李 凡，阿 繼，嚴(yán) 州，陳天祥，張 斌，湯 承*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省若爾蓋縣農(nóng)業(yè)畜牧和水務(wù)局，四川 若爾蓋 624500）

一起犢牦牛腹瀉病的病原學(xué)診斷

李 凡1，阿 繼2，嚴(yán) 州2，陳天祥2，張 斌1，湯 承1*

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省若爾蓋縣農(nóng)業(yè)畜牧和水務(wù)局，四川 若爾蓋 624500）

四川省若爾蓋縣某養(yǎng)殖戶的犢牦牛出現(xiàn)以腹瀉為主要特征的疾病，傳播迅速，發(fā)病率為100%，為弄清病因，我們采集了6份腹瀉樣本，分別用Trizol法和酚氯仿法提取腹瀉糞便的總RNA和DNA，再用牦牛輪狀病毒（RV）、牛冠狀病毒（BcoV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、沙門氏菌（Salmonella）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）特異的PCR方法進(jìn)行病原檢測(cè)，結(jié)果得出這5種病原的檢出數(shù)分別為6、0、6、0、5，可見該地區(qū)犢牦牛腹瀉主要由RV、BVDV和ETEC混合感染引起。

牦牛腹瀉；病原；牦牛輪狀病毒；牛病毒性腹瀉病毒

犢牦牛腹瀉是指新生犢牦牛所發(fā)生的一種以腹瀉為主要癥狀的消化道疾病，該病一年四季均可發(fā)生，尤其以初春及夏末秋初氣候多變季節(jié)多發(fā)，病犢牛以精神沉郁，體溫升高，腹脹、腹痛，廢食，呼吸短促，糞便惡臭，間或混有血絲氣泡，急性大量水瀉，脫水，自體中毒及心力衰竭為主要臨床特征，是造成犢牛死亡、生長(zhǎng)發(fā)育不良最嚴(yán)重的疾病之一，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

當(dāng)前引起犢牛腹瀉的原因極其復(fù)雜，包括感染性因素（病毒、細(xì)菌和寄生蟲）和非感染性因素（營(yíng)養(yǎng)因素和環(huán)境因素）[2-3]。其中，病原微生物感染是造成犢牛腹瀉的重要原因,常見的引起犢牛腹瀉的病原主要有RV、BcoV、BVDV、Salmonella以及ETEC等[4-5]，其臨床癥狀及病理剖檢很相似，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。本試驗(yàn)對(duì)2016年采自若爾蓋縣某牦牛養(yǎng)殖戶的6份腹瀉樣本進(jìn)行了RV、BCoV、BVDV、Salmonella和ETEC的PCR檢測(cè)，以確診到底是何種病原引起的腹瀉，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 被檢樣本及試劑 6份無(wú)菌采集的犢牦牛腹瀉糞便樣本，2016年8月采于若爾蓋縣某養(yǎng)殖戶的3月齡發(fā)病犢牦牛，臨床表現(xiàn)為腹瀉，排出灰白色、深綠色糞便和血便，脫水。

試劑：2×Taq PCR Master Mix（擎科公司），DNA Marker II、Marker DL2000（北京天根公司），RNAiso Plus、PrimeScriptTM等均購(gòu)自寶生物工程（大連）股份有限公司；DEPC試劑購(gòu)自Sigema生物公司。

1.2 參考毒株 牦牛RV分離株、BCoV陽(yáng)性樣本、BVDV分離株、沙門氏菌分離株及ETEC分離株均為西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物 牦牛RV、BVDV和Ecoli.K99的檢測(cè)引物均參照文獻(xiàn)，由大連寶生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

表1 RT-PCR引物信息

1.4 方法

1.4.1 被檢樣本處理與核酸提取 將6份腹瀉樣本用0.1mol/L PBS緩沖液按1∶3（m/v）比例稀釋，渦旋混勻，-80℃冰箱中反復(fù)凍融3次，以12000r/min離心15min，取上清，然后按照Trizol Reagent說(shuō)明書提取總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。反應(yīng)體系為：5×buffer 4μL，Random primer 2μL，PrimeScript RTase 1 μL，ddH2O 9 μL；反轉(zhuǎn)錄條件為：37℃ 15 min，85℃ 15 s，16℃ 1min，-20℃保存?zhèn)溆?。DNA的提取采用酚氯仿法。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 用 RV、BCoV、BVDV、Salmonella和ETEC的引物對(duì)67份樣本的cDNA和DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：cDNA 2.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5μL，總體積共25μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃5min，95℃ 30s，52℃ 45s，72℃ 45s，72℃ 10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL在2%瓊脂糖凝膠板上點(diǎn)樣，100V電壓下電泳40min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。將RV、BCoV、BVDV、Salmonella和ETEC檢測(cè)呈陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 被檢樣本的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 電泳結(jié)果顯示：在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳中分別擴(kuò)增出約231bp、230 bp、498 bp的條帶，分別為牦牛RV、BVDV和Ecoli.K99的特異條帶，BCoV與Salmonella僅有陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出條帶，結(jié)果見圖1～圖5。將擴(kuò)增出的陽(yáng)性產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示：牦牛RV與NCBI上所登錄序列的同源性為100%，BVDV同源性為90.6%，Ecoli.同源性為98%。

圖1 牦牛RV擴(kuò)增結(jié)果

圖2 牦牛BCoV擴(kuò)增結(jié)果

圖3 牦牛BVDV擴(kuò)增結(jié)果

圖4 牦牛Salmonella擴(kuò)增結(jié)果

圖5 牦牛ETEC擴(kuò)增結(jié)果

2.2 陽(yáng)性檢出率及混合感染情況 6份臨床腹瀉樣本中，牦牛RV的陽(yáng)性檢出率為100%（6/6），BCoV的陽(yáng)性檢出率為 0，BVDV的陽(yáng)性檢出率為 100%（6/6），Salmonella的陽(yáng)性檢出率為0，ETEC的陽(yáng)性檢出率為83.3%（5/6）?；旌细腥韭蕿?3.3%。

3 小結(jié)與討論

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果結(jié)合臨床癥狀分析，本次若爾蓋縣養(yǎng)殖戶的犢牦牛腹瀉病呈混合感染，主要是由牦牛RV、BVDV和ETEC混合感染所致。

2016年周芳等[6]在青藏高原地區(qū)進(jìn)行了BRV病原流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)BRV在云南、青海、四川和西藏的腹瀉樣本的感染率分別為90%、95%、85.19%和60%，證明BRV是引起牦牛腹瀉的重要病原。2016年陳新諾等[11]對(duì)青藏高原地區(qū)四個(gè)省的牦牛腹瀉樣本進(jìn)行了BVDV病原流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)BVDV感染在青藏高原地區(qū)的牦牛中普遍存在。達(dá)娃次仁等[12]從西藏地區(qū)的240份牦牛腹瀉病料中分離到200株牦牛源大腸桿菌。郝一妹等[13]對(duì)26份牦牛腹瀉糞便樣本和部分健康糞便樣本進(jìn)行產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）的分離和檢測(cè)，結(jié)果表明產(chǎn)腸毒素大腸桿菌在牦牛腹瀉樣本中的檢出率顯著高于外表健康的牦牛，說(shuō)明產(chǎn)腸毒素大腸桿菌在牦牛糞便中廣泛存在。

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Pathogen Diagnosis of a Case of Yak Diarrhea

Li Fan1，A Ji2，Yan Zhou2，et al.
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041；2.Agriculture and Animal Husbandry and Water Authority of Ruoergai County，Sichuan Ruoergai 624500，China）

There were some prominent feature of the diseases with diarrhea in yak of some farmers at Ruoergai area，Sichuan province，which spreaded rapidly and its incidence rate was 100%.In order to find out the causes，6 diarrhea samples were collected，Trizol regent kit and phenol-chloroform extraction methods were used to extract total RNA and DNA of diarrhea feces，then yak rotavirus（RV），bovine coronavirus（BcoV），bovine viral diarrhea virus（BVDV），Salmonella，enterotoxigenic escherichiacoli（ETEC）were detected by specific PCR methods.The results showed that the amount of the five kinds of pathogens were 6，0，6，0，5，which meaned that yak diarrhea was mainly caused by mixed infection of yak RV，BVDV and ETEC.

Yak diarrhea；Pathogen；Yak rotavirus；Bovine viral diarrhea virus

S858.234.43

：B

：1001-8964（2017）02-0029-03

2016-11-29

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0500907）

李凡（1992-），女（壯族），云南文山人，研究生，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)研究。

*

：湯承，博士，教授。