于瑩，袁紅梅，程莉莉，趙東升，陳晶，吳建忠，張樹權，吳廣文

（黑龍江省農業(yè)科學院經濟作物研究所，哈爾濱，150086）

亞麻類萌發(fā)素蛋白基因LuGLP1－13的克隆及表達分析

于瑩，袁紅梅，程莉莉，趙東升，陳晶，吳建忠，張樹權，吳廣文*

（黑龍江省農業(yè)科學院經濟作物研究所，哈爾濱，150086）

類萌發(fā)素蛋白（Germin－like proteins，GLPs）是一類防御應答蛋白，在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用。前期研究工作發(fā)現一個類萌發(fā)素蛋白基因（Lus10003267）在亞麻鹽堿脅迫下數字基因表達譜（DGE）數據中顯著上調，推測該基因可能與亞麻鹽堿應答脅迫有關。本研究利用亞麻Lus10003267基因序列和RT－PCR方法克隆了亞麻類萌發(fā)素蛋白基因，命名為LuGLP1－13，其CDS長687bp，編碼228個氨基酸。生物信息學分析表明，該蛋白質分子量為24.3ku，等電點為5. 77，不穩(wěn)定系數為23.64，是一種較穩(wěn)定的酸性蛋白。該蛋白具有信號肽序列，是一種胞外分泌蛋白。多序列比對及進化分析表明，該蛋白具有典型的GLPs家族特征，與蓖麻、毛果楊及胡楊的GLPs家族蛋白親緣關系相對最近。熒光定量PCR結果表明，亞麻LuGLP1－13基因在鹽堿脅迫下被顯著誘導表達（尤其在堿性鹽脅迫下），推測該基因可能參與亞麻應答鹽堿脅迫的過程，這一結果為進一步研究亞麻LuGLP1－13基因的功能和耐鹽堿分子機制提供了理論依據。

亞麻；類萌發(fā)素蛋白；基因克隆；鹽堿脅迫；表達分析

Thompson等于1980年在研究小麥胚芽特定蛋白時首次發(fā)現了萌發(fā)素蛋白（Germin proteins）［1］。隨后，許多與小麥萌發(fā)素蛋白結構相似的蛋白質被發(fā)現，這類蛋白質被命名為類萌發(fā)素蛋白（Germin－like proteins，GLPs）。GLPs是一類由多基因編碼的位于細胞外基質的糖蛋白，通過離子鍵結合為穩(wěn)定的低聚物而存在于細胞外基質中［2－3］。GLPs主要以結構蛋白、受體和酶的形式參與植物體內各種生理生化反應。GLPs能夠清除植物體內過多的活性氧物質（Reactive oxygen species，ROS），反應產生的H2O2可通過信號級聯途徑誘導植物的防御反應，還可通過纖維素交聯作用增強細胞壁結構。

GLPs作為病程相關蛋白（Pathogenesis－related proteins，PRs）家族的成員，與植物應答生物脅迫與非生物脅迫密切相關［4］。GLPs除了具有草酸鹽氧化酶和超氧化物歧化酶等酶類的結構和功能外，還具有受體和結構蛋白的功能。近年來，對植物GLPs功能的研究多集中在擬南芥等模式植物上。目前，亞麻GLPs基因的克隆及功能分析還沒有相關報道。對于GLPs參與植物應答鹽堿脅迫功能的研究主要集中在中性鹽脅迫方面，堿性鹽脅迫方面還沒有相關報道。

前期研究工作中，亞麻（Linum usitatissimum L.）鹽堿脅迫下數字基因表達譜（DGE）測序結果顯示，一個亞麻類萌發(fā)素蛋白基因（Lus10003267）的表達在鹽堿脅迫下顯著上調（尤其是堿性鹽脅迫下），推測該基因可能與亞麻應答鹽堿脅迫相關。本研究利用亞麻類萌發(fā)素蛋白基因序列及RT－PCR方法，克隆了亞麻類萌發(fā)素蛋白基因，并利用生物信息學方法分析了該基因及其編碼蛋白質的結構、亞細胞定位及進化關系等信息，結合熒光定量PCR方法對該基因在不同鹽堿脅迫時間及不同鹽堿脅迫濃度下的表達模式進行了分析，旨在為進一步研究該基因的功能和亞麻應答鹽堿脅迫的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料及鹽堿脅迫處理

亞麻種子黑亞19號由黑龍江省農業(yè)科學院經濟作物研究所提供。黑亞19號是從16份亞麻品種篩選出來的較耐鹽堿的亞麻品種［5］。將亞麻播種于裝有蛭石的花盆中，每隔3 d澆一次1/2 MS營養(yǎng)液，待生長三周后（苗高約10 cm），采用水培方式對亞麻幼苗進行鹽堿脅迫處理。分別采用不同鹽堿脅迫濃度（50 mM、75 mM、100 mM NaCl，5 mM、10 mM、15 mM Na2CO3，30 mM、40 mM、50 mM NaHCO3）處理亞麻材料24 h；分別采用100 mM NaCl、15mM Na2CO3和50 mM NaHCO3分別處理1 h、6 h和24 h。脅迫處理后，全植株取樣，液氮速凍，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

總RNA提取采用北京原平皓生物技術有限公司植物RNA快速提取試劑盒（HF109－02），反轉錄采用東洋紡（上海）生物科技有限公司ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒（FQS－301），熒光定量PCR采用東洋紡（上海）生物科技有限公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒（QPK－201T），PCR擴增采用東洋紡（上海）生物科技有限公司KOD Plus Neo試劑盒（Lot：266600），電泳指示物（DNA Marker）購自寶生物工程（大連）有限公司（TAKARA）。

1.2 方法

1.2.1 亞麻LuGLP1－13基因的克隆

提取亞麻總RNA（具體步驟詳見說明書），用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，紫外分光光度計（Nanodrop）測定其純度和濃度。反轉錄進行第一鏈cDNA的合成（具體步驟詳見說明書），得到的cDNA保存于－20℃冰箱中備用。根據網上公布的亞麻GLP基因（Lus10003267）的序列，利用Primer5.0軟件設計特異引物（表1）。PCR反應體系（20μl）：2μl 10×Buffer（含Mg2＋），1μl上游引物（10μmol/L），1μl下游引物（10μmol/L），2μl dNTP（10 mmol/L），1μl cDNA模板（20 ng/μl），1μl Taq酶（5U），12μl ddH2O。PCR反應程序：94℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃2 min（30個循環(huán)）；72℃10 min。將PCR擴增產物進行測序，引物合成及基因測序工作由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

表1 亞麻LuGLP1－13基因克隆及熒光定量PCR所用引物Tab.1 Primer sequences of flax LuGLP1－13 gene and actin gene

1.2.2 亞麻LuGLP1－13基因序列生物信息學分析

利用在線程序protparam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）對LuGLP1－13蛋白質的理化性質進行分析。利用在線程序SOPMA（http：//npsa－pbil.ibcp.Fr）對LuGLP1－13蛋白質二級結構進行預測。利用在線程序CELLO v.2.5 server（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）對LuGLP1－13蛋白質亞細胞定位進行分析。利用在線程序SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對LuGLP1－13蛋白質進行信號肽預測。利用DNAMAN軟件對亞麻LuGLP1－13蛋白質序列進行多序列比對分析。利用MEGA v5軟件將41個其他植物GLPs蛋白質與亞麻LuGLP1－13蛋白質構建進化樹。

1.2.3 亞麻LuGLP1－13基因表達模式分析

以組成型表達亞麻Actin基因作為內參對照，根據克隆得到的LuGLP1－13基因序列，利用Primer5.0軟件設計亞麻熒光定量PCR引物（表1），由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。先通過普通PCR擴增判斷引物的特異性，擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳。選擇最佳退火溫度，確保沒有引物二聚體產生后，按該退火溫度進行熒光定量PCR擴增。應用ABI7500熒光定量PCR儀，以各取樣點的cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系（20μl）：10μl50×SYBRGreen Mix，0.1μl 50×ROX，1μl cDNA模板（20 ng/μl），2μl dNTP（10 mmol/L），1μl上游引物（10μmol/L），1μl下游引物（10μmol/L），4.9μl ddH2O。反應程序：95℃1min，95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)，于72℃收集熒光，反應結束后分析熒光值變化曲線和融解曲線，得到相應的Ct值。采用以各取樣時間點亞麻Actin基因的量為標準來確定目標基因的相對表達量。每個反應做3個試驗重復和3個技術重復，根據Ct值的大小，采用2－△△CT算法［6］計算表達量；采用SPSS16.0軟件中的單因素方差分析法（One－Way Anova）對表達量進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 亞麻LuGLP1－13基因的克隆

從鹽堿脅迫處理后的亞麻全植株中提取總RNA，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1A），用紫外分光光度計測定280 nm，260 nm和230 nm波長下吸光值，同時計算A260/A280和A260/A230的比值。結果表明，28S rRNA電泳條帶的亮度大于18S rRNA條帶，兩條條帶很清晰的分開，所得到的RNA比較完整?？俁NA濃度為112 ng/μl，A260/A280為1.95，A260/A230為2.05，所提取的RNA基本上沒有雜質的污染，可用于后續(xù)實驗。將提取的RNA進行反轉錄，利用基因特異引物和RT－PCR方法，以cDNA為模板做PCR擴增得到目的基因產物，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1B）。結果表明，克隆得到1個約700 bp的目的條帶，將PCR產物切膠回收并測序。測序結果顯示所得條帶為687 bp，后續(xù)的生物信息學分析表明，此序列編碼GLP蛋白，故命名為LuGLP1－13。

圖1 亞麻總RNA電泳圖及LuGLP1－13基因的PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of total RNA of flax and LuGLP1－13 gene amplification

2.2 亞麻LuGLP1－13基因及編碼蛋白質的生物信息學分析

2.2.1 亞麻LuGLP1－13基因及編碼蛋白質序列分析

將亞麻LuGLP1－13基因的測序結果與網上公布的Lus10003267的序列進行比對，結果表明LuGLP1－13基因與Lus10003267的mRNA序列在編碼區(qū)第600個核苷酸的位置存在1個SNP的差異（T變?yōu)镃），該SNP并沒有導致氨基酸序列的變化。LuGLP1－13基因長度為687 bp，編碼228個氨基酸。理化性質分析結果表明LuGLP1－13蛋白質分子量為24.3 ku，等電點為5.77，不穩(wěn)定系數為23.64，說明它是一種較穩(wěn)定的酸性蛋白質。信號肽預測結果表明LuGLP1－13的N端具有信號肽，可能的剪切位點位于第22和第23個氨基酸殘基之間，亞細胞定位預測結果顯示它定位在細胞外或細胞膜上，推測LuGLP1－13蛋白質是一種胞外分泌蛋白（圖2）。蛋白質二級結構預測表明LuGLP1－13蛋白質中α－螺旋（H）、β－折疊（E）、延伸鏈（T）和無規(guī)則卷曲（C）所占百分比分別為22.37%、30.7%、12.72%和34.21%，屬于混合型蛋白。

圖2 亞麻LuGLP1－13基因的信號肽預測及亞細胞定位分析Fig.2 Signal peptide prediction and subcellular localization of LuGLP1－13 gene in flax

2.2.2 亞麻LuGLP1－13基因的序列比對及進化分析

將亞麻LuGLP1－13蛋白質序列與擬南芥AtGLP1－13（GL113_ARATH）［7］、花生AhGLP1－1（ADD71877）［8］、大麥HvGLP1a（ABG46232）［9］、豌豆PsGLP（CAB65369）［10］、杜鵑RmGLP1（BAG75122）［11］的蛋白質序列進行多重序列比對（圖3）。結果表明，六種植物的GLPs均具有三個高度保守的寡肽，分別命名為Box A、Box B、BoxC。Box A、B、C的保守氨基酸序列分別為QDXCVA－、G－N－PH－HPR－－EX－－XX－G、GXXHFQ－N－G，其中“－”表示任意氨基酸，“X”為疏水氨基酸。Box B和Box C中的三個組氨酸（His，H）和一個谷氨酸（Glu，E）殘基能結合金屬離子，與GLPs的SOD活性密切相關。在N端都具有一個信號肽，用于蛋白定位，因為GLPs屬于胞外分泌蛋白。

圖3 亞麻LuGLP1－13蛋白與其他植物GLPs蛋白的多重序列比對Fig.3 Multiple alignment of amino acid sequence of LuGLP1－13 and other plant GLPs

將亞麻LuGLP1－13蛋白序列與41個植物GLPs蛋白序列構建進化樹（圖4）。這41個GLPs蛋白來自13個不同物種，其中擬南芥的成員有26個。進化樹分析表明LuGLP1－13蛋白與GLP亞家族1的蛋白都聚類到了一個大類中，與亞麻LuGLP1－13蛋白親緣關系最近的蓖麻、毛果楊和胡楊的GLP蛋白，可能是由于亞麻與蓖麻、毛果楊和胡楊都屬于金虎尾目，所以蛋白的序列結構相近。

圖4 亞麻LuGLP1－13蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of LuGLP1－13 and GLPs from other plant species

2.3 亞麻LuGLP1－13基因鹽堿脅迫下的表達模式分析

利用熒光定量PCR方法對亞麻LuGLP1－13基因在不同鹽堿脅迫種類不同鹽堿脅迫時間下的表達模式進行了研究（圖5）。結果表明，亞麻LuGLP1－13基因在100 mM NaCl脅迫下呈現先升高后降低的趨勢，6 h表達量最高，表達量大約是對照的100倍，1 h和6 h的表達量與對照相比差異極顯著（圖5A）。在15 mM Na2CO3和50 mM NaHCO3脅迫下該基因的表達隨脅迫時間的延長而增加，24 h的表達量分別是對照的1500倍及6000倍。其中15mM Na2CO3脅迫6h和24 h的表達量與對照相比差異極顯著；50mM NaHCO3脅迫6h的表達量與對照相比差異顯著，脅迫24 h的表達量與對照相比差異極顯著（圖5B－C）。

圖5 不同鹽堿脅迫時間下亞麻LuGLP1－13基因的表達模式分析Fig.5 Expression levels of LuGLP1－13 gene under different saline－alkaline stress time

利用熒光定量PCR方法對亞麻LuGLP1－13基因在不同鹽堿脅迫種類不同鹽堿脅迫濃度下的表達模式進行了研究（圖6）。結果表明，亞麻LuGLP1－13基因在不同濃度NaCl脅迫下呈現先升高后降低的趨勢，在50 mM時表達量最高，表達量大約是對照的25倍，50 mM與75 mM時的表達量與對照相比差異極顯著（圖6A）。在不同濃度Na2CO3和NaHCO3脅迫下該基因的表達隨脅迫濃度的增高而增加，最高表達量分別是對照的1500倍及6000倍，其中10 mM Na2CO3脅迫時的表達量與對照相比差異顯著，15 mM Na2CO3脅迫時的表達量與對照相比差異極顯著；40 mM NaHCO3和50 mM NaHCO3脅迫時的表達量與對照相比差異極顯著（圖6B－C）。亞麻LuGLP1－13基因在鹽堿脅迫下的表達模式分析表明，該基因受到鹽堿脅迫的誘導表達，尤其是堿性鹽脅迫，其可能參與了亞麻應答鹽堿脅迫的過程。

圖6 不同鹽堿脅迫濃度下亞麻LuGLP1－13基因的表達模式分析Fig.6 Expression levels of LuGLP1－13 gene under different saline－alkaline stress concentrate

3 討論

GLPs屬于cupins蛋白家族，幾乎存在于所有植物中，而且家族成員眾多，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）有32個成員，水稻（Oryza sativa）有42個成員，大麥（Hordeum vulgare）有21個成員［9］。雖然GLPs家族成員的蛋白質序列相似度不高，但都具有共同的結構特征，如Box A、Box B和Box C三個高度保守的結構區(qū)，其中的三個組氨酸構成了萌發(fā)素蛋白的酶活性位點，可用來結合金屬離子，成熟的GLPs在N端都有一個能幫助蛋白質分泌到細胞外的信號肽［2，12］。本研究通過RTPCR技術獲得了一個亞麻的類萌發(fā)素蛋白基因LuGLP1－13，生物信息學分析發(fā)現該基因所編碼的蛋白在N末端具有一段信號肽序列，還具有Box A、Box B和Box C三個高度保守的結構區(qū)和三個組氨酸殘基，初步推斷LuGLP1－13基因是典型的植物GLPs蛋白家族基因。系統(tǒng)進化分析表明該蛋白與蓖麻、毛果楊和胡楊等類萌發(fā)素蛋白屬于相同的進化分支。

類萌發(fā)素蛋白作為一種植物防御應答蛋白，在植物抗病過程中起重要作用。因此，對植物GLPs功能的研究大多集中在抗病方面。近年來的研究表明，GLPs也是一類參與植物對逆境脅迫響應的重要基因，可受多種非生物脅迫的誘導。Komatsu等研究發(fā)現，大豆在淹水脅迫時，四個大豆GLPs前體表達下調［13］。Pinheiro等研究發(fā)現，白羽扇豆在連續(xù)干旱13 d后一個GLP（gi1171937）表達量開始積累［14］。Membré等研究發(fā)現，三個擬南芥GLPs基因（AtGER1、AtGER2、AtGER3）分別在煙草中異源表達后都增強了轉基因煙草對高溫脅迫的抗性［15］。Lu等研究發(fā)現，過表達GmGER9的轉基因煙草與對照相比具有較高的耐鹽能力［16］。本研究的熒光定量PCR結果顯示，亞麻LuGLP1－13基因的表達受到鹽堿脅迫的誘導。在中性鹽NaCl脅迫下，呈先升高后降低的趨勢。在堿性鹽Na2CO3和NaHCO3脅迫下呈上調表達的趨勢，而且表達量明顯高于NaCl脅迫，說明該基因在亞麻應答鹽堿脅迫過程中發(fā)揮重要作用，尤其是堿性鹽脅迫下。不同鹽堿脅迫時間的研究結果表明，LuGLP1－13基因一般在鹽堿脅迫后6 h時表達量迅速增加，說明該基因的表達不是亞麻對鹽堿脅迫瞬間的應激反應。不同鹽堿脅迫濃度的研究結果表明，在低濃度時LuGLP1－13基因的表達量隨濃度的增加而增大（如Na2CO3和NaHCO3脅迫），高濃度時隨濃度的增加而減少（如NaCl脅迫），說明該基因的表達在一定的鹽堿脅迫濃度下達到一個相對平衡，平衡破壞后表達量會下降。推測該基因參與亞麻應答鹽堿脅迫的途徑是鹽堿脅迫在脅迫初期會形成離子脅迫和滲透脅迫，同時植物體內會積累大量ROS，脅迫后期引起氧化脅迫（蛋白質的氧化和脂質的過氧化）。鹽堿脅迫初期，LuGLP1－13基因的表達量會增加，主要通過SOD、OXO、AGPPase等抗氧化系統(tǒng)幫助亞麻進行體內解毒，清除ROS，從而緩解脅迫帶來的損傷。但當脅迫到達一定濃度和時間后，LuGLP1－13基因的表達量會下降，因為亞麻體內的平衡遭到嚴重破壞，已經不能通過大量表達該基因進行損傷的修復，同時大量表達可能會給植物帶來更大的負擔，所以后期表達量會下降。因此，GLPs可能在植物應答鹽堿脅迫的過程中扮演著重要的角色，但這還需要我們提供更多的實驗數據加以證明。對亞麻LuGLP1－13基因今后可以在以下幾方面展開深入研究：（1）利用轉基因技術及RNA干擾技術對亞麻LuGLP1－13基因功能進行進一步驗證；（2）結合酵母雙雜交系統(tǒng)或GST－pulldown技術，對LuGLP1－13基因參與亞麻鹽堿脅迫應答調控網絡中的上下游元件進行篩查，從而確定亞麻LuGLP1－13基因在調控通路中的作用；（3）對亞麻GLP基因家族其他成員進行研究，分析各成員在亞麻應答鹽堿脅迫過程中的作用。

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Cloning and Expression Analysis of LuGLP1－13 Gene of Flax

Yu Ying，Yuan Hongmei，Cheng Lili，Zhao Dongsheng，Chen Jing，Wu Jianzhong，Zhang Shuquan，Wu Guangwen
（Institute of Industrial Crops，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China）

Germin－like proteins（GLPs）is a kind of defense response gene，which plays an important role in the process of plant disease resistance.In the previous study，a GLPs gene（Lus10003267）was significantly up－regulated under saline－alkaline stress by digital gene expression in flax，suggesting that this genemay be participated in saline－alkaline stress response.In this study，the Lus10003267 gene was cloned by RT－PCR and named as LuGLP1－13.The CDS of this gene was 687bp，encoding 228 amino acids.Bioinformatics analysis showed that themolecular weight of the protein was 24.3ku，the isoelectric point was 5.77，and the unstable coefficient was 23.64，which was a relatively stable acidic protein.LuGLP1－13 has a signal peptide sequence，which is a kind of extracellular proteins.Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis showed that the protein has a typical GLPs family characteristic，and it had the closest relationship with Ricinus communis，Populus trichocarpa and Populus euphratica GLPs.The results of qRT－PCR showed that the LuGLP1－13 gene wassignificantly induced under saline－alkaline stress（especially the alkaline salt stress），suggesting that this genemay be involved in the response process to saline－alkaline stress.This study provided theoretical basis for further study on the function of LuGLP1－13 gene and themolecularmechanism of salinealkaline tolerance in flax.

flax；germin－like proteins；gene cloning；saline－alkaline stress；expression analysis

S563.2

：A

1671－3532（2017）01－0012－07

2016－09－07

黑龍江省農業(yè)科學院博士科研啟動金（201507－41）；國家麻類產業(yè)技術體系（CARS－19－S03）

于瑩（1981－），助理研究員，博士，主要從事亞麻分子育種研究。E－mail：yuying_1981_0451＠163.com

*

：吳廣文（1964－），研究員，主要從事亞麻遺傳育種研究。E－mail：wuguangwenflax＠163.com