陳 剛，譚明亮

(重慶市天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067)

茶多酚對高尿酸血癥小鼠尿酸產(chǎn)生與排泄的影響及機(jī)制研究

陳 剛，譚明亮

(重慶市天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067)

目的 觀察茶多酚(green tea polyphenols, GTP)對氧嗪酸鉀(PO)誘導(dǎo)的高尿酸血癥(HUA)小鼠血尿酸水平的影響，并從調(diào)節(jié)尿酸產(chǎn)生和排泄途徑探討其藥理機(jī)制。方法 每天分別灌胃給予PO(250 mg·kg-1)和GTP(150、300、600 mg·kg-1)，連續(xù)7 d。磷鎢酸法檢測小鼠血尿酸水平，比色法和Western blot法分別檢測肝臟黃嘌呤氧化酶(XOD)活性與表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色法檢測腎臟中尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子1(URAT1)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子(OAT)1和3的表達(dá)。結(jié)果 GTP明顯降低了氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的HUA小鼠血尿酸水平(P<0.05或P<0.01)；同時(shí)，GTP明顯降低了HUA小鼠肝臟XOD的活性和表達(dá)(P<0.05或P<0.01)；此外，GTP還明顯降低了HUA小鼠腎臟URAT1的表達(dá)，增強(qiáng)了OAT1和OAT3的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 GTP對PO誘導(dǎo)的HUA小鼠血尿酸水平有明顯降低作用，其機(jī)制與減少尿酸產(chǎn)生和增加尿酸排泄密切相關(guān)。

茶多酚；尿酸；高尿酸血癥；黃嘌呤氧化酶；尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子1；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子1；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子3

近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)發(fā)病率明顯升高，且有年輕化的趨勢[1]。HUA不僅是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，還與高血壓、冠心病、代謝綜合征、糖尿病等密切相關(guān)[2]，如何防治HUA已成為全世界關(guān)注的公共健康問題。尿酸是嘌呤堿代謝產(chǎn)物，其在體內(nèi)的產(chǎn)生主要受肝臟中的黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)催化調(diào)節(jié)，而排泄則主要依賴于腎臟中的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子如尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子(urate anion transporter, URAT)1、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子(organic anion transporter, OAT)1和3轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)，因此，尿酸生成增加和(或)排泄障礙被認(rèn)為是HUA發(fā)病的主要原因[3]。當(dāng)前臨床治療HUA主要是應(yīng)用XOD抑制劑如別嘌醇、非布司他，以及促尿酸排泄藥如苯溴馬隆，但存在著藥物品種少、副作用明顯的缺陷[4]，因此，尋找新的療效確切且副作用低的降尿酸藥物意義重大。

茶多酚(green tea polyphenols, GTP)是綠茶葉中酚類化合物及其衍生物的總稱，主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate, GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin, EGC)、咖啡堿(caffeine, CAF)、表兒茶素(epicatechin, EC)及兒茶素(Catechin, C)等，是綠茶的主要活性部位[5]。已有的研究證實(shí)GTP有減肥、降血脂、抗癌、抗骨質(zhì)疏松等藥理活性[6]，但是GTP對高尿酸血癥的影響如何，至今未見報(bào)道。本研究應(yīng)用氧嗪酸鉀(PO)誘導(dǎo)的小鼠HUA模型，觀察了GTP對HUA小鼠血尿酸水平的影響，并從尿酸產(chǎn)生和排泄途徑探討其作用機(jī)制，為明確GTP降尿酸的藥理作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑 綠茶購自重慶云嶺茶葉科技責(zé)任有限公司(產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)：Q/YLC0002S，生產(chǎn)許可：QS508314010005)；別嘌醇(allopurinol, API)購自重慶青陽藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字：H50021422，產(chǎn)品批號：120903)；尿酸試劑盒、XOD試劑盒及BCA蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；茶多酚各成分標(biāo)準(zhǔn)品、PO均購自Sigma公司；XOD、URATl、OAT1、OAT3和β-actin抗體均購自Santa Cruz公司；PVDF膜和ECL試劑購自Millipore公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒(二步法)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 Infinite M200型全標(biāo)儀為BioTek公司產(chǎn)品；RC24型高速冷凍離心機(jī)為Thermo Scientific Sorvall公司產(chǎn)品；Mill-iQ型純水系統(tǒng)為Millipore公司產(chǎn)品；1100型高效液相色譜儀為Agilent公司產(chǎn)品；ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，♂，18 g～22 g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號：SCXK(渝)2002-0001)。所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 茶多酚的制備與檢測 依據(jù)文獻(xiàn)所述方法[7]制備GTP，提取率為15.6%(W/W)，并用高效液相色譜法檢測GTP中主要成份含量(Fig 1、Tab 1)。

IngredientContent/g·100g-1GTPEGCG42．46±0．73GCG13．48±0．48ECG11．68±0．12EGC8．02±0．07EC4．36±0．04C1．41±0．24CAF4．96±0．16

2.2 模型制備與分組給藥 60只昆明小鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為對照組、模型組、API組(陽性藥，5 mg·kg-1)、GTP組(150、300、600 mg·kg-1)。本實(shí)驗(yàn)所用的GTP劑量依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。對照組給予生理鹽水，其他組每天上午9點(diǎn)開始給予250 mg·kg-1PO灌胃，10點(diǎn)灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)用藥7 d。d 7灌胃給藥1 h后，小鼠麻醉處死、取材。

Fig 1 Chromatogram of GTP using a HPLC system

2.3 尿酸檢測 麻醉小鼠后心臟取血，4℃靜置過夜，3 000 r·min-1離心10 min，取血清，尿酸含量檢測依照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 XOD活性檢測 取小鼠肝臟組織于冰上按1 ∶9的比例(W/V)加入生理鹽水充分研磨，4℃下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液[8]，XOD活性與蛋白濃度檢測均依照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 XOD表達(dá)分析 肝組織總蛋白提取依照文獻(xiàn)進(jìn)行[9]，取小鼠肝臟組織液氮速凍后，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑充分勻漿，4℃下12 000 r·min-1離心15 min，取上清液。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，4℃下與XOD抗體或者β-actin抗體共同孵育過夜，再與相應(yīng)的二抗在室溫下共同孵育1 h，滴加ECL試劑后，成像系統(tǒng)檢測分析信號。

2.6 尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)分析 取小鼠腎臟于10%多聚甲醛緩沖液中固定24 h，石蠟包埋、切片。切片脫蠟至水，免疫組化檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行，顯微鏡下(400×)分析陽性染色的光密度值，每張切片取5個(gè)視野的平均光密度值納入該蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 GTP對HUA小鼠血尿酸水平的影響 如Tab 2所示，與對照組比較，灌胃PO使模型組小鼠血尿酸水平明顯升高(P<0.01)。給予陽性藥物別嘌醇灌胃后，小鼠血尿酸水平明顯降低，與模型組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。同時(shí)，灌胃給予300、600 mg·kg-1GTP后小鼠血尿酸水平也明顯降低，與模型組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；但灌胃150 mg·kg-1GTP后小鼠血尿酸水平與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2 GTP對HUA小鼠肝臟XOD活性的影響 如Tab 2所示，灌胃PO后模型組小鼠肝臟XOD活性與對照組相比明顯增高(P<0.01)。使用別嘌醇后小鼠肝臟XOD活性與模型組相比明顯降低(P<0.01)。灌胃給予300、600 mg·kg-1GTP后，小鼠肝臟XOD活性與模型組相比也明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

Tab 2 Effect of GTP on uric acid level in serum and XOD activity in liver of hyperuricemic±s,n=10)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.3 GTP對HUA小鼠肝臟XOD表達(dá)的影響 與對照組比較，灌胃給予PO誘導(dǎo)模型組小鼠肝臟中XOD表達(dá)明顯增加(P<0.01)。給予別嘌醇治療后，小鼠肝臟XOD表達(dá)明顯減少，與模型組相比差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。灌胃給予300、600 mg·kg-1GTP后，小鼠肝臟XOD表達(dá)與模型組相比也明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。見Fig 2。

Fig 2 Effect of GTP on XOD expression in liver of hyperuricemic mice

XOD protein was analyzed by Western blot assay(A) and semi-quantitative analysis of XOD bands was performed by densitometry(B). Three independent experiments performed in duplicate.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.4 GTP對HUA小鼠腎臟URAT1、OAT1、OAT3表達(dá)的影響 與對照組比較，灌胃給予PO誘導(dǎo)了模型組小鼠腎臟URAT1表達(dá)明顯增加，同時(shí)OAT1、OAT3表達(dá)明顯降低(P<0.01)。灌胃給予300、600 mg·kg-1GTP后，小鼠腎臟URAT1表達(dá)明顯減少，同時(shí)OAT1、OAT3表達(dá)明顯增加(P<0.05，P<0.01)。給予別嘌醇治療后，小鼠腎臟URAT1、OAT1、OAT3的表達(dá)與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見Fig 3、Tab 3。

Fig 3 Effect of GTP on expression of URAT1,OAT1 and OAT3 in kidney of hyperuricemic mice

GroupDose/mg·kg-1URAT1OAT1OAT3Control-0．19±0．040．6±0．110．53±0．1Model-0．55±0．07??0．35±0．07??0．33±0．04??API50．52±0．110．33±0．050．36±0．06GTP1500．55±0．090．32±0．080．36±0．093000．48±0．07#0．44±0．07##0．44±0．09##6000．38±0．05##0．49±0．09##0．45±0．09##

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

4 討論

本研究應(yīng)用PO誘導(dǎo)的HUA小鼠模型，發(fā)現(xiàn)GTP可降低HUA小鼠血尿酸水平，同時(shí)GTP降低了肝臟XOD活性和表達(dá)，減少了腎臟中URAT1蛋白的表達(dá)，且腎臟中OAT1、OAT3蛋白的表達(dá)有所增加。

近年來，HUA發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)明顯增高，而且年輕化趨勢明顯，如何控制HUA已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界重點(diǎn)關(guān)注領(lǐng)域[1]。目前，已有多種動(dòng)物模型用于HUA基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)，其中PO誘導(dǎo)的HUA模型被廣泛應(yīng)用。PO可抑制嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)尿酸酶活性，阻斷尿酸代謝成為水溶性更高的尿囊素，從而導(dǎo)致血尿酸水平異常升高[9]。該模型用時(shí)短，費(fèi)用也相對低廉，高尿酸水平能穩(wěn)定維持，故本實(shí)驗(yàn)選用該模型用于觀察GTP的降尿酸作用及藥理機(jī)制研究。我們發(fā)現(xiàn)，給予小鼠灌胃250 mg·kg-1PO連續(xù)7 d，誘導(dǎo)了小鼠血尿酸水平明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)給予臨床常用的降尿酸藥物API，小鼠血尿酸水平明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，GTP有較明顯的降尿酸藥理作用，

尿酸是嘌呤堿代謝終產(chǎn)物，黃嘌呤在XOD作用下代謝為次黃嘌呤，再繼續(xù)在XOD作用下代謝成為尿酸[2]。機(jī)體內(nèi)XOD含量最高的器官是肝臟，所以肝臟是人體尿酸產(chǎn)生的主要器官。抑制肝臟XOD活性或者表達(dá)勢必明顯減少尿酸的產(chǎn)生，降低血尿酸水平[10]。XOD一直是治療HUA的藥物研發(fā)的靶點(diǎn)，且當(dāng)今臨床常用的XOD抑制劑如別嘌醇及非布司他表現(xiàn)出有效的降尿酸作用，凸顯了調(diào)控XOD對維持機(jī)體尿酸穩(wěn)態(tài)的重要性[11]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，給予PO連續(xù)灌胃7 d明顯誘導(dǎo)了小鼠肝臟XOD活性增強(qiáng)，XOD表達(dá)也明顯增加，這一結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相似[12]。給予API用藥后，HUA小鼠肝臟XOD活性和表達(dá)均明顯降低。給予GTP治療后，PO誘導(dǎo)升高的小鼠肝臟XOD活性和表達(dá)也均明顯降低，與模型組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果表明，GTP對PO誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平有明顯的降低作用，其機(jī)制與抑制肝臟XOD活性和表達(dá)，從而減少尿酸產(chǎn)生密切相關(guān)。

機(jī)體的尿酸約70%由腎臟排泄，剩下的30%通過消化道排泄[13]。血液中的尿酸鹽幾乎全部從腎小球過濾，但是90%過濾后的尿酸在腎小管被重吸收[14]。URAT1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣，是迄今發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)尿酸重吸收最強(qiáng)有力的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，在維持血尿酸穩(wěn)態(tài)中的重要作用[15]。OAT1和OAT3大量表達(dá)于腎近端小管基底膜，主要功能是將管周隙的有機(jī)陰離子包括尿酸鹽通過基底膜轉(zhuǎn)運(yùn)到腎近曲小管上皮細(xì)胞中，由此排泌到尿液，是公認(rèn)的人體內(nèi)介導(dǎo)尿酸分泌入腎小管的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)體[16-17]。在本研究中，給予PO連續(xù)灌胃7 d誘導(dǎo)了腎臟組織中的URAT1表達(dá)明顯增高，同時(shí)OAT1和OAT3表達(dá)明顯降低，提示PO導(dǎo)致了腎臟尿酸代謝紊亂，即尿酸鹽重吸收增強(qiáng)而分泌減弱，最終使得血尿酸水平升高。給予GTP治療7 d后，PO誘導(dǎo)高表達(dá)的URAT1則明顯減少，而PO誘導(dǎo)低表達(dá)的OAT1和OAT3則明顯增加，提示GTP通過減少尿酸鹽重吸收和增強(qiáng)尿酸鹽分泌改善了PO導(dǎo)致的腎臟尿酸代謝紊亂，最終使得血尿酸水平降低。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GTP可降低PO誘導(dǎo)的HUA小鼠血尿酸水平，其機(jī)制既與抑制XOD介導(dǎo)的尿酸產(chǎn)生有關(guān)，又與調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)子介導(dǎo)的尿酸排泄密切相關(guān)。本研究證實(shí)了GTP具有降低血尿酸水平的作用，并初步闡明了其藥理機(jī)制，為開發(fā)利用GTP為新的降尿酸健康產(chǎn)品提供了科學(xué)依據(jù)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)均在重慶工商大學(xué)重慶市天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝該實(shí)驗(yàn)室孔淑貞博士、馮敏博士給予的技術(shù)支持。)

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Effect of green tea polyphenols on uric acid level in potassium oxonate-induced hyperuricemic mice and mechanism

CHEN Gang, TAN Ming-liang

(ChongqingKeyLaboratoryofNatureMedicineResearch,

ChongqingTechnologyandBusinessUniversity,Chongqing400067,China)

Aim To investigate the effect of green tea polyphenols(GTP) on serum level of uric acid in potassium oxonate(PO)-induced hyperuricemic mice, and explore the potential mechanism.Methods PO and GTP were intragastricly administered to mice for seven consecutive days. Uric acid level in serum was examined. Meanwhile, activity and expressions of xanthine oxidase(XOD) in liver were tested. In additon, expressions of urate transporters including urate-anion transporter(URAT) 1, organic anion transporter(OAT) 1 and 3 in kidney were analyzed.Results GTP significantly decreased the serum level of uric acid in PO-induced hyperuricemic mice. At the same time, GTP markedly reduced the activity and expression of XOD in liver of hyperuricemic mice. Finally, GTP markedly reduced the expression of URAT1, OAT1 and OAT3 in kidney of hyperuricemic mice.Conclusion GTP has the effect of lowering uric acid in PO-induced hyperuricemic mice through both decreasing the uric acid production and increasing uric acid excretion.

green tea polyphenols; uric acid; hyperuricemia; xanthine oxidase; urate-anion transporter 1; organic anion transporter 1; organic anion transporter 3

時(shí)間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.030.html

2016-10-22,

2016-11-25

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No KJ1400626)；重慶市科委前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No cstc2016jcyja0475)

陳 剛(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：高尿酸血癥與痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制與藥物防治，通訊作者，E-mail：licoricech@ctbu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.015

A

1001-1978(2017)02-0218-05

R-332；R284.1；R446.11；R589.7