劉紅霞，于臘梅，黃 瑾，張立霞，岳 真，李慶忠

(濱州醫(yī)學院 1.基礎醫(yī)學院生理學教研室、2.附屬醫(yī)院院辦、3.醫(yī)藥研究中心、4. 基礎醫(yī)學院生物化學教研室、5.藥理學教研室,山東 煙臺 264003)

硫化氫對創(chuàng)傷后應激障礙大鼠空間學習記憶能力及海馬神經(jīng)元放電的影響

劉紅霞1，于臘梅1，黃 瑾2，張立霞3，岳 真4，李慶忠5

(濱州醫(yī)學院 1.基礎醫(yī)學院生理學教研室、2.附屬醫(yī)院院辦、3.醫(yī)藥研究中心、4. 基礎醫(yī)學院生物化學教研室、5.藥理學教研室,山東 煙臺 264003)

目的 探討創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)大鼠行為學改變及腦內(nèi)胱硫醚-β-合成酶(cysta-thionine-β-synthase, CBS)/硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)水平的變化，并研究外源性補充H2S對大鼠行為學影響的作用及機制。方法 應用連續(xù)單一應激方案制備創(chuàng)傷后應激障礙動物模型，用Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力，Western blot技術和亞甲基藍法檢測海馬腦區(qū)CBS/H2S體系含量，用多管微電極在體細胞外電生理記錄海馬神經(jīng)元放電情況。結果 ① 與正常對照組比較，PTSD組大鼠逃避潛伏期增加(P<0.01)，在平臺所在象限停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù)明顯減少(P<0.01)；海馬腦區(qū)的CBS/H2S體系含量明顯降低(P<0.01，P<0.05)。② 與PTSD組比較，PTSD+硫氫化鈉(sodium hydrosulfide,NaHS)組大鼠逃避潛伏期減小(P<0.01)，在平臺所在象限停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù)明顯增加(P<0.01)。③ 微量壓力注射L-半胱氨酸(L-cysteine)使海馬神經(jīng)元自發(fā)放電頻率明顯升高(P﹤0.01)。結論 PTSD大鼠通過抑制海馬腦區(qū)CBS/H2S體系導致空間學習記憶能力降低。H2S改善PTSD大鼠空間學習記憶能力的機制可能與其增加海馬神經(jīng)元放電頻率和興奮性有關。

硫化氫；胱硫醚-β-合成酶；硫氫化鈉；創(chuàng)傷后應激障礙；海馬;在體細胞外電生理記錄

創(chuàng)傷后應激障礙(posttraumatic stress disorder，PTSD)是由于異乎尋常的威脅性或災難性心理創(chuàng)傷，導致延遲出現(xiàn)和長期持續(xù)的精神障礙。PTSD發(fā)病機制多樣[1]，研究報道PTSD患者海馬縮小20%[2]，海馬-杏仁核[特別是基底外側杏仁核(basolateral amygdala, BLA)]間神經(jīng)環(huán)路突觸效能的長時程增強(long term potentiation, LTP)可能是應激導致焦慮的神經(jīng)基礎[3]。目前該病主要有心理和抗抑郁藥治療，而抗抑郁藥精神副作用較大，因此探究PTSD的神經(jīng)生物學機制對尋找治療靶點具有重要意義?？茖W家Goodwin于1989年首次成功檢測到腦內(nèi)游離的硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)[4]，主要通過抗炎、抗氧化[5]、抗神經(jīng)元凋亡[6]、易化海馬LTP[7]、抑制谷氨酸的釋放、抑制促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素的釋放[8]等作用發(fā)揮著神經(jīng)功能調(diào)控作用。進一步研究也證實，H2S參與學習記憶和情緒調(diào)節(jié)[9-10]。而學習記憶能力下降和條件性恐懼行為增強是PTSD患者的部分臨床癥狀。那么，PTSD患者海馬腦區(qū)H2S如何變化？外源性補充H2S是否影響PTSD患者的行為學表現(xiàn)？其機制如何？我們用連續(xù)單一應激方案(single prolonged stress paradigm，SPS)制備大鼠PTSD模型，用Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力， Western blot技術和亞甲基藍法檢測海馬腦區(qū)內(nèi)胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)/H2S體系含量，用多管微電極在體細胞外電生理記錄海馬神經(jīng)元放電情況，對以上問題進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及給藥 實驗選用♂健康成年Wistar大鼠，體質(zhì)量200 g～300 g，由青島市藥檢所動物中心提供。大鼠在實驗環(huán)境適應性飼養(yǎng)5 d，治療組于造模前30 min及行為學測試前30 min分別腹腔注射11.2 mg·kg-1NaHS。正常對照組(normal)和創(chuàng)傷后應激障礙(PTSD)組腹腔注射等劑量生理鹽水。造模后d 14檢測行為學各項指標。

1.2 藥品與儀器 NaHS和滂胺天藍購自美國Sigma公司，CBS抗體購自Santa Cruz公司，Micro1401數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和Spike2數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)購自英國CED公司。

1.3 制備PTSD模型 采用2005年日本文部省召開的“基礎和臨床研究進展”國際會議確定的SPS方案制備大鼠PTSD模型，將大鼠連續(xù)進行下述步驟處理：禁錮2 h；強迫性游泳20 min(水深40 cm，水溫25℃)；休息15 min后乙醚麻醉，意識喪失后停止麻醉。

1.4 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗是考察海馬依賴的空間記憶的最經(jīng)典實驗。圓形水池直徑為160 cm，池中可移動平臺直徑為10 cm，水溫為20℃，水深40 cm，池中平臺位于水下1 cm。定位航行實驗，連續(xù)訓練5 d，對d 5兩輪訓練的逃避潛伏期平均值進行分析?？臻g搜索實驗，在d 6訓練結束后進行空間記憶測試，動物在平臺上停留60 s，后撤除水下平臺，計時120 s，計算機自動分析出動物在原平臺所在象限的時間百分比及穿越平臺位置的次數(shù)。

1.5 亞甲藍法[11]檢測腦組織H2S含量 造模后d 14行為學測試完成后，麻醉大鼠斷頭取腦，冰上分離雙側海馬，稱重后將組織樣本勻漿裂解(每毫克組織加10 μL磷酸氫鉀緩沖液)。為防止H2S與玻璃結合，整個實驗操作過程采用高質(zhì)量的聚丙烯塑料管作為容器。吸取組織裂解上清(200 μL)與10 g·L-1醋酸鋅混合，可生成硫化鋅沉淀。高速離心15 min(20 000×g)，收集沉淀并將沉淀用溶于7.2 mol·L-1鹽酸的N,N-二甲基-對苯二胺硫酸鹽(20 mmol·L-1)150 μL和溶于1.2 mol·L-1鹽酸的FeCl3(30 mmol·L-1)100 μL液體進行溶解。靜置15 min后，將200 μL液體轉(zhuǎn)移到96孔板中并用670 nm波長進行吸光度檢測。配制NaHS作出標準曲線，計算樣品中H2S含量。

1.6 Western blot方法檢測腦組織CBS蛋白的表達 造模后d 14行為學測試完成后，麻醉大鼠斷頭取腦，冰上分離出雙側海馬，稱重后按照每10 mg腦組織加入100 μL裂解液并勻漿，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清，BCA 法進行蛋白定量。將樣品蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加一抗(CBS polyclonal antibody) 1 ∶2 000和二抗 (goat anti-rabbit IgG, HRP conjugate) 1 ∶2 000，ECL顯色后在暗室中壓片、顯影、定影，掃描后用 Image J 軟件分析各條帶的灰度值。

1.7 電生理學方法 腹腔注射20%烏來糖(1 g·kg-1)進行麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀上，參照大鼠腦圖譜(Paxinos Watson，2005)，海馬區(qū)的具體坐標為：前囟向后3.6 mm，中線旁開2.5 mm，向下2.3 mm～4.0 mm。記錄電極管內(nèi)注入2%滂胺天藍，其余兩管注入相應藥物。打開顱骨腦膜后，用液壓推進器將微電極尖端緩慢送至海馬，觀察細胞放電平穩(wěn)至少5 min，利用PM2000B型四道壓力注射儀通過氣體壓力將藥物注射到神經(jīng)元表面，通過Micro1401數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)顯示細胞放電曲線，用Spike2數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對細胞放電頻率進行分析。以加藥前120s內(nèi)平均每秒放電頻率為對照，將加藥后反應高峰50 s內(nèi)平均每秒放電頻率作為藥物的效應，放電頻率超過2倍標準差認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PTSD模型大鼠空間學習記憶能力降低 Morris水迷宮實驗中，與正常對照組比較，PTSD組大鼠逃避潛伏期增加(P<0.01)(Fig 1 A)；在平臺所在象限停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù)明顯減少(P<0.01)(Fig 1 B、C)。

2.2 PTSD大鼠海馬組織內(nèi)源性H2S含量降低 用亞甲基藍法檢測結果如Fig 2所示，與正常對照組相比，PTSD大鼠海馬腦區(qū)的內(nèi)源性H2S含量明顯降低(P<0.01)。

2.3 PTSD大鼠海馬組織CBS表達降低 大鼠與人的腦組織中H2S主要依賴CBS產(chǎn)生，F(xiàn)ig 2實驗結果顯示PTSD大鼠海馬腦區(qū)內(nèi)源性的H2S水平降低，CBS蛋白表達是否也降低了呢？如Fig 3所示，PTSD大鼠海馬腦區(qū)CBS的表達水平明顯下降(P<0.05)。

2.4 H2S供體NaHS可改善PTSD大鼠海馬依賴性的空間學習記憶能力 上述結果顯示，PTSD大鼠海馬組織CBS/H2S體系減少，空間學習記憶能力降低，那么，是否可通過外源性增加H2S的水平來改善PTSD大鼠的空間學習記憶能力呢？Morris水迷宮實驗中，與PTSD組比較，PTSD+NaHS組大鼠逃避潛伏期減小(P<0.01)(Fig 4A)；在平臺所在象限停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù)明顯增加(P<0.01)(Fig 4 B、4C)。

2.5 H2S供體L-cysteine對正常大鼠海馬神經(jīng)元細胞外放電的影響 為了探討L-cysteine對整體狀態(tài)下大鼠海馬的電生理效應，我們利用多管微電極進行細胞外電生理記錄，觀察L-cysteine對海馬神經(jīng)元放電頻率的影響。如Fig 5所示，微量壓力注射無菌生理鹽水前后海馬神經(jīng)元的放電頻率差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；微量壓力注射L-cysteine使海馬神經(jīng)元自發(fā)放電頻率明顯升高(P<0.01)。

Fig 1 Escape latency(A), quadrant time %(B) and platform crossing times (C) of Morris water maze in normal and PTSD group

##P<0.01vsnormal group

3 討論

PTSD動物模型研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過創(chuàng)傷應激處理后的動物在生理和行為上表現(xiàn)出與PTSD患者很強的相似性，主要有下丘腦-垂體-腎上腺軸系統(tǒng)負反饋抑制增加、聽覺驚嚇反應增強、條件性恐懼反應持續(xù)保存、空間記憶受損等。本實驗采用的SPS方案應激動物模型是PTSD行為敏感化常用的應激模式，主要模擬了PTSD患者對創(chuàng)傷線索的驚嚇反應增強，此模型所導致的癥狀可以被抗焦慮藥和抗抑郁藥所改善，具有良好的預測效度。Morris水迷宮實驗是考察海馬依賴的空間學習記憶能力的最經(jīng)典實驗，包括定位航行實驗和空間搜索實驗。本研究采用SPS方案制備PTSD動物模型，采用Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期、平臺所在象限停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù)等指標來檢測大鼠空間學習記憶能力。研究結果顯示PTSD組大鼠在Morris水迷宮實驗中，逃避潛伏期增加，在平臺所在象限停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù)明顯減少，與徐愛軍等[12]研究結果一致，均提示PTSD模型大鼠空間學習記憶能力降低。

Fig 2 H2S level of hippocampus tissue in normal and PTSD group

##P<0.01vsnormal group

Fig 3 CBS level of hippocampus tissue in normal and PTSD group

#P<0.05vsnormal group

Fig 4 Escape latency(A), quadrant time %(B) and platform crossing times (C) of Morris water maze in different group

#P<0.05，##P<0.01vsnormal group;**P<0.01vsPTSD group

對人和動物的研究表明，杏仁核、海馬與內(nèi)側前額葉皮層在PTSD相關癥狀中具有重要作用。實驗研究顯示[13]，PTSD模型大鼠海馬神經(jīng)元萎縮、凋亡，甚至海馬體積縮小；臨床研究發(fā)現(xiàn)[2]，PTSD患者海馬縮小20% ，應激引起的海馬損傷不僅可以導致機體處理應激后記憶發(fā)生障礙，而且可以引起新的學習記憶過程受損；海馬-杏仁核(特別是BLA)間神經(jīng)環(huán)路突觸效能的長時程增強可能是應激導致焦慮的神經(jīng)基礎[3]，也是條件性恐懼的神經(jīng)基礎。故我們研究了PTSD模型大鼠與海馬相關的空間學習記憶能力的變化和機制。

Fig 5 Effect of H2S system on frequency of spontaneous discharges of hippocampus neurons

A:Initial graph of frequency of spontaneous discharges of hippocampus neurons;B:Histogram of frequency of spontaneous discharges of hippocampus neurons before and after administration.##P<0.01vsbefore administration

H2S是一種新型的氣體信號分子，H2S在大腦內(nèi)含量相對較高(50～160 μmol·L-1)，腦內(nèi)H2S主要通過CBS分解半胱氨酸形成[14]。生理濃度的H2S在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著神經(jīng)功能調(diào)控作用。H2S參與學習記憶和情緒調(diào)節(jié)，進一步研究也證實，抑制H2S合成損傷大鼠海馬依賴的情景型恐懼記憶和新物體認知能力，外源性H2S可增強大鼠海馬依賴的情景型恐懼記憶和新物體認知[9]。而學習記憶能力下降和條件性恐懼行為增強是PTSD患者的部分臨床癥狀。故我們推測PTSD大鼠海馬腦區(qū)CBS/H2S體系含量會變化，本實驗結果也顯示PTSD大鼠海馬腦區(qū)CBS的表達和H2S的生成均明顯低于正常對照組，提示PTSD患者的行為學改變可能與海馬腦區(qū)CBS/H2S體系受抑制相關。NaHS是一種公認的較常用H2S供體，通過腹腔注射NaHS可以促進腦內(nèi)H2S水平的升高[11]。本研究通過腹腔注射NaHS研究外源性補充H2S對PTSD大鼠行為學的影響，結果顯示NaHS治療組與PTSD組比較，空間學習記憶能力得到了改善。這與以往研究[8]報道的H2S可改善大鼠的學習記憶能力結果一致。

研究顯示，H2S可抑制興奮性氨基酸的釋放，而興奮性谷氨酸可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性；內(nèi)源性H2S可通過cAMP途徑增強與認知密切相關的NMDA受體功能，進而促進作為學習記憶分子學基礎的海馬LTP[7]；H2S通過增強NMDA受體的NR2A亞基功能促進海馬LTP來調(diào)節(jié)海馬依賴的情景型恐懼記憶和新物體認知能力[9]。以上的研究均提示H2S可以影響神經(jīng)元的電生理特性。故本實驗利用在體細胞外電生理記錄法，觀察微量加壓注射H2S供體L-cysteine對大鼠海馬神經(jīng)元自發(fā)放電頻率的影響，與以上文獻[7,9]報道一致，L-cysteine可以影響神經(jīng)元的電生理特性，主要表現(xiàn)為使海馬神經(jīng)元放電頻率升高，產(chǎn)生興奮效應。結合以上實驗結果我們分析，H2S改善PTSD大鼠行為學指標的機制可能與其增加海馬神經(jīng)元放電頻率和興奮性有關。 綜上所述，本研究證實海馬區(qū)CBS/H2S體系的含量與海馬依賴性的空間學習記憶能力具有明顯的相關性。外源性增加H2S含量可改善PTSD大鼠的空間學習記憶能力，該作用可能與其增加海馬神經(jīng)元放電頻率和興奮性有關。

(致謝:本實驗在青島大學生理學教研室和濱州醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心完成。感謝陳蕾、周宇和馬春蕾老師的指導與支持。)

[1] 張黎明,張有志,李云峰.創(chuàng)傷后應激障礙的神經(jīng)生物學研究進展[J].中國藥理學通報,2010,26(6):704-7.

[1] Zhang L M,Zhang Y Z,Li Y F.The progress of neurobiological mechanisms on PTSD[J].ChinPharmacolBull,2010,26(6):704-7.

[2] Childress J E, McDowell E J, Dalai V V,et al. Hippocampal volumes in patients with chronic combat-related posttraumatic stress disorder: a systematic review[J].JNeuropsychiatryClinNeurosci, 2013,25(1): 12-25.

[3] Adamec R E,Blundell J,Burton P.Neural circuit changes mediating lasting brain and behavioral response to predator stress[J].NeurosciBiobehavRev, 2005,29(8): 1225-41.

[4] Garcia-Mata C,Lamattina L.Gasotransmitters are emerging as new guard cell signaling molecules and regulators of leaf gas exchange[J].PlantSci, 2013,201-202:66-73.

[5] Elrod J W, Calvert J W, Morrison J, et al.Hydrogen sulfide attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury by preservation of mitochondrial function[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2007,104(39):15560-5.

[6] Shao J L,Wan X H, Chen Y, et al.H2S protects hippocampal neurons from anoxia-reoxygenation through cAMP-mediated PI3K/Akt/p70S6K cell-survival signaling pathways[J].JMolNeurosci, 2011,43(3): 453-60.

[7] Kimura H.Hydrogen sulfide induces cyclic AMP and modulates the NMDA receptor[J].BiochemBiophysResCommun, 2000,267(1): 129-33.

[8] Dello Russo C, Tringali G, Ragazzoni E, et al. Evidence that hydrogen sulphide can modulate hypothalamo-pituitary-adrenal axis function:invitroandinvivostudies in the rat[J].JNeuroendocrinol, 2000,12(3): 225-33.

[9] 楊遠堅.氣體信號分子對邊緣系統(tǒng)介導的大鼠記憶功能的影響及機制[D].武漢：華中科技大學,2012.

[9] Yang Y J.Regulation of limbic system-mediated memory and behavior by gaseous signal molecule[D].Wuhan:Huazhong University of Science and Technology,2012.

[10]侯曉怡.氣體信號分子硫化氫對慢性不可預知性應激所致大鼠抑郁樣行為的作用及機制[D].武漢：華中科技大學，2014.

[10]Hou X Y. Effects and mechanism of gaseous signal moleculehydrogen sulfide on the depressive-like behaviorinduced by chronic unpredictable stress of rats[D]. Wuhan:Huazhong University of Science and Technology,2014.

[11]Hu L F, Lu M, Tiong C X, et al.Neuroprotective effects of hydrogen sulfide on Parkinson′s disease rat models[J].AgingCell, 2010,9(2): 135-46.

[12]徐愛軍,李 冉,王海濤,等. 創(chuàng)傷后應激障礙大鼠海馬組織5-HT1受體mRNA的表達[J].中風與神經(jīng)疾病雜志,2012,29(2):137-9.

[12]Xu A J,Li R,Wang H T,et al. Expression of 5-HT type 1 receptors mRNA in hippocampi of PTSD rats[J].JApoplexyNervDis,2012,29(2):137-9.

[13]Bonne O, Vythilingam M, Inagaki M, et al. Reduced posterior hippocampal volume in posttraumatic stress disorder[J].JClinPsychiatry,2008,69(7): 1087-91.

[14]Stipanuk M H, Beck P W. Characterization of the enzymic capacity for cysteine desulphhydration in liver and kidney of the rat[J].BiochemJ, 1982,206(2): 267-77.

Effect of H2S system on space learning and memory ability in PTSD model rat and on the frequency of spontaneous discharges of hippocampus neurons

LIU Hong-xia1,YU La-mei1,HUANG Jin2,ZHANG Li-xia3,YUE Zhen4,LI Qing-zhong5

(1.DeptofPhysiology,SchoolofBasicMedicalSciences; 2.AdministrativeOffice,YantaiAffiliatedHospital; 3.PharmacyResearchCenter; 4.DeptofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofBasicMedicalSciences; 5.DeptofPharmacology,BinzhouMedicalUniversity,YantaiShandong264003,China)

Aim To explore the behavior and CBS/H2S levels of hippocampus in post traumatic stress disorder (PTSD) rats and study the effect of exogenous H2S on PTSD rats.Methods Single prolonged stress paradigm was adopted to prepare PTSD animal model. Morris water maze test was adopted to test space learning and memory ability. CBS/H2S content in hippocampus tissue sample was measured using Western blot and methylene blue method.Invivoextracellular single unit recording was used to examine the frequency of spontaneous discharges of hippocampus neurons.Results ① Escape latency increased and quadrant time(%) and platform crossing times decreased in Morris water maze test of PTSD group compared with normal group(P<0.01). CBS/H2S level in hippocampus tissue of PTSD group also decreased compared with normal group(P<0.01,P<0.05).② Escape latency decreased and quadrant time(%) and platform crossing times increased in Morris water maze test of NaHS+PTSD group compared with PTSD group(P<0.01).③ L-cysteine increased the frequency of spontaneous discharges of hippocampus neurons(P﹤0.01).Conclusions Learning and memory ability decrease in PTSD model rats owing to the inhibition of CBS/H2S content in hippocampus tissue.The mechanism of behavior improvement of H2S on PTSD model rat is possibly related to the excitation of H2S on frequency of spontaneous discharges of hippocampus neurons.

H2S;CBS;NaHS; posttraumatic stress disorder;hippocampus;invivoextracellular single unit recordings

時間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.026.html

2016-10-22,修回稿日期：2016-11-29

山東省自然科學基金資助項目(No ZR2013HL009，ZR2013HL002，ZR2013HL003，ZR2013HL007)；煙臺市科技發(fā)展計劃項目(No 2012ZH248)；山東省高?？萍加媱濏椖?No J12LM03)

劉紅霞(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：學習記憶與認知功能障礙,通訊作者,E-mail: liuhongxia3210@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.013

A

1001-1978(2017)02-0206-06

R-332；R322.81；R338.64；R338.8；R749.72