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        嚙齒類海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)及方法改進

        2017-02-24 20:11:27陳學周畢意輝張可可張明凱
        安徽農(nóng)學通報 2016年2期

        陳學周++畢意輝++張可可++張明凱++尤濤

        摘 要:目的:通過對新生嚙齒類海馬神經(jīng)元的分離和培養(yǎng),嘗試建立一個簡單、穩(wěn)定、高效的嚙齒類海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法,為脊髓損傷的相關(guān)分子機制研究提供目的細胞。方法:取新生SD乳鼠的海馬組織,通過低濃度胰酶消化制成細胞懸液、4h差速貼壁后使用無血清Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài),免疫熒光對海馬神經(jīng)元相關(guān)微管蛋白-2(MAP2)行特異性染色,結(jié)合DAPI核染色鑒定神經(jīng)元。結(jié)果:該方法培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長狀態(tài)良好,純度較高。結(jié)論:采用低濃度胰酶消化,差速貼壁及無血清培養(yǎng)嚙齒類海馬神經(jīng)元符合體外細胞實驗要求,為進一步研究提供良好的目的細胞。

        關(guān)鍵詞:海馬神經(jīng)元;低濃度胰酶;差速貼壁;無血清培養(yǎng)

        中圖分類號 Q42 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731(2016)02-06-03

        Culturing and Identification of the Neonatal Rodent Hippocampal Neurons

        Chen Xuezhou1 et al.

        (1 The Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022,China)

        Abstract:Obejctive:To established a simple, effective and stable method for the culture of rat hippocampal neurons in vitro, and provide target cell for dissecting molecular and cellular mechanisms in neuroscience.Methods:The hippocampus of neonatal rat were dissected and cell suspension were digested by low concentration of trypsin.The cell suspensions were cultured with serum-free Neurobasal medium after four hours differential adherence.Morphological observation of neurons growth state by inverted microscope, the hippocampal neurons can be identified by MAP2 specific antibody with DAPI.Results:The hippocampal neurons grew well and reached a high purity.Conclusion:Using low concentration of trypsin, differantial adherence and serum-free medium conforms to the requirements of neonatal rat hippocampal neurons culture in vitro, so as to provide targeted cells for further research.

        Key words:Hippocampal neurons;Low concentration of trypsin;Differantial adherence;Serum-free medium

        脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是脊柱外科一種致殘率很高的疾病,易造成患者運動功能障礙,大小便失禁甚至終身癱瘓[1]。現(xiàn)代研究表明,脊髓損傷后,經(jīng)歷第一次原發(fā)性損傷及第二次繼發(fā)性損傷,二次損傷是繼發(fā)性,是可以預防和治療的,其重點在于保護殘存神經(jīng)元的功能[2]。建立簡單、穩(wěn)定、高效的神經(jīng)元體外培養(yǎng)是在細胞水平研究脊髓損傷的重要物質(zhì)基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 動物 出生24h內(nèi)SD乳鼠,雌雄不限,由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

        1.1.2 主要試劑 Neurobasal培養(yǎng)基、B27無血清添加劑、GlutaMAX-I添加劑、DMEM(high glucose)培養(yǎng)基、滅活胎牛血清、0.25%胰酶、臺盼藍染液均購自Invitrogen公司,多聚-D-賴氨酸、DPBS、Hanks液、抗熒光淬變封片液購自碧云天公司,DNase I、DAPI、Triton X-100購自sigma公司,神經(jīng)元相關(guān)微管蛋白-2(MAP2)、Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)購自abcam公司。

        1.1.3 主要器材 24孔細胞培養(yǎng)板、15mm細胞爬片、超凈工作臺、細胞培養(yǎng)箱、激光共聚焦顯微鏡、手術(shù)解剖顯微鏡

        1.2 方法

        1.2.1 溶液配制 種植培養(yǎng)液:含90%DMEM+10%滅活胎牛血清。維持培養(yǎng)液:98%Neurobasal培養(yǎng)基+2%B27無血清添加劑+0.5mMGlutaMAX-I添加劑。

        1.2.2 細胞爬片及細胞培養(yǎng)孔板處理 將滅菌的15mm細胞爬片用DPBS配制的0.1mg/mL多聚-D-賴氨酸溶液浸泡,室溫孵育2h,吸棄多聚-D-賴氨酸溶液,蒸餾水洗2遍,晾干待用。

        1.2.3 海馬神經(jīng)元的分離 取出生24h內(nèi)SD乳鼠,75%酒精消毒后斷頭,依次剪開皮膚、顱骨,迅速取出腦組織置于冰上含有預冷Hanks液的培養(yǎng)皿中。在手術(shù)顯微鏡下分離出兩側(cè)的海馬區(qū),徹底剝離腦膜及血管。用剪刀剪成約1mm3大小,加入預熱的0.05%胰酶,放入37℃消化15min(每7min稍微搖晃一下)。小心吸走消化過組織,用2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化,加入100μLDNase I,混勻后使用1mL槍頭上下輕柔吹打15下,靜置2min,吸取上清液。再像沉淀的組織團塊中加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基及100μL DNase I,重復上述吹打步驟。吸取上層細胞懸液,如此重復2次。70μm細胞篩過濾,1000r/min離心5min棄上清,使用種植培養(yǎng)基重懸,吸100μL細胞懸液后加入100μL臺盼藍染液,于血球計數(shù)器下計數(shù)細胞,調(diào)整細胞密度至2×105個/mL,每孔加入1mL,十字搖板數(shù)次,放入培養(yǎng)箱內(nèi)。以上操作確保在2h內(nèi)全部完成。4h后使用無血清DMEM培養(yǎng)基洗板鏡檢細胞碎片基本去除后,換成Neurobasal培養(yǎng)基,后每2d半量換液。

        1.2.4 神經(jīng)元細胞鑒定 取體外培養(yǎng)7d的海馬神經(jīng)元細胞爬片,吸出培養(yǎng)基,PBS洗1次,加入1mL預熱多聚甲醛溶液,確保神經(jīng)突不被破壞,室溫孵育10min。PBS洗1次,0.1%Triton X-100通透膜10min。加入10%山羊血清孵育1h后,加入1%血清稀釋的MAP2(1∶500),4℃濕盒孵育過夜。加入1%血清稀釋的Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶1 000),室溫避光孵育1h。DAPI復染5min后,將細胞爬片反轉(zhuǎn)放至滴有抗熒光淬滅封固液的干凈載玻片上。避光干燥后使用透明指甲油密封載玻片邊緣,激光共聚焦顯微鏡觀察。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 細胞形態(tài)的觀察 剛接種細胞分散,呈圓形透亮。4h后細胞已貼壁,部分細胞已伸出短小軸突。1~2d后,細胞明顯增大,突起延伸,形成稀疏網(wǎng)絡。在培養(yǎng)過程中,神經(jīng)元之間的纖維聯(lián)系逐漸豐富,并形成網(wǎng)絡。5~7d神經(jīng)元在倒置顯微鏡下可見具有明顯的光暈,此時神經(jīng)元胞體呈三角形、橢圓形或多邊形,邊界清楚,胞體明亮,立體感增強(圖1、圖2)。

        3 討論與結(jié)論

        神經(jīng)元是腦及脊髓組織中最基本的組成成分,對神經(jīng)系統(tǒng)功能的發(fā)揮著主要的作用,是腦及脊髓損傷中最常用的細胞,其培養(yǎng)和鑒定技術(shù)亦是神經(jīng)生物學研究中最基本的技術(shù)。但是連續(xù)的神經(jīng)元細胞系因無法形成典型的軸突、樹突及突觸而得不到廣泛應用,而原代培養(yǎng)的神經(jīng)元比傳代細胞系更加接近在體狀態(tài),是研究工作中較佳的目的細胞,得到了廣泛應用。

        理論上,原代神經(jīng)元的培養(yǎng)可通過大腦任何部位及脊髓獲取,但海馬部位較其他部位神經(jīng)細胞成分簡單,含量多,擁有典型的細胞表型[3-4]。傳統(tǒng)方法多采用胎鼠進行海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)[5-6],其神經(jīng)分化程度低,便于培養(yǎng),但由于操作復雜,如進行雌雄鼠配種,計算胎齡,實驗時間不可控制,取材時胎鼠表面羊水過多,海馬較小等導致操作要求高。而采用乳鼠較胎鼠具有較多的優(yōu)點,可按照實驗按需處死一至數(shù)只實驗乳鼠,取材較胎鼠簡單,無需擔心缺氧對胎鼠腦神經(jīng)元的損害。

        在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)的過程中,很多因素都會影響原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)的質(zhì)量,如收集細胞過少,接種時死細胞比例過高,雜細胞過多等,其對實驗條件的要求較普通細胞更高。首先,除了消化以外,其他操作均在冰上操作,從解剖至接種細胞控制在2h內(nèi)完成,盡量減少組織細胞代謝。解剖時,在手術(shù)顯微鏡下盡可能去除海馬組織表面所有的血管膜,以免消化后被迫吹打,導致接種時死細胞及雜細胞比例過高。其次,組織在消化前用剪刀剪碎,并使用低濃度0.05%胰酶加適量DNA酶,作用時間控制在15min左右,低濃度胰酶消化能力相對溫和,死細胞較少,從而避免使用木瓜酶現(xiàn)用現(xiàn)配的缺點。DNA酶可分解消化過程死細胞釋放出來的DNA,避免組織纏結(jié),吹打過程可收獲更多單細胞懸液。吹打時,采用分步吹打,慢吸慢吹,動作輕柔,保證每一個單細胞都避免過度吹打,盡可能多地收集細胞。再次,使用含10%滅活胎牛血清重懸、接種細胞,其血清成分可促進細胞生長、增殖,4h后換成含B27添加劑的Neurobasal培養(yǎng)基,換液前輕微震蕩,可將多數(shù)貼壁不牢固的膠質(zhì)細胞及細胞碎片去除。含B27添加劑的Neurobasal培養(yǎng)基其成分確定,培養(yǎng)出的細胞狀態(tài)均一,選擇性促進神經(jīng)細胞生長,而膠質(zhì)細胞幾乎不分裂。最后,接種板也是決定實驗成敗的關(guān)鍵因素,接種板密度過低,神經(jīng)元突觸形成過少,無法利用自身分泌促生長因子,同時膠質(zhì)細胞分裂過多,難以存活和成熟。密度過高,營養(yǎng)相互爭奪,細胞容易抱團生長,均會導致實驗失敗。本實驗膠質(zhì)細胞含量較少,未使用阿糖胞苷抑制膠質(zhì)細胞生長,因阿糖胞苷加入時間及劑量難以控制,毒性較大,除了抑制膠質(zhì)細胞外,對正常海馬神經(jīng)元亦有毒害作用。

        綜上所述,采用低濃度胰酶消化,差速貼壁及無血清培養(yǎng)新生SD乳鼠海馬神經(jīng)元的方法簡單、穩(wěn)定、高效,可得到高密度的符合體外實驗要求的細胞,為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究提供了良好的目的細胞。

        參考文獻

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        [5]Kaech S, Banker G.Culturing hippocampal neurons[J].Nat Protoc.,2006,1(5):2406-2415.

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        (責編:張宏民)

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