì)胞)和模型組(轉(zhuǎn)染細(xì)胞)分別加入含0.2 mmol·L-1Glysar的HBSS(pH 6.0)2 mL。37 ℃孵育30 min后，用冰冷的HBSS洗3遍終止攝取，用RIPA裂解后，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取100 μL上清液，加入適量的異煙肼溶液(內(nèi)標(biāo))和100 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液用HPLC-MS對(duì)Glysar進(jìn)行含量測(cè)定。利用內(nèi)標(biāo)法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=2.308 8X+0.031 9 (R2=0.999 4)。用BCA法測(cè)定每孔細(xì)胞總蛋白濃度，攝取結(jié)果用蛋白總量進(jìn)行校正。

1.9.2 不同濃度Glysar在DH-m、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中的攝取研究 分別將DH-m、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞以密度2×105個(gè)每孔種于6孔板，生長(zhǎng)48 h后，進(jìn)行攝取實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞用37 ℃ HBSS(pH 7.4)洗3遍，37 ℃預(yù)孵育15 min后除去孵育液，將Glysar用HBSS(pH 6.0)配制成濃度為0.2、1.0、5.0 mmol·L-1的溶液，將不同濃度的Glysar分別加入上述細(xì)胞，37 ℃孵育30 min后，用冰冷的HBSS洗3遍終止攝取，按“1.9.1”項(xiàng)下的“樣品處理”依法操作后，用UPLC-MS/MS對(duì)Glysar進(jìn)行含量測(cè)定。

1.9.3 Glysar在DH-m、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中不同時(shí)間的攝取研究 分別將DH-m、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞以密度2×105個(gè)每孔種于6孔板，生長(zhǎng)48 h后，進(jìn)行攝取實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞用37 ℃ HBSS (pH 7.4)洗3遍，37 ℃預(yù)孵育15 min后除去孵育液，在上述細(xì)胞中分別加入含0.2 mmol·L-1Glysar的HBSS (pH 6.0)2 mL，37 ℃分別孵育5、10、15、20、30 min后，用冰冷的HBSS洗3遍終止攝取，按“1.9.1”項(xiàng)下的“樣品處理”依法操作后，用UPLC-MS/MS對(duì)Glysar進(jìn)行含量測(cè)定。

1.10 Glysar的HPLC-MS檢測(cè)條件 色譜柱：Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，17 μm)柱，保護(hù)柱：Waters Van Guard C18(2.1 mm×50 mm，17 μm)；流動(dòng)相：A: 0.1%甲酸乙腈(V/V)，B: 0.1%甲酸水(V/V)，全梯度洗脫；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；質(zhì)譜采用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIR)掃描模式，以電噴霧離子源(ESI)在正離子電離模式下進(jìn)行測(cè)定。離子源溫度120 ℃；錐孔電壓分別為16 V、30 V；碰撞電壓分別為10 V、15 V；監(jiān)測(cè)離子對(duì)147.1(Glysar)，137.8(內(nèi)標(biāo)異煙肼)。

2 結(jié)果

2.1 hPepT1 mRNA在不同細(xì)胞中的表達(dá) 分別提取DH-m、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中總RNA，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)hPepT1 mRNA的表達(dá)。Tab 1顯示，DH-m與DH-h細(xì)胞中hPepT1 mRNA的表達(dá)量均明顯高于其野生型細(xì)胞。對(duì)于不同的兩種受體細(xì)胞之間，從表中可以看出，雖然MDCK細(xì)胞中hPepT1 mRNA的表達(dá)量低于HeLa細(xì)胞，但是DH-m 細(xì)胞中hPepT1 mRNA的表達(dá)量明顯高于DH-h細(xì)胞。

2.2 hPepT1在不同細(xì)胞中的表達(dá) 分別提取DH-m、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞的總蛋白，通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)上述細(xì)胞中hPepT1的表達(dá)情況(Fig 1)。結(jié)果顯示，野生型HeLa細(xì)胞中同樣產(chǎn)生了1條相對(duì)于DH-h細(xì)胞較弱但也很明顯的目的蛋白條帶，而在MDCK細(xì)胞中只有幾乎看不見(jiàn)的1條極微弱的條帶。與其野生型細(xì)胞比較，DH-h與DH-m細(xì)胞均有明顯的目的蛋白條帶。說(shuō)明兩種受體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，hPepT1的表達(dá)均明顯升高。

CellhPepT1mRNAMDCK(0．02±0．0016)×10-3DH?m1．44±0．12?HeLa(1．97±0．53)×10-2DH?h1．05±0．05#

*P<0.05vsMDCK cells；#P<0.05vsHeLa cells

Fig 1 Expression of hPepT in DH-m, DH-h cells and their wild type cells

2.3 Glysar的攝取研究

2.3.1 Glysar在不同細(xì)胞中的攝取 對(duì)Glysar在DH-m、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中的攝取情況進(jìn)行考察。以進(jìn)入細(xì)胞的Glysar濃度與每孔細(xì)胞的總蛋白濃度比值表示Glysar的攝取量。結(jié)果顯示(Fig 2)，與其野生型細(xì)胞相比較，Glysar在DH-m與DH-h細(xì)胞中的攝取量明顯增加。Glysar在DH-h細(xì)胞中的攝取量低于DH-m細(xì)胞，而在HeLa細(xì)胞中的攝取量卻高于MDCK細(xì)胞，這可能與受體細(xì)胞中存在的內(nèi)源性目的蛋白有關(guān)。

2.3.2 不同濃度Glysar在不同細(xì)胞中的攝取 不同濃度的Glysar在DH-m、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞中的攝取結(jié)果顯示(Tab 2)，在野生型細(xì)胞中，HeLa細(xì)胞對(duì)Glysar的攝取高于MDCK細(xì)胞，且一定程度上也呈濃度依賴(lài)性增加，而MDCK細(xì)胞對(duì)Glysar的攝取變化卻很小。DH-m與DH-h細(xì)胞對(duì)Glysar的攝取均呈濃度依賴(lài)性增加，但DH-m細(xì)胞對(duì)Glysar的攝取高于DH-h細(xì)胞。

2.3.3 Glysar在不同細(xì)胞中不同時(shí)間的攝取 對(duì)DH-m細(xì)胞、DH-h細(xì)胞及其野生型細(xì)胞在不同時(shí)間對(duì)Glysar的攝取進(jìn)行考察，結(jié)果顯示(Fig 3)，在野生型細(xì)胞中，MDCK細(xì)胞在不同時(shí)間對(duì)Glysar的攝取幾乎沒(méi)有什么變化，而HeLa細(xì)胞對(duì)Glysar的攝取不僅高于MDCK細(xì)胞，而且對(duì)Glysar的攝取在一定攝取時(shí)間內(nèi)有明顯增加趨勢(shì)。而隨著時(shí)間的增加，DH-m與DH-h細(xì)胞對(duì)Glysar的攝取量均逐漸增加，但DH-m細(xì)胞對(duì)Glysar的攝取高于DH-h細(xì)胞。

Tab 2 Uptake of various concentrations of Glysar in DH-m cells,DH-h cells and their wild type±s,n=3)

*P<0.05vsMDCK cells；#P<0.05vsHeLa cells

Fig 2 Uptake of Glysar in DH-m cells,DH-h cells

*P<0.05vsMDCK cells;#P<0.05vsHeLa cells

Fig 3 Uptake of Glysar in MDCK cells, DH-m cells,HeLa

3 討論

人腸道寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體hPepT1作為一種研究比較深入的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，被廣泛用于hPepT1底物的篩選和吸收機(jī)制的研究。通過(guò)將帶有編碼目的蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使目的蛋白在細(xì)胞中高表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建成為研究者的選擇[7]。在前期研究中，作者參考已報(bào)道的文獻(xiàn)[8-9]，采用了瘦素誘導(dǎo)hPepT1在Caco-2 細(xì)胞中高表達(dá)的方法來(lái)構(gòu)建相關(guān)細(xì)胞模型，但結(jié)果并不理想。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瘦素誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞不能有效表達(dá)hPepT1。且研究表明，Caco-2 細(xì)胞中存在的多種轉(zhuǎn)運(yùn)通路對(duì)特定載體蛋白的研究也存在影響[10-11]。因此，構(gòu)建hPepT1高表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，或許能夠?yàn)閔PepT1底物的篩選和評(píng)價(jià)研究提供一個(gè)更好、更有效的體外細(xì)胞模型。在hPepT1高表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的構(gòu)建中，已有多種細(xì)胞作為hPepT1轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞被選擇。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)其中被應(yīng)用最多的MDCK與HeLa兩種細(xì)胞，旨在篩選出轉(zhuǎn)染效率更高，內(nèi)在因素影響更小的細(xì)胞作為hPepT1轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞，從而提高構(gòu)建的hPepT1高表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的有效性。

研究表明[12]，雖然mRNA和蛋白水平是一個(gè)相偶聯(lián)的過(guò)程，但是兩者沒(méi)有必然的一致的趨勢(shì)，因此，mRNA水平升高并不意味著蛋白表達(dá)量就一定會(huì)提高。而構(gòu)建hPepT1轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的目的是從蛋白水平對(duì)藥物進(jìn)行評(píng)價(jià)研究，所以不僅在基因水平要有變化，還要在蛋白水平有變化才有意義。所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR與Western blot析技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，分別從基因水平和蛋白水平對(duì)轉(zhuǎn)染后的兩種受體細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)比較分析，同時(shí)通過(guò)攝取實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞中目的蛋白的活性功能進(jìn)行驗(yàn)證比較分析。結(jié)果表明，在相同處理?xiàng)l件下，MDCK作為受體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后，其mRNA、蛋白表達(dá)水平以及蛋白活性功能均優(yōu)于轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞。而從野生型細(xì)胞中蛋白表達(dá)和對(duì)Glysar的攝取結(jié)果來(lái)看，HeLa細(xì)胞有明顯的目的蛋白條帶，其對(duì)Glysar的攝取不僅高于MDCK細(xì)胞，而且在一定程度上呈增加趨勢(shì)，這可能與HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性高表達(dá)hPepT1有關(guān)。研究表明[13]，轉(zhuǎn)染過(guò)程將對(duì)內(nèi)源性目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響，使得在利用野生型細(xì)胞對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行校正分析的過(guò)程中產(chǎn)生較大的偏差。因此，選擇內(nèi)源性目的蛋白表達(dá)少或是不表達(dá)的細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞，更有利于轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的構(gòu)建和應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與HeLa細(xì)胞相比較，MDCK細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高，內(nèi)源性目的蛋白表達(dá)少甚至不表達(dá)，其作為hPepT1轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞將是更好的選擇。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然MDCK細(xì)胞作為hPepT1轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞優(yōu)于HeLa細(xì)胞，但其不僅需要消化的時(shí)間比較長(zhǎng)，而且不容易吹散成單個(gè)細(xì)胞，即使獲得單個(gè)細(xì)胞，由于吹打時(shí)間長(zhǎng)，吹打力度較大，細(xì)胞受損，獲得的單個(gè)細(xì)胞很難貼壁生長(zhǎng)增殖，這給單克隆細(xì)胞的挑選工作帶來(lái)了極大的困難。因此，本實(shí)驗(yàn)在多次實(shí)驗(yàn)中摸索出了同1 d間隔8 h連續(xù)2 次胰酶消化法，不僅改善了MDCK細(xì)胞在胰酶消化時(shí)不易分散的問(wèn)題，而且在消化過(guò)程中減少了細(xì)胞的吹打時(shí)間，降低了吹打力度，在獲得單個(gè)細(xì)胞的同時(shí)也保證了細(xì)胞的完整性，從而提高了挑選單克隆細(xì)胞的效率。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)篩選出了對(duì)hPepT1轉(zhuǎn)染來(lái)說(shuō)更為適宜的受體細(xì)胞，在為今后建立hPepT1高表達(dá)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系提供基礎(chǔ)保障的同時(shí)，也為今后建立其他轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的受體細(xì)胞的選擇提供參考。

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Comparison of hPepT1 transfected MDCK cells to hPepT1 transfected HeLa cells

LUO Min1,3,4,FU Xiao-zhong1,3,XIAO Tao1,3,ZHANG Wen-zheng1,3,LI Jing1,3,CHEN Ya1,3,4,LIU Ting1,2

[1.SchoolofPharmacy, 2.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics, 3.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM(MinistryofEducation),GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China; 4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao’sMedicines,Guiyang550004，China]

Aim To screen a more suitable transfection receptor, and improve the efficiency of constructing cell lines highly expressing human peptide transporters 1 (hPepT1). Methods The recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-hPepT1 was transfected into MDCK cells and HeLa cells by LipofectamineTM2000 transfection reagent，respectively. The monoclonal cells were selected and cultured. Expression of hPepT1 mRNA and protein were determined by qRT-PCR and Western blot, respectively. The uptake capacity of Glysar in transfected cells was examined. Results Compared with wild type cells, the expression of hPepT1 and the uptake of Glysar in transfected MDCK cells and HeLa cells significantly increased (P<0.05). Although the uptake of Glysar in HeLa cells was higher than that of MDCK cells, on the contrary, the expression of hPepT1 and the uptake of Glysar in MDCK-hPepT1 cells was higher than that of HeLa-hPepT1 cells. Conclusion MDCK cells may serve as a more suitable transfected receptor for the construction of a cellular model with high expression of hPepT1, which would make the construction of a cell model highly expressing hPepT1 more efficient.

MDCK cells; HeLa cells; human peptide transporter 1; stable transfection; real time fluorescent quantitative RT-PCR; Western blot; Glysar uptake

時(shí)間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.050.html

2016-10-22,

2016-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81260473，81460523 );貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專(zhuān)項(xiàng)基金(2013-45號(hào)) ；貴州省社會(huì)發(fā)展攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2013-3031號(hào))；貴州省科學(xué)技術(shù)基金計(jì)劃(黔科合基礎(chǔ)[2016]1127)；貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)靶向藥物研究與開(kāi)發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(黔教合人才團(tuán)隊(duì)字[2015]57)

羅 敏(1991-)，女，碩士生，研究方向：藥物化學(xué)及藥理學(xué)，E-mail: 1532833403@qq.com； 傅曉鐘(1972-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物化學(xué)，通訊作者，Tel:0851-6908568，E-mail:xiaozhong_fu@sina.com； 劉 亭(1981-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: 1586740@qq.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.025

A

1001-1978(2017)02-0280-05

R322.61；R329.24；R341；R394.2；R737.33；R977.6