沈思思，湯 承，岳 華

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

四川某豬場(chǎng)仔豬腹瀉病的病原學(xué)診斷

沈思思，湯 承，岳 華*

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

四川省雙流區(qū)某商品豬場(chǎng)的5～10日齡仔豬暴發(fā)腹瀉，且傳播迅速，為查明病因，我們采集腹瀉仔豬肛拭子15份，用RT-PCR分別檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬A群輪狀病毒（GARV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬Delta冠狀病毒（PDCoV）。結(jié)果顯示：樣本的總陽性率為14/15，其中PEDV、GARV的陽性數(shù)分別為11、8，雙陽性數(shù)為5，而TGEV和PDCoV未檢出，說明該豬場(chǎng)仔豬腹瀉由PEDV及GARV感染引起，且PEDV和GARV混合感染的情況較為嚴(yán)重。

豬流行性腹瀉病毒；豬A群輪狀病毒；混合感染

仔豬腹瀉是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)條件下引起仔豬死亡的重要原因，致死率高，哺乳仔豬可達(dá)到100%[1]。主要的臨床癥狀有精神萎靡、食欲不振、嘔吐、腹瀉、脫水等。引起仔豬腹瀉的因素很多，其中豬流行性腹瀉病毒（PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬冠狀病毒（PDCoV）和豬A群輪狀病毒（GARV）是4種常見病原[2-3]。四川雙流區(qū)某商品豬場(chǎng)有150頭5～10日齡仔豬于2015年10月暴發(fā)腹瀉，臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉并排出灰綠色水樣稀糞，就診時(shí)該豬場(chǎng)發(fā)病率為50%，死亡率為20%。本研究采用RT-PCR法分別對(duì)上述4種常見病原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料

1.1 被檢樣本及試劑 腹瀉仔豬肛門拭子15份；2× Taq PCR Master Mix購(gòu)自擎科公司，DNA Marker II購(gòu)自北京天根公司，RNAiso Plus、PrimeScriptTM等均購(gòu)自寶生物工程（大連）股份有限公司，DEPC試劑購(gòu)自Sigema公司。

1.2 參考毒株 TGEV、GARV、PEDV、PDCoV的cDNA均為西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物 PEDV、TGEV、PDCoV和GARV的引物序列由大連寶生物工程有限公司合成[4-5]，引物信息見表1。

表1 RT-PCR引物信息

2 方法

2.1 被檢樣本的處理 將15份腹瀉樣本（肛門拭子）用0.1mol/L PBS緩沖液稀釋（按一個(gè)棉拭子加2mL PBS液的比例），渦旋混勻，12000r/min離心15min，取上清備用。

2.2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

2.2.1 總RNA的提取 參考RNAiso Plus RNA提取說明書提取被檢樣本上清總RNA，沉淀用10μL DEPC水溶解。

2.2.2 cDNA的合成 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄采用20μL體系：5× buffer 4 μL，Random primer 2 μL，PrimeScript RTase 1μL，ddH2O 9μL，總RNA 4μL。反轉(zhuǎn)錄條件：37℃15min，85℃ 15s，16℃ 1min。

2.3 PCR擴(kuò)增 用PEDV、GARV、TGEV、PDCoV的引物分別對(duì)15份被檢樣本的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以相應(yīng)病原cDNA為陽性對(duì)照，無模板為陰性對(duì)照。反應(yīng)體系為：cDNA 2.0μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL，總體積共25μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5min、95℃30s、55℃ 30s、72℃ 40s，共30次循環(huán)，72℃ 10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL在1.5%瓊脂糖凝膠板上點(diǎn)樣，100V電壓下電泳40min，凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。隨機(jī)抽取PEDV、GARV、TGEV、PDCoV檢測(cè)陽性的PCR產(chǎn)物各2個(gè)送生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

3 結(jié)果

15份被檢樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1～圖4。

由圖可知，從11份被檢樣本中擴(kuò)增出PEDV約680bp的條帶，從8份樣本中擴(kuò)增出GARV約270 bp的條帶。測(cè)序結(jié)果顯示：序列是PEDV與GARV的特異序列，PEDV與Bank上所登錄序列AF353511的同源性為99%，GARV與Bank上所登錄序列JN104614的同源性為93%；PEDV和GARV雙陽性樣本數(shù)為5，混合感染率為33.3%；TGEV和PD CoV未檢出。因此，確診該豬場(chǎng)仔豬腹瀉由PEDV及GARV感染所致，且PEDV和GARV混合感染情況較為嚴(yán)重。

圖1 PEDV檢測(cè)結(jié)果

圖2 GARV檢測(cè)結(jié)果

圖3 TGEV檢測(cè)結(jié)果

圖4 PDCoV檢測(cè)結(jié)果

4 討論

曹恭貌等[6]對(duì)四川省9個(gè)地區(qū)的220份樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：PEDV的檢出率為41.54%，GARV的檢出率為7.69%；胡興義等[7]對(duì)貴州省5個(gè)地區(qū)的203份樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：PEDV的檢出率為63.54%，GARV的檢出率為7.88%；劉云波等[8]對(duì)1 282份樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：PEDV的檢出率為24.49%，GARV的檢出率為3.20%。GARV是導(dǎo)致仔豬腹瀉的重要病原。王璐等[8]從121個(gè)豬場(chǎng)的531份病料中檢出GARV陽性率為7.34%；王振玲等[9]從北京地區(qū)248份糞便樣本中檢出GARV的陽性率為17.7%。本研究RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：四川某豬場(chǎng)的仔豬腹瀉是由PEDV和GARV感染引起的，PEDV的檢出率為73.3%，GARV的檢出率為53.3%，兩者的混合感染率為33.3%。綜上可以看出，PEDV是引起腹瀉的主要原因，且輪狀病毒檢出率顯著增高。TGEV和PDCoV也是引起仔豬腹瀉的主要原因，但本研究中沒有檢出?？傊?，仔豬腹瀉病因繁多，建議使用多重PCR對(duì)腹瀉病原進(jìn)行檢測(cè)確診，然后對(duì)癥治療。

[1]常洪濤，杜季梅，陳陸，等.新生仔豬急性腹瀉疫情中5種病毒感染的分子檢測(cè)[J].飼料工業(yè)，2013（11）：61-64.

[2] Li Z L，Zhu L，Ma J Y，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）field strains in south China[J].Virus Genes，2012，45（1）：181-185.

[3] Zhu J，Yang Q，Cao L，et al.Development of porcine rotavirus vp6 protein based ELISA for differentiation of this virus and other viruses[J].Virology Journal，2013，10（1）：1-8.

[4]任玉鵬，陳弟詩(shī)，蘇生禹，等.三種豬腹瀉病毒性病原多重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（10）：1047-1051.

[5]任玉鵬，張斌，湯承，等.同時(shí)檢測(cè)PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（6）：756-762.

[6]曹恭貌，張斌，岳華，等.四川部分豬場(chǎng)PEDV、TGEV、GARV和PKV感染狀況調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37（1）：118-122.

[7]胡興義，張雙翔，金志強(qiáng)，等.貴州地區(qū)仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38（7）：542-545.

[8]劉云波，趙洪翠，王志成，等.豬病毒性腹瀉分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013，40（2）：204-207.

Pathogen Diagnosis of Piglet Diarrhea in a Pig Farm in Sichuan Province

Shen Sisi，Tang Cheng，Yue Hua*
（College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041，China）

There were many piglets of 5～10 days-old occuring diarrhea in a commercial pig farms in Shuangliu，Sichuan，and it spreaded rapidly.In order to find out the causes，15 diarrhea anal swab samples were collected，and pig epidemic diarrhea virus（PEDV），rotavirus（GARV），infectious gastroenteritis virus（TGEV），pig Delta coronavirus（PDCoV）were detected by RT-PCR methods.The results showed that the total positive rate of samples was 14/15，the positive number of PEDV and GARV were 11 and 8，double positive number was 5，TGEV and PDCoV were not checked out，which meaned that piglet diarrhea was mainly caused by mixed infection of PEDV and GARV，and it was very serious.

Porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）；Group A rotavirus（GARV）；Mixed infection

S858.284.43

：B

：1001-8964（2017）02-0034-03

2016-11-28

沈思思（1991-），女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物病原分子生物學(xué)研究。

*

：岳華，博士，教授。