張瑞海趙汝梅張書光

(1.盈江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南盈江 679300；2.德宏州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南芒市 678400；3.昆明理工大學(xué)津橋?qū)W院，云南昆明 650101)

云南德宏地區(qū)一例虎紋蛙氣單胞菌的分離鑒定

張瑞海1趙汝梅3張書光2*

(1.盈江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南盈江 679300；2.德宏州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南芒市 678400；3.昆明理工大學(xué)津橋?qū)W院，云南昆明 650101)

目的：確診虎紋蛙的致病菌。方法：采用平板分離法從死亡虎紋蛙肝臟中分離出1株細(xì)菌，通過表型、16s-rRNA的PCR擴(kuò)增、測(cè)序鑒定。結(jié)果：分離菌的測(cè)序結(jié)果為氣單胞菌，16s rRNA序列同源性分析結(jié)果表明分離菌與氣單胞菌的同源性為99%。結(jié)論：虎紋蛙所患細(xì)菌病為胃腸炎，細(xì)菌病原為氣單胞菌。

氣單胞菌 分離 鑒定 16s-rRNA

虎紋蛙（Rana tigrina Wiegmann）隸屬于兩棲綱無尾目蛙科蛙屬，廣泛分布于中國、印度、尼泊爾、錫金、孟加拉、斯里蘭卡、泰國、印度尼西亞及菲律賓等熱帶和亞熱帶地區(qū)?；⒓y蛙共有4個(gè)亞種，中國僅分布1 亞種，即 虎紋蛙，目前已被列為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，主要分布于我國東南和南部各省，河南和陜西南部也偶有分布。云南的隴川、盈江、勐臘、河口、金平、屏邊、石屏和元江等地均有分布。

氣單胞菌在細(xì)菌分類學(xué)上屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），是多種魚類均可感染的病原細(xì)菌，且感染后的病型也表現(xiàn)很復(fù)雜，同時(shí)存在多種不同的免疫血清型。其中有的不僅可致魚病，還可引起人的感染發(fā)病。陳懷青等報(bào)道嗜水氣單胞菌引起鯉科魚暴發(fā)性傳染病，朱家新報(bào)道嗜水氣單胞菌引起牛蛙暴發(fā)性疾病，韓名竹等報(bào)道嗜水氣單胞菌引起甲魚出血性敗血癥。近年來，有關(guān)氣單胞菌引發(fā)養(yǎng)殖鰻鱺的細(xì)菌性敗血癥也多有報(bào)道，最常見的由致病性嗜水氣單胞菌 Aeromonas hydrophila引起的鰻鱺敗血癥表現(xiàn)為體表充血乃至潰爛、血性腹水、胃內(nèi)積水、腸炎、肝脾等組織敗血等系列嚴(yán)重病變，每年都能引起養(yǎng)殖鰻鱺的大批量死亡。

1 材料與方法

1.1 材料

病料由云南德宏某個(gè)體養(yǎng)殖戶送檢；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP2001）和Ex tag酶購自大連寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物

根據(jù)已知參比序列設(shè)計(jì)細(xì)菌通用引物，上游引物PF：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，下游引物PR：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’，擴(kuò)增目的片段大小為1500bp左右，由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 菌株的分離與純化

采取虎紋蛙的肝臟病料，涂布于LB平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱37攝氏度培養(yǎng)12～16h后觀察細(xì)菌生長情況。挑取單個(gè)典型菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)后分別進(jìn)行革蘭氏染色及菌種保存。

1.4 16s-rRNA鑒定

1.4.1 16s-rRNA測(cè)序

將分離菌株接種LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10h，用試劑盒按說明書方法提取基因組DNA。用細(xì)菌通用引物pF、pR、擴(kuò)增16s-rRNA，PCR擴(kuò)增體系為50μL，反應(yīng)條件為95℃ 5 min；94℃30 S，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送到大連TaKaRa公司測(cè)序。

1.4.2 16s-rRNA測(cè)序結(jié)果比對(duì)

將測(cè)序結(jié)果提交至GenBank進(jìn)行比對(duì)。下載同源性最高的序列，用本地軟件DNAMAN將測(cè)序結(jié)果與下載序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從樣品中分離到1株細(xì)菌，命名為A1。

2.1 菌落特征

LB平板上菌落為光滑，灰白色，半透明，隆起，濕潤，圓形的菌落（如圖1）：

圖1 菌落特征

2.1.1 形態(tài)特征

革蘭氏染色后光鏡下檢查，紅色、桿狀、兩端頓圓、無鞭毛，無莢膜，無芽孢，革蘭氏陰性細(xì)菌。其鏡檢特性見圖2：

圖2 革蘭氏染色形態(tài)

2.2 16s-rRNA鑒定

2.2.1 分離菌的16s-rRNA基因

提取分離菌株的基因組DNA，利用細(xì)菌16s-rRNA通用引物PCR擴(kuò)增，得到約1.5 kb大小的目片段，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果（見圖3）。

張瑞海（1967-），男，云南德宏人，盈江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心工作.

張書光（1988-），男，河南三門峽人，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)研究生，德宏州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心工作。