王 鳳，溫桃群，徐 鋒，桑文濤，陳 仁，曾 南

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

薄荷酮對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠的保護(hù)作用研究

王 鳳，溫桃群，徐 鋒，桑文濤，陳 仁，曾 南

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

目的 觀察薄荷酮對內(nèi)毒素(LPS)致炎癥模型小鼠的保護(hù)作用，并初步探討與NLRP3炎癥小體激活相關(guān)的調(diào)控作用機(jī)制。方法 ♂ C57BL/6J小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、地塞米松組(5 mg·kg-1)、薄荷酮0.25 g·kg-1及0.5 g·kg-1劑量組。除地塞米松組實驗當(dāng)日腹腔注射給藥1次外，其余各組小鼠連續(xù)灌胃給藥5 d，每天1次。各組小鼠末次給藥30 min后，除空白組小鼠外，其余各組小鼠腹腔注射LPS(15 mg·kg-1,10 mL·kg-1)制備炎癥反應(yīng)模型，造模12 h后，小鼠取血分離血清，采用ELISA及液相蛋白芯片技術(shù)測定炎癥因子IL-18、IL-1β、IL-5、TNF-α、IFN-γ、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)及巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)的水平；取小鼠全血進(jìn)行白細(xì)胞(WBC)計數(shù)；剖取肺組織計算肺臟指數(shù)，并測定肺組織中NO含量，進(jìn)行肺組織病理組織學(xué)檢查；RT-PCR法檢測肺組織中NLRP3、caspase-1及IFN-α mRNA表達(dá)；免疫組化法觀察肺組織中cathepsin B、P2X7R蛋白表達(dá)。結(jié)果 0.5 g·kg-1薄荷酮明

薄荷酮；內(nèi)毒素；炎癥因子；NLRP3炎癥小體；cathepsin-B；P2X7R

薄荷酮屬于單萜類化合物，存在于薄荷、荊芥、黃芩和藿香等多種植物的揮發(fā)油中，現(xiàn)代研究表明薄荷酮具有抗病毒、抗炎、利膽、促滲等作用[1-2]，其縮氨基硫脲和縮氨基脲衍生物還具有抗HIV-1(ⅢB)和 HIV-2 (ROD)的作用[3]。關(guān)于薄荷酮的抗炎作用，已有報道認(rèn)為與其抑制炎癥因子的釋放有關(guān)，但多從體外實驗進(jìn)行探討[4-5]，而體內(nèi)研究報道較少。本研究采用內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型，探討薄荷酮預(yù)防性給藥是否對內(nèi)毒素所致炎癥模型小鼠具有保護(hù)作用，并從NLRP3炎癥小體激活角度初步探討其作用機(jī)制，以期進(jìn)一步明確該化合物的抗炎作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6J小鼠，♂，體質(zhì)量18 g～22 g，北京維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。動物合格證號11400700130007。

1.2 藥物與試劑 薄荷酮(百靈威科技有限公司，556084-25mL，批號：A0303645)，純度85%，實驗時用體積分?jǐn)?shù)為0.35%的吐溫-80溶液配制使用。給藥劑量分別為其LD50的1/20和1/10，即0.25 g·kg-1、0.5 g·kg-1。地塞米松(Sigma，D-4902-25mg，批號：WXBB713V)；LPS(Sigma，Escherichia coil 055:B5，批號：044M4004V)；Mouse IL-18 ELISA kit(E-bioscience，批號：118018007)；MILLIPLEX?MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel-Immunology Multiplex Assay(Millipore，批號：2683668)；Cathepsin B兔多克隆抗體(Abcam，批號：ab58802)；P2X7R兔多克隆抗體(Abcam，批號：ab09054)；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋，批號：13152A11)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋，批號：K135925C)；AxyPrep 總 RNA 小量制備試劑盒(吳江康寧生命科學(xué)有限公司，批號 12113KD1)；Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司，批號 L1116)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(北京天根生化科技有限公司，批號 P4224)。NLRP3、caspase-1、IFN-α引物序列均由Invitrogen設(shè)計。NO試劑盒(碧云天生物技術(shù)，批號：S0021)。

1.3 儀器 LuminexMagpix液相懸浮芯片儀(Millipore)；3001 酶聯(lián)免疫分析儀(Thermo Fisher Scientific，F(xiàn)inland)；Sorvall ST 16R離心機(jī)(Thermo Fisher)；ZHWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智成分析儀器制造有限公司)；MEK-6318K全自動血液分析儀(日本Nihon Kohden)；BS323S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；2015型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國徠卡儀器有限公司)；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司)；BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司)；CFX96TM Real-Time PCR Dectection System(美國 Bio-Rad 公司)。

2 方法

2.1 內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠的建立與給藥 取健康C57BL/6J ♂小鼠，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白組、模型組、地塞米松(5 mg·kg-1)組、薄荷酮0.25 g·kg-1與0.5 g·kg-1組。除地塞米松組外，其余給藥組小鼠按0.02 mL·g-1體積灌胃給藥，空白組與模型組給予等體積0.35%吐溫-80溶液，連續(xù)給藥4 d。動物禁食不禁水12 h，d 5(地塞米松組ip給藥，劑量為5 mg·kg-1)給藥后30 min，小鼠腹腔注射LPS(15 mg·kg-1,0.01 mL·g-1)造模。造模后12 h，小鼠取血分離血清，采用液相芯片法測定小鼠血清中IL-1β、IL-5、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、MIP-1β的含量，采用ELISA法測定小鼠血清IL-18的含量。另取小鼠全血 20 μL至裝有2 mL稀釋液的EP管中，混勻，進(jìn)行白細(xì)胞計數(shù)。剖取小鼠肺臟，稱重，計算肺指數(shù)。將右肺保存于-80℃?zhèn)溆?，取各組小鼠左肺置于體積分?jǐn)?shù)為10%的中性福爾馬林中，用于觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.2 薄荷酮對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 將固定于體積分?jǐn)?shù)為10%中性福爾馬林中的各組小鼠肺組織進(jìn)行取材制片，每葉肺取材2～3 mm，乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，置于顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理損傷。并對小鼠肺400倍鏡圖片上的嗜中性粒細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，方法：每葉肺400倍鏡下取上、中、下3張圖片，肺葉尖為上，支氣管進(jìn)入處最下端為下，兩端之間為中部，取圖片時盡可能讓整個圖片都布滿肺組織。每只動物取6張圖片，計數(shù)每張圖片上的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量，計算其算數(shù)平均值作為該例標(biāo)本嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)目。

2.3 實時熒光定量 PCR檢測模型小鼠肺組織中NLRP3、caspase-1、IFN-α mRNA表達(dá) RNA提取實驗中所需所有實驗材料按照相關(guān)要求浸泡、滅菌，烘干備用。取各組小鼠凍存肺組織樣本，按照AxyPrep總RNA小量制備試劑盒說明書提取總RNA， 并檢測RNA的純度及含量，按照Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后運(yùn)用RT-PCR法檢測NLRP3、caspase-1、IFN-α mRNA表達(dá)。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Gene sequences of primers

2.4 免疫組化分析模型小鼠肺組織中cathepsin B、P2X7R表達(dá) 各組小鼠肺組織經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后，切片(厚4～5 μm)，切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次，熱修復(fù)抗原，滴加山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，滴加稀釋的一抗cathepsin B抗體(1 ∶200)或P2X7R抗體(1 ∶200)，4℃過夜，PBS洗3次后，滴加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育 30 min，PBS洗3次后，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白試劑 ，37℃孵育 30 min，PBS洗4次后DAB顯色，蒸餾水洗滌后蘇木精輕度復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺黃色或棕黃色的顆粒物質(zhì)為陽性表達(dá)，藍(lán)色為陰性表達(dá)。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的平均光密度(平均光密度=黃色或棕黃色部分的累積光密度值/照片面積)。

2.5 模型小鼠肺組織中NO含量檢測 按試劑盒說明書制備肺組織勻漿，采用Griess法進(jìn)行NO含量測定。

3 結(jié)果

3.1 薄荷酮對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠全血白細(xì)胞計數(shù)及肺指數(shù)的影響 如Fig 1所示，與空白對照組比較，模型組小鼠全血白細(xì)胞計數(shù)明顯升高(P<0.05)，肺指數(shù)明顯增加(P<0.01)，提示內(nèi)毒素能誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，肺指數(shù)的增加提示肺組織有炎性滲出表現(xiàn)。與模型組比較，0.5 g·kg-1薄荷酮對全血白細(xì)胞計數(shù)及肺指數(shù)的增高表現(xiàn)出降低趨勢(P>0.05)。

3.2 薄荷酮對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠血清炎性因子水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-18、IL-5、TNF-α、MIP-1β、IFN-γ、G-CSF和GM-CSF水平均明顯增加(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，0.5、0.25 g·kg-1薄荷酮均能明顯降低模型小鼠血清IL-1β、IL-5、TNF-α及MIP-1β的含量(P<0.05)；0.5 g·kg-1薄荷酮亦明顯降低模型小鼠血清IL-18、IFN-γ、G-CSF和GM-CSF水平(P<0.05或P<0.01)。見Fig 2。

3.3 薄荷酮對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，造模組的小鼠肺組織的肺泡膈內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤表現(xiàn)，主要以嗜中性粒細(xì)胞為主，小血管內(nèi)亦充滿嗜中性粒細(xì)胞，使肺泡膈出現(xiàn)不同程度的增厚。由于肺泡膈增厚的主要原因為炎細(xì)胞浸潤造成，因此本實驗對各組小鼠肺組織的病變程度采用肺泡膈與小血管內(nèi)的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行評價，結(jié)果見Fig 3。與空白對照組比較，模型對照組小鼠肺組織的肺泡膈增厚，肺泡隔內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞浸潤明顯，肺組織小血管內(nèi)充滿嗜中性粒細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞計數(shù)明顯高于空白對照組(P<0.01)，提示LPS可誘導(dǎo)肺組織的炎性表現(xiàn)，亦表明本次實驗?zāi)Ｐ统闪?。與模型對照組比較，0.5 、0.25 g·kg-1薄荷酮預(yù)防給藥能明顯減少小鼠肺組織中的嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，減輕肺泡膈增厚，表明薄荷酮能對抗LPS所致的炎癥反應(yīng)。

3.4 薄荷酮對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠肺組織NLRP3、caspase-1、IFN-α mRNA表達(dá)的影響 如Fig 4所示，與空白對照組比較，模型組小鼠肺組織中NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，0.5 g·kg-1薄荷酮明顯下調(diào)模型小鼠肺組織NLRP3、IFN-α mRNA的表達(dá)(P<0.05)，對caspase-1 mRNA表達(dá)亦有較明顯的下調(diào)趨勢。

Fig 1 Effect of menthone on WBC(A) and lung index(B) in inflammation mice induced by±s,n=11)

A～H：The levels of IL-1β, IL-18, IL-5, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF and MIP-1β in serum of inflammation mice induced by endotoxin.*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 3 Level of neutrophilic granulocyte and pathological picture of lung tissue in inflammation mice induced by endotoxin±s,n=6)

A: Effect of menthone on level of neutrophilic granulocyte in lung tissue of inflammation mice induced by endotoxin.**P<0.01vsmodel; B: Pathological picture of the lung tissue in inflammation mice induced by endotoxin, exemplary show is neutrophilic infiltrate and thickening of alveolar septum (HE×400).

3.5 薄荷酮對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠肺組織cathepsinB、P2X7R表達(dá)的影響 對小鼠肺組織進(jìn)行SP免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組小鼠肺組織中cathepsinB、P2X7R蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，0.5 g·kg-1薄荷酮能明顯下調(diào)模型小鼠肺組織cathepsin B、P2X7R的蛋白陽性表達(dá)水平(P<0.01或P<0.05)，0.25 g·kg-1薄荷酮對P2X7R蛋白陽性表達(dá)水平亦有明顯抑制表現(xiàn)(P<0.01)。見Fig 5。

3.6 薄荷酮對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠肺組織NO含量的影響 由Fig 6可知，與空白組相比，模型組小鼠肺組織中NO含量明顯升高(P<0.01)，與模型組比較，0.25、0.5 g·kg-1薄荷酮均能明顯降低肺組織中NO的含量(P<0.05)。

4 討論

內(nèi)毒素(endotoxin)具有廣泛的生物學(xué)活性，是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要組成成分，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，為誘發(fā)炎癥反應(yīng)過程的主要病理成分。內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體后，能直接作用于細(xì)胞生物膜，并通過單核-巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用使機(jī)體防御系統(tǒng)過度釋放多種炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子、干擾素、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-5等，上述細(xì)胞因子過量則會引起機(jī)體發(fā)熱、血管通透性增加、中性粒細(xì)胞增多等炎癥病理生理反應(yīng)[6-7]，過量的內(nèi)毒素刺激還會引起內(nèi)毒素血癥，甚至內(nèi)毒素休克。大量研究表明，實驗動物腹腔或靜脈注射LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素中毒模型，具有全身炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，該模型具有易操作、重現(xiàn)性好的特點，常被用來觀察藥物的抗炎作用與機(jī)制研究。本研究中，小鼠腹腔注射LPS(15mg·kg-1)之后，逐漸出現(xiàn)呼吸急促、活動減少表現(xiàn)，雙眼出現(xiàn)一些白色分泌物，全血白細(xì)胞計數(shù)增高，血清中眾多炎性因子如IL-1β 、IL-18、 TNF-α、IL-5、IFN-γ等水平異常升高，且模型動物的肺臟組織呈現(xiàn)明顯的炎性病理表現(xiàn)，嗜中性粒細(xì)胞浸潤增加，上述表現(xiàn)與文獻(xiàn)報道相符[8-9]，亦表明本研究中的炎癥動物模型制備成功。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，薄荷酮預(yù)處理小鼠的全血白細(xì)胞計數(shù)及肺指數(shù)均呈現(xiàn)降低趨勢，0.5 g·kg-1薄荷酮明顯減少肺組織切片中嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量，減輕肺泡膈的增厚，提示薄荷酮對內(nèi)毒素所致的炎癥模型小鼠有保護(hù)作用。

Fig 4 Effect of menthone on expression of NLRP3(A), caspase-1(B), IFN-α(C) mRNA in lung tissue of inflammation mice induced by±s,n=4)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 5 Effect of menthone on protein expression of cathepsin B and P2X7R in lung tissue of inflammation mice induced by endotoxin±s,n=4)

A and B: Optical density of cathepsin B and P2X7R in lung tissue of inflammation mice induced by endotoxin ; C and D: Protein expression of cathepsin B and P2X7R in lung tissue of inflammation mice induced by endotoxin , exemplary show is cathepsin B or P2X7R SP staining(IHC×400).*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

Fig 6 Effect of menthone on level of NO in lung tissue of inflammation mice induced by±s,n=6)*P<0.05,**P<0.01vsmodel

IL-1β、IL-18、IL-5、TNF-α和IFN-γ是目前研究較多的促炎因子，參與各種炎癥反應(yīng)，亦是較重要的炎癥因子。其中，IL-1β 的生物學(xué)效應(yīng)廣泛，可在局部或全身發(fā)揮作用，引起發(fā)熱、炎癥反應(yīng)等。而且，IL-1β 和 IL-18 能夠提高其他致炎因子如IL-6 、TNF-α 的表達(dá)，上調(diào)黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)炎性細(xì)胞的滲出[10-11]。促炎因子TNF-α主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，不僅對腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，而且能刺激T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，產(chǎn)生致炎、加劇炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用。炎癥反應(yīng)過程中，嗜酸性粒細(xì)胞能通過釋放其顆粒中的內(nèi)容物，引起組織損傷，加劇炎癥反應(yīng)，而炎癥因子IL-5的主要功能則是刺激嗜酸性粒細(xì)胞增殖、分化及活化，因此表現(xiàn)出促炎效應(yīng)。促炎因子 IFN-γ主要由 Th1 細(xì)胞分泌，具有較強(qiáng)的激活吞噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型小鼠血清中IL-1β 、IL-18、 TNF-α、IL-5和IFN-γ的含量均明顯升高，提示動物呈現(xiàn)一定的全身炎性反應(yīng)，但經(jīng)薄荷酮預(yù)處理過的小鼠則對上述促炎因子的異常升高有較好的對抗作用，提示薄荷酮的抗內(nèi)毒素作用與抑制促炎因子的過度釋放有關(guān)。

本研究中，除觀察薄荷酮對常見促炎因子的影響外，還探討了其對模型動物血清粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)及巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β (macrophage inflammatory protein- 1β，MIP-1β) 水平的影響。G-CSF是一種多肽類細(xì)胞因子，細(xì)菌感染時所釋放的內(nèi)毒素作用于巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其分泌 IL-1 ，進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞，使其分泌 IL-3、4、5 等細(xì)胞因子，上述因子則進(jìn)一步作用于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，致使其分泌 G-CSF[12]參與炎癥反應(yīng)。GM-CSF則是體內(nèi)重要的炎癥細(xì)胞趨化因子和活化因子，可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的致炎作用。MIP-1β亦是體內(nèi)重要的趨化因子，主要作用是作為化學(xué)引誘物引領(lǐng)細(xì)胞遷移，從而誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞向炎癥部位浸潤[13]。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS所誘導(dǎo)的炎癥模型小鼠血清中G-CSF、GM-CSF與MIP-1β的含量明顯升高，進(jìn)一步反映出該模型小鼠的炎性反應(yīng)狀態(tài)，而采用薄荷酮預(yù)處理過的小鼠在造模后，其血清中上述趨化因子含量的增高明顯受到抑制，進(jìn)一步證實了薄荷酮的抗炎作用與其抑制體內(nèi)促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生的活性物質(zhì)的釋放有關(guān)。

固有免疫為機(jī)體的第一道防御系統(tǒng)，能引導(dǎo)機(jī)體對外來病原體產(chǎn)生免疫性應(yīng)答，通過模式識別受體(PRR)來識別病原體的保守結(jié)構(gòu)即病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，常見的PAMP包括鞭毛蛋白、LPS及一些微生物的核酸分子，這些PAMP能被PRR識別，進(jìn)而激活下游信號通路，引起機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)3類PRR：Toll樣受體(TLR)、RIG-I樣受體(RLR)和NOD樣受體(NLR)。本文實驗選擇NLR中研究較多的NLRP3炎癥小體作為切入點，探討薄荷酮抗炎作用的調(diào)控機(jī)制。NLRP3炎癥小體由核心蛋白NLRP3、接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白caspase-1組成，NLRP3受到內(nèi)源性或外源性危險信號刺激后，效應(yīng)蛋白caspase-1會負(fù)責(zé)將無活性的炎癥因子pro-IL-18和pro-IL-1β剪切為成熟的IL-18和IL-1β[14]。NLRP3炎癥小體能被尿酸晶體、病毒和細(xì)菌等多種物質(zhì)激活，如胞外的ATP使胞內(nèi)的鉀離子外流，激活NLRP3炎癥小體，同時，胞外的ATP 與嘌呤能離子通道型受體7(P2X7R)結(jié)合后利用通道蛋白 Pannexin-1 在細(xì)胞膜上形成開放的孔道，使胞外的激活劑進(jìn)入胞質(zhì)中誘導(dǎo) NLRP3 炎癥小體的激活。尿酸晶體等NLRP3炎癥小體激活劑被內(nèi)吞后可導(dǎo)致溶酶體損傷或破裂，使其中一些蛋白酶被釋放到胞質(zhì)中(如組織蛋白酶cathepsin-B)，進(jìn)而誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型小鼠肺組織中NLRP3、caspase-1 mRNA表達(dá)及cathepsin B、P2X7R的蛋白表達(dá)明顯升高，且模型小鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α等多種炎癥因子表達(dá)明顯增加，提示NLRP3炎癥小體被激活，而0.5 g·kg-1薄荷酮對模型小鼠肺組織核心蛋白NLRP3 mRNA的表達(dá)有明顯下調(diào)作用，對效應(yīng)蛋白caspase-1 mRNA的表達(dá)有下調(diào)趨勢，并對NLRP3炎癥小體激活的誘導(dǎo)分子cathepsin B與P2X7R的蛋白表達(dá)均表現(xiàn)出明顯抑制作用，提示0.5 g·kg-1薄荷酮可能通過改變離子通道及減輕溶酶體損傷來抑制NLRP3炎癥小體的激活，減少炎癥活性物質(zhì)的釋放。此外，研究表明NO能抑制NLRP3炎癥小體的激活[16]，本研究發(fā)現(xiàn)0.25、0.5 g·kg-1薄荷酮均能明顯對抗模型小鼠肺組織NO含量的異常升高，提示薄荷酮可能通過NO途徑抑制NLRP3炎癥小體的激活。

綜上，可認(rèn)為薄荷酮預(yù)處理對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠具有保護(hù)作用，作用發(fā)揮與抑制各類炎癥因子的釋放，從而減輕炎癥細(xì)胞浸潤，抑制炎癥反應(yīng)的病理進(jìn)程有關(guān)，其抗炎作用的發(fā)揮可能與通過改變離子通道、減輕溶酶體損傷或影響NO釋放等途徑，干擾NLRP3炎癥小體的激活有關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

[1] 何 婷,湯 奇,曾 南,等. 荊芥揮發(fā)油及其主要成分抗流感病毒作用與機(jī)制研究[J]. 中國中藥雜志,2013,38(11):1772-7.

[1] He T, Tang Q, Zeng N, et al. Study on effect and mechanism of volatile oil of Schizonepetae Herba and its essential components against influenza virus[J].ChinaJChinMaterMed, 2013,38(11):1772-7.

[2] Hu G Y, Yuan X, Zhang S Y, et al. Research on choleretic effect of menthol, menthone, pluegone, isomenthone, and limonene in DanShu capsule[J].IntImmunopharmacol, 2015, 24(2): 191-7.

[3] Mishra V, Pandeya S N, Pannecouque C, et al. Anti-HIV activity of thiosemicarbazone and semicarbazone derivatives of (+/-)-3-menthone[J].ArchPharm,2002, 335(5): 183-6.

[4] Ku C M, Lin J Y. Anti-inflammatory effects of 27 selected terpenoid compounds tested through modulating Th1/Th2 cytokine secretion profiles using murine primary splenocytes[J].FoodChem, 2013,141(2):1104-13.

[5] Cheng H M, Hsiang C Y, Chen G W, et al. Inhibition of lipopolysaccharide-induced interleukin-1β and tumor necrosis factor-α production by menthone through nuclear factor-κB signaling pathway in HaCat cells[J].ChinJPhysiol, 2008,51(3):160-6.

[6] 郭 萌,李冠民,黃清泉. 細(xì)菌內(nèi)毒素研究進(jìn)展[J]. 中國實驗動物學(xué)報,2009,17(5):397-401.

[6] Guo M, Li G M, Huang Q Q.Advances in research of bacterial endotoxin[J].ActaLabAnimSciSin, 2009,17(5):397-401.

[7] 郭媛魏,筱 華,謝 珺,等.內(nèi)毒素血癥的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2011,5(2):454-6.

[7] Guo Y W, Xiao H, Xie J, et al. Immunological pathogenesis of endotoxemia[J].ChinJClin(ElectronEd) ,2011,5(2):454-6.

[8] 吳 穎,孫 冰,肖 靜,等. 三七皂苷R1對LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷的保護(hù)作用[J]. 中國藥理學(xué)通報,2013,29(2):179-84.

[8] Wu Y, Sun B, Xiao J, et al.Protective effect of Notoginesenoside R1 on lipopolysaccharide-induced myocardial dysfunction in mice[J].ChinPharmacolBull, 2013,29(2):179-84.

[9] 陸 楊,胡冬梅,文愛東,等. 女貞總苷對急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J]. 中國藥理學(xué)通報,2016,32(4):588-9.

[9] Lu Y, Hu D M, Wen A D, et al. The protective effect of privet total glycosides on acute liver injury mice[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(4):588-9.

[10]Shigematsu Y, Niwa T, Rehnberg E, et al.Interleukin-1β induced by Helicobacter pylori infection enhances mouse gastric carcinogenesis[J].CancerLett，2013,340(1): 141-7.

[11]Yamauchi K, Choi I J, Lu H, et al. Regulation of IL-18 in Helicobacter pylori infection[J].JImmunol,2008,180(2):1207-16.

[12]常立春,賈飛勇. 粒細(xì)胞集落刺激因子的測定在人工感染動物上的研究[J]. 中國自然醫(yī)學(xué)雜志,2006,8(3):192-4.

[12]Chang L C, Jia F Y. The application of G-CSF in measuring the infections in hamster[J].ChinJNatMed, 2006,8(3):192-4.

[13]張 晶,李濤濤,馬友才,等. 心肌梗死小鼠趨化因子MIP1α和MIP1β對巨噬細(xì)胞招募作用的研究[J]. 心肺血管病雜志,2015,34(7):580-4.

[13]Zhang J, Li T T, Ma Y C, et al. Chemokines MIP1α and MIP1β promote the recruitment of macrophages after myocardial infarction in mice[J].JCardiovascPulmDis, 2015,34(7):580-4.

[14]Wen H, Miao E A, Ting J P. Mechanisms of NOD-like receptor-associated inflammasome activation [J].Immunity, 2013, 39(3):432-41.

[15]張 懿,劉 磊,劉韻資,等. NLRP3炎性小體研究新進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2014, 14(9): 1763-5.

[15]Zhang Y, Liu L, Liu Y Z, et al. Recent research progress of the NLRP3 inflammasome[J].ProgModBiomed, 2014, 14(9):1763-5.

[16]Mao K R, Chen S Z, Chen M K, et al. Nitric oxide suppresses NLRP3 inflammasome activation and protects against LPS-induced septic shock[J].CellRes,2013,23(2):201-12.

The protective effects of menthone on endotoxin-induced infalmmation in mice

WANG Feng, WEN Tao-qun, XU Feng, SANG Wen-tao, CHEN Ren, ZENG Nan

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,EducationKeyLaboratoryofStandardizationofChineseHerbalMedicine,KeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicineResourcesinSichuanProvince-KeyLaboratoryBreedingBaseCo-foundedbySichuanProvinceandMOST,Chengdu611137,China)

Aim To study the effects of menthone on LPS-induced inflammation in mice and to explore the mechanisms of activating of NLRP3 inflammasome. Methods C57BL/6J male mice were randomly divided into five groups, namely the normal group, model group, dexamethasone group (5 mg·kg-1) and menthone(0.25, 0.5 g·kg-1) groups. The dexamethasone group was given the drugs once by intraperitoneal injection on 5th day, while the other mice were given drugs by oral administration once a day for 5 d. Then, the normal group was injected with the saline and the other groups were injected LPS (15 mg·kg-1,0.01 mL·g-1) after 30 min of the last administration. 12 h after LPS injection, the blood, serum, and lung tissue of mice were collected. The levels of IL-18,IL-1β,IL-5,TNF-α,IFN-γ,G-CSF,GM-CSF and MIP-1β were measured in serum by ELISA and LuminexMagpix. The white cell in blood(WBC) were counted. The lung index and the levels of NO in lung tissue was calculated. The lung histopathology was performed. The relative levels of NLRP3, caspase-1 and IFN-α mRNA in lung tissue were determined by RT-PCR. The expressions of cathepsin B and P2X7R in lung tissue were quantified by immunohistochemical analysis. Results 0.5 g·kg-1menthone significantly reduced the levels of IL-18, IL-1β, IL-5, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, MIP-1β in serum (P<0.05 orP<0.01), and the expression of NLRP3,IFN-α,cathepsin B,P2X7R,NO in lung tissue(P<0.05 orP<0.01). 0.25 g·kg-1menthone inhibited the IL-1β,IL-5,TNF-α,MIP-1β production in serum and the expression of P2X7R,NO in lung tissue(P<0.05). 0.25, 0.5 g·kg-1menthone could attenuate pathological change of the lung tissues by reducing neutrophil infiltration and thickening of alveolar septa. And it slightly reduced the lung index and the level of white cells in blood. Conclusion Menthone has a protective effect on LPS-induced inflammation mice, and its mechanism is related to inhibiting the release of varies of inflammatory cytokines, reducing the inflammation reaction and inhibiting the activation of NLRP3 inflammasome.

menthone; endotoxin; inflammatory cytokines; NLRP3 inflammasome；cathepsin B; P2X7R

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.034.html

2016-10-18,

2016-11-14

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81473399)；國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項目(No J1310034-09)

王 鳳(1992-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥效與毒理，E-mail：972065386@qq.com； 曾 南(1969-)，女，博士，教授，研究方向：中藥藥效與毒理，通訊作者，E-mail:zengnan966@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.017

A

1001-1978(2017)02-0227-08

R-332；R284.1；R322.35；R364.5；R392.12

顯降低內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠血清IL-18、IL-1β、IL-5、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、GM-CSF、MIP-1β的水平(P<0.05或P<0.01)，下調(diào)模型小鼠肺組織NLRP3、IFN-α mRNA表達(dá)及cathepsin-B、P2X7R蛋白表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，明顯降低模型小鼠肺組織中NO的含量(P<0.05)；0.25 g·kg-1薄荷酮明顯降低模型小鼠血清中IL-1β、IL-5、TNF-α、MIP-1β含量(P<0.05)，下調(diào)肺組織中P2X7R蛋白表達(dá)及NO水平(P<0.05或P<0.01)；病理組織學(xué)檢查顯示0.5、0.25 g·kg-1薄荷酮能明顯減少肺組織切片中嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，減輕肺泡膈的增厚；薄荷酮對模型小鼠全血白細(xì)胞計數(shù)與肺指數(shù)的升高表現(xiàn)出降低趨勢。結(jié)論 薄荷酮對內(nèi)毒素致炎癥模型小鼠有保護(hù)作用，能抑制血清多種炎性細(xì)胞因子的釋放而減輕肺部炎性損傷，該作用可能與干擾NLRP3炎癥小體的激活有關(guān)。