李 培,闕青敏,王 芳,李俊成,朱 芹,廖柏勇 ,陳曉陽(yáng)*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642；2.嘉應(yīng)學(xué)院, 廣東 梅州 514015)

紅椿SRAP反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

李 培1,闕青敏1,王 芳1,李俊成1,朱 芹2,廖柏勇1,陳曉陽(yáng)1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642；2.嘉應(yīng)學(xué)院, 廣東 梅州 514015)

[目的]優(yōu)化相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)體系內(nèi)的不同組分，建立適用于紅椿SRAP分子標(biāo)記的反應(yīng)體系，并進(jìn)一步從SRAP引物組合中篩選出穩(wěn)定、多態(tài)性好的引物組合，為紅椿遺傳多樣性研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。[方法]針對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)體系中5個(gè)因素各設(shè)置8個(gè)水平，先利用單因素試驗(yàn)確定濃度梯度，后在確定的梯度范圍內(nèi)選定4個(gè)水平，按照正交試驗(yàn)L16(45)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合正交直觀分析法和新復(fù)極差法對(duì)各因素進(jìn)行優(yōu)化篩選。[結(jié)果]確定最優(yōu)體系為總體系25 μL，模板DNA 25 ng，上下游引物各0.3 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+2.5 mmol·L-1，dNTP 0.3 mmol·L-1。利用穩(wěn)定的SRAP-PCR體系，從1 505對(duì)SRAP引物組合中篩選出30對(duì)優(yōu)質(zhì)引物組合。[結(jié)論]通過(guò)不同種源紅椿基因組DNA的重復(fù)驗(yàn)證，獲得了穩(wěn)定清晰、多態(tài)性較強(qiáng)的擴(kuò)增條帶，表明所確定的最優(yōu)體系穩(wěn)定可靠，適用性較強(qiáng)，可用于不同種源紅椿遺傳多樣性研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

紅椿；SRAP分子標(biāo)記；反應(yīng)體系；引物篩選

Optimization and Primers Selection of SRAP-PCR System in

在林木遺傳育種研究中，分子標(biāo)記是使用最廣泛的一種遺傳標(biāo)記類型，因其不受發(fā)育時(shí)期及環(huán)境或季節(jié)性的制約，被廣泛地被運(yùn)用于遺傳多樣性、分子遺傳育種等研究中[1-2]。SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)即相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性是一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，其基礎(chǔ)來(lái)源于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過(guò)對(duì)基因的開放閱讀框(ORFs)中相對(duì)保守的外顯子區(qū)域及變異豐富的內(nèi)含子及啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，獲得物種或個(gè)體之間的遺傳差異與分化[3-4]。該分子標(biāo)記采用的是雙引物設(shè)計(jì)，因其簡(jiǎn)便、高效、產(chǎn)率高等特點(diǎn)，使該標(biāo)記成功地應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建等分子研究方面的分析[5-8]。

紅椿(ToonaciliataRoem)，又名紅楝子，是楝科(Meliaceae)香椿屬(Toona)速生植物。該樹種材質(zhì)優(yōu)良，紋理優(yōu)美，由于其木材呈現(xiàn)紅色，堅(jiān)韌耐腐，常作為高檔家具用材出口國(guó)際，開發(fā)潛力巨大，被譽(yù)為“中國(guó)桃花心木”[9-10]。由于環(huán)境的變化、天然更新能力較差、過(guò)度的人為破壞及需求量的不斷增加，紅椿數(shù)量在持續(xù)減少，已成為珍貴的瀕危樹種，被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。紅椿在印度、老撾、緬甸、泰國(guó)、巴基斯坦至澳大利亞?wèn)|海岸也有天然分布[11]，并在世界多地進(jìn)行引種[12]。在我國(guó)集中分布在華南、華中、華東及西南地區(qū)，呈零星或散點(diǎn)分布[13]。一個(gè)物種生存或者適應(yīng)環(huán)境，獲得發(fā)展和進(jìn)化的依靠前提是其自身所具有的遺傳多樣性[14]。研究紅椿的遺傳多樣性對(duì)其選擇育種、遺傳資源的保護(hù)具有重要的理論和實(shí)踐意義。

本研究采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)SRAP-PCR體系中的5大因素，包括模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+及dNTP進(jìn)行優(yōu)化，旨在確定最優(yōu)的穩(wěn)定反應(yīng)體系，并從隨機(jī)引物組合中篩選出能夠擴(kuò)增穩(wěn)定、清晰且含有多態(tài)性條帶的最優(yōu)引物組合，為進(jìn)一步開展紅椿遺傳多樣性研究、種質(zhì)資源鑒定及遺傳育種奠定基礎(chǔ)，提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以不同種源紅椿母樹葉片作為試材，于采集地收集并利用硅膠迅速干燥，置于實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱用于后續(xù)DNA提取。用于引物篩選的種源包括云南永仁、貴州望謨、四川會(huì)東、廣東樂(lè)昌、江西宜豐、安徽黃山、福建南平及湖南城步。種源信息見表1。

表1 紅椿SRAP-PCR 體系優(yōu)化試驗(yàn)材料Table 1 Experimental material of T. ciliata for optimizing SRAP-PCR system

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅椿基因組DNA的提取 取100 mg干燥葉片做樣品，首先利用CTAB free 溶液(0.2 mmol·L-1Tris-HCl，0.25 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1EDTA，pH=8.0)對(duì)樣品進(jìn)行低溫洗滌，去除雜質(zhì)[15-16]。后采用EZNA?High-Performance DNA Mini Ki 試劑盒提取紅椿基因組DNA。使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳及超微量紫外分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop 1000)進(jìn)行檢測(cè)。稀釋至50 ng·μL-1，樣品置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)單因素濃度梯度確定 首先對(duì)反應(yīng)體系的5大因素，即，模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+及dNTP進(jìn)行單因素試驗(yàn)。每個(gè)影響因素分別設(shè)置8個(gè)梯度。模板DNA濃度包括0、25 、50、60、70、80、90和100 ng；引物濃度包括0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μmol·L-1；TaqDNA聚合酶包括0、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75和2 U；Mg2+濃度包括0、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 mmol·L-1；dNTP濃度梯度包括0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35和0.4 mmol·L-1。

1.2.3 反應(yīng)體系正交試驗(yàn) 進(jìn)行單因素試驗(yàn)確定5大因素濃度范圍后，在其范圍內(nèi)選定4個(gè)水平濃度梯度(表2)，采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表3)，共16個(gè)處理，每個(gè)處理選用不同種源DNA進(jìn)行2次重復(fù)。根據(jù)所擴(kuò)增出的電泳條帶的多少、清晰度及背景顏色，對(duì)16個(gè)處理進(jìn)行評(píng)分[17-18]。最優(yōu)的得16分，最差的得1分，兩次重復(fù)取平均分為該處理水平擴(kuò)增結(jié)果的最終得分。后計(jì)算每個(gè)因素在不同水平下的平均得分，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后獲得極差。在某水平下某因素所參與的擴(kuò)增反應(yīng)所得到的擴(kuò)增結(jié)果評(píng)分的總和用K值表示；R表示為極差，即，某試驗(yàn)因素在不同處理水平下所得到評(píng)分的最大平均值與最小平均值之差[19]。紅椿SRAP分子標(biāo)記反應(yīng)總體系選用為25 μL(均含有2.5 μL 10×Buffer，用重蒸水補(bǔ)齊體系)，引物選用M22(TGA GTA CAA ACC GG GTC)E27(GAC TGC GTA CGA ATT CCA)。

表2 正交試驗(yàn)各因子水平設(shè)計(jì)Table 2 The design of factors and the levels for orthogonal experimental

表3 SRAP-PCR 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[L16(45)]Table 3 L16(45)orthogonal experimental of SRAP-PCR

1.2.4 SRAP-PCR 擴(kuò)增 SRAP分子標(biāo)記反應(yīng)程序選用為94℃ 5 min；5個(gè)循環(huán)(94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min)；35個(gè)循環(huán)(94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min)；72℃延伸10 min；4℃保存。產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，自動(dòng)凝膠成像儀上照相保存，用于體系優(yōu)化因素確定。

1.2.5 引物篩選 在確定最優(yōu)穩(wěn)定體系后，根據(jù)SRAP分子標(biāo)記引物組合通用性的特點(diǎn)，查找其在各物種研究中所發(fā)表的引物序列[20-26]，包括43個(gè)正向引物與35個(gè)反向引物，隨機(jī)組合，共計(jì)1 505對(duì)引物組合對(duì)8份來(lái)源不同，地理距離差別較大的紅椿基因組DNA進(jìn)行引物篩選。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離并通過(guò)銀染染色檢測(cè)。保鮮膜封膠，照相或制干膠保存。

采用遺傳多樣性信息含量(PIC)評(píng)價(jià)試驗(yàn)所選定引物組合評(píng)估能力。

PICi= 2fi(1 -fi)

式中，PICi為標(biāo)記i的遺傳多樣性信息含量，fi為標(biāo)記i出現(xiàn)條帶的頻率， 1-fi是缺失條帶的頻率，一對(duì)引物的PIC為各個(gè)條帶的平均值[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 檢測(cè)

注：M: DL2000 markerNote: M: DL2000 marker圖1 紅椿DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose electrophresis of genomic DNA from T. ciliata

2.2 單因素試驗(yàn)分析

注：圖中A、B、C、D、E分別表示模板濃度(116 DNA含量分別為0、25 、50、60、70、80、90和100 ng)、引物濃度(116 引物濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μmol·L-1)、Taq DNA 酶濃度(116 Taq酶含量分別為0、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75和2 U)、Mg2+濃度(116 Mg2+濃度分別為0、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 mmo·L-1)及dNTP濃度(116 dNTP濃度分別為0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35和0.4 mmol·L-1)，每個(gè)梯度兩個(gè)不同DNA模板重復(fù)。Note: A, B, C, D, E is DNA concentration (116 is 0、25 、50、60、70、80、90 and 100ng, respectively. Repeated twice), primer concentration (116 is 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 and 0.7μmol/L, respectively. Repeated twice), Taq polymerase (116 is 0、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75 and 2 U, respectively. Repeated twice), Mg2+ concentration (116 is 0、1、1.5、2、2.5、3、3.5 and 4 mmol/L, respectively. Repeated twice), dNTP concentration respectively (116 is 0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 and 0.4 mmol/L, respectively. Repeated twice).圖2 因素濃度對(duì)SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響Fig. 2 The effect of factors concentration on SRAP analysis

2.3 正交試驗(yàn)各因素確定

在單因素試驗(yàn)所確定的5大因素的濃度范圍內(nèi)，選定4個(gè)水平的濃度梯度，根據(jù)L16(45)正交設(shè)計(jì)對(duì)SRAP-PCR進(jìn)行體系優(yōu)化。根據(jù)電泳結(jié)果首先進(jìn)行直接主觀性觀察(圖3)。按照擴(kuò)增條帶的質(zhì)量，包括擴(kuò)增清晰度、條帶亮度及條帶數(shù)目等對(duì)各組合進(jìn)行評(píng)分，兩次重復(fù)取平均分(表4)。

圖3 SRAP反應(yīng)體系正交試驗(yàn)結(jié)果(A與B為兩個(gè)重復(fù))Fig. 3 Amplified pattern of SRAP-PCR based on orthogonal designs(A and B for two repeated trials)

處理treatment重復(fù)1copy1重復(fù)2copy2均值mean1676.52151414.531313134141514.55121.56211.579998121212933310111111111616161210101013766.5145551588816444

最優(yōu)條件及各因素影響力的大小由極差(R值)的大小判斷。R值越大，證明某一因素在不同水平下對(duì)反應(yīng)體系及擴(kuò)增結(jié)果影響越顯著。結(jié)果顯示(表5)，在確定的4個(gè)水平內(nèi)，模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+及dNTP 5大因素對(duì)擴(kuò)增影響從大到小依次排列為：Mg2+>TaqDNA聚合酶>引物> dNTP> 模板DNA濃度。

表5 各因素極差分析結(jié)果Table 5 The result of range analysis for the factors

各因素的某一水平影響反應(yīng)體系的情況需要由K值確定，K值越大，因素所處當(dāng)前水平PCR擴(kuò)增效果越好。根據(jù)表4，選定各因素K值最大值時(shí)的濃度作為最優(yōu)體系：其中模板DNA濃度為25 ng，引物濃度為0.3 μmol·L-1、Taq DNA聚合酶為1 U、Mg2+濃度為 2.5 mmol·L-1及dNTP 濃度為0.3 mmol·L-1。

2.4 體系穩(wěn)定性測(cè)定及引物篩選

利用以上確定的最優(yōu)體系進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，確定體系的穩(wěn)定性和適用性。利用8個(gè)不同種源的紅椿基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。如圖4所示，該體系擴(kuò)增條帶清晰可見，并且多態(tài)性高。證明所得到的優(yōu)化SRAP-PCR體系穩(wěn)定并且可靠，可有效地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，適用性強(qiáng)，用于區(qū)別不同種源紅椿之間的遺傳差異，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

注：M：DL2000 Marker，泳道18分別代表廣東樂(lè)昌、安徽黃山、貴州望謨、云南永仁、江西宜豐、湖南城步、福建南平和四川會(huì)東Note: M: DL2000 marker, 18 is Lechang, Huangshan, Wangmo, Yongren, Yifeng, Chengbu, Nanping, Huidong圖4 優(yōu)化的SRAP-PCR體系對(duì)8份紅椿DNA擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 Amplification results of 8 different T. ciliata DNA with the best SRAP-PCR

根據(jù)條帶擴(kuò)增的多態(tài)性及清晰度進(jìn)行引物組合的確定。最終篩選出30對(duì)引物組合(表6)，用于紅椿遺傳多樣性測(cè)定及分析。30對(duì)引物對(duì)紅椿30個(gè)種源進(jìn)行測(cè)定評(píng)估，各引物組合所擴(kuò)增出的條帶、多態(tài)性條帶、多態(tài)位點(diǎn)百分率和每對(duì)引物的PIC見表。根據(jù)表中多態(tài)百分率和PIC值進(jìn)行判定，引物組合Me35Em32(多態(tài)百分率為94.74%)，Me23Em22，Me27Em7，Me31Em24，Me32Em17，Me39Em32和Me43Em19(以上引物組合的PIC值(0.43，排名均為30對(duì)引物組合的前三名)可作為紅椿SRAP分子標(biāo)記的優(yōu)先骨干引物。

表6 30對(duì)SRAP引物的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、 多態(tài)性比率及PIC值Table 6 Total number of bands, polymorphic bands, polymorphism and polymorphic information content (PIC) obtained from 30 SRAP primer combinations

相比較瓊脂糖凝膠的分離效果，6%變性聚丙烯酰胺凝膠分離效果更好，銀染染色檢測(cè)條帶清晰，分辨率高，更適合紅椿SRAP分子標(biāo)記的分析和鑒定。

3 討論

SRAP分子標(biāo)記主要針對(duì)基因開放閱讀框(ORFs)的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物長(zhǎng)17 bp，主要目標(biāo)為基因中相對(duì)保守的外顯子區(qū)域；下游引物長(zhǎng)18 bp，富含AT-片段，對(duì)多態(tài)性較為豐富的內(nèi)含子和啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增，獨(dú)特引物組合會(huì)因個(gè)體或物種所包含的內(nèi)含子、啟動(dòng)子及間隔區(qū)間的不同而產(chǎn)生多態(tài)性[6]。在反應(yīng)體系優(yōu)化過(guò)程中，SRAP-PCR會(huì)因?yàn)椴煌姆磻?yīng)條件、反應(yīng)程序及物種差異，會(huì)產(chǎn)生不同的擴(kuò)增結(jié)果，體系中每一個(gè)因素的變化都會(huì)對(duì)導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果偏差[29]。本研究首先利用單因素試驗(yàn)確定反應(yīng)體系中5大因素的濃度范圍，以減少盲目性[30]。依據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)再次進(jìn)行多因素多水平綜合檢測(cè)，充分發(fā)揮了正交試驗(yàn)的均衡分散、綜合可比的特點(diǎn)，快速有效地明確各因素的組合關(guān)系[31]。同時(shí)選擇直接觀察方法與新復(fù)極差法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中各因素的影響作用及各因素最優(yōu)濃度進(jìn)行綜合分析評(píng)估，削弱或避免了僅僅依靠主觀判斷的誤差[32]。本研究中，兩次正交試驗(yàn)重復(fù)評(píng)分差別不明顯，此結(jié)果與陳麗君等[33]對(duì)苦楝的研究結(jié)果一致，證明SRAP-PCR 反應(yīng)體系相對(duì)比較穩(wěn)定。經(jīng)新復(fù)極差法研究發(fā)現(xiàn)，5大因素中Mg2+的極差R最大，說(shuō)明在體系中Mg2+影響力最大。作為TaqDNA聚合酶的激活劑，Mg2+直接影響擴(kuò)增過(guò)程中的酶活性。若體系中Mg2+濃度過(guò)高，會(huì)直接導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的發(fā)生，但為了保證正常激活酶活性，濃度不能過(guò)少，否則會(huì)得到不理想的擴(kuò)增結(jié)果，影響擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。在本研究中，Mg2+在體系中具有最重要的作用，后續(xù)的試驗(yàn)中一定要著重注意該因素的一致性。起到次要作用的因素為TaqDNA聚合酶。TaqDNA酶濃度必須在一個(gè)合適范圍內(nèi)才能成功地?cái)U(kuò)增出特異性片段，濃度少，無(wú)法得到準(zhǔn)確數(shù)量的擴(kuò)增片段，濃度大，會(huì)擴(kuò)增出多余的非特異性片段。引物的濃度同樣是PCR擴(kuò)增過(guò)程中的重要因素，若出現(xiàn)模板DNA無(wú)法與之配對(duì)，擴(kuò)增失敗的結(jié)果，則與濃度過(guò)低有關(guān)；產(chǎn)生非特異性性片段和形成引物二聚體，則可能是引物濃度過(guò)高造成的。dNTP是PCR擴(kuò)增反應(yīng)的底物，若擴(kuò)增產(chǎn)率降低或聚合酶滲入則與其有關(guān)；模板DNA是擴(kuò)增反應(yīng)的基礎(chǔ)，但如果DNA質(zhì)量較高，適量的濃度一般不會(huì)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生過(guò)多的影響[34-35]。各物種所含基因的差異及PCR試驗(yàn)的外在條件，都會(huì)直接或間接的影響到擴(kuò)增結(jié)果[18]，因此，不同的物種應(yīng)具有獨(dú)立穩(wěn)定的反應(yīng)條件及體系。

在進(jìn)行引物能力評(píng)估時(shí)，可依據(jù)PIC值對(duì)引物進(jìn)行初步判斷。當(dāng)PIC > 0.5，表示該引物或引物組合所呈現(xiàn)的多態(tài)性最好，貢獻(xiàn)率較高，可以最大程度的反應(yīng)遺傳多樣性。當(dāng)0.25 < PIC < 0.5，或者PIC值< 0.25時(shí)，則分別說(shuō)明該引物擴(kuò)增得到的多態(tài)位點(diǎn)處于中等或較低水平[36-37]。本研究中30對(duì)SRAP引物組合的PIC平均值為0.41，說(shuō)明SRAP分子標(biāo)記的引物組合可以很好地反映引物的區(qū)分能力，能有效準(zhǔn)確度地揭示紅椿不同種源的遺傳多樣性。

針對(duì)含有大量次生代謝產(chǎn)物的母樹葉片，本研究采用了有效的處理方法，保證了DNA的提取質(zhì)量；采用多種檢測(cè)手段進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記體系優(yōu)化，并獲得最優(yōu)反應(yīng)體系，彌補(bǔ)了單一優(yōu)化選擇手段的不足，區(qū)別了各因素在體系中的影響作用。以上均為其他物種進(jìn)行DNA提取及SRAP分子標(biāo)記提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究成功地獲得紅椿SRAP分子標(biāo)記的最優(yōu)體系，體系如下：25 μL體系中，模板DNA濃度為25 ng，引物濃度為0.3 μmol·L-1(正反引物濃度相同)、TaqDNA聚合酶為1 U、Mg2+濃度為 2.5 mmol·L-1及dNTP 濃度為0.3 mmol·L-1，2.5 μL 10×Buffer，重蒸水補(bǔ)齊體系。通過(guò)不同種源紅椿基因組DNA的重復(fù)驗(yàn)證，同樣獲得了穩(wěn)定清晰、多態(tài)性較強(qiáng)的擴(kuò)增條帶，表明所確定的最優(yōu)體系穩(wěn)定可靠，適用性較強(qiáng)。利用最優(yōu)體系進(jìn)行紅椿SRAP分子標(biāo)記的引物篩選，從1 505對(duì)引物組合中篩選出30對(duì)多態(tài)性高，重復(fù)性強(qiáng)的引物組合，用于紅椿后續(xù)遺傳多樣性研究中。

[1] Neil J, Helen O H T. Markers and mapping revisited: finding your gene[J]. New Phytologist, 2009, 183: 935-966.

[2] Agarwal M, Shrivastava N, Padh H. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences[J]. Plant Cell Rep, 2008(27): 617-631.

[3] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. TAG Theoretical and Applied Genetics, 2001, 103(2): 455-461.

[4] Sun S, Gao W, Lin S,etal. Analysis of genetic diversity in Ganoderma population with a novel molecular marker SRAP[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72(3): 537-543.

[5] Feng N, Xue Q, Guo Q,etal. Genetic Diversity and Population Structure of Celosia argentea and Related Species Revealed by SRAP[J]. Biochemical Genetics, 2009, 47(7-8): 521-532.

[6] Ren N, Liu J, Yang D,etal. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP)marker as a new method for identification of endophytic fungi from Taxus[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(1): 215-221.

[7] Yin Y, Liu Y, Li H,etal. Genetic diversity of Pleurotus pulmonarius revealed by RAPD, ISSR, and SRAP fingerprinting[J]. Curr Microbiol, 2014, 68(3): 397-403.

[8] Youssef M, James A C, Rivera-Madrid R,etal. Musa genetic diversity revealed by SRAP and AFLP[J]. Mol Biotechnol, 2011, 47(3): 189-199.

[9] Li P, Zhan X, Que Q,etal. Genetic Diversity and Population Structure of Toona Ciliata Roem. Based on Sequence-Related Amplified Polymorphism (SRAP)Markers[J]. Forests, 2015, 6(4): 1094-1106.

[10] 龍漢利，馮 毅，向 青，等. 四川盆周山地紅椿生長(zhǎng)特性研究[J]. 四川林業(yè)科技, 2011(03): 37-41.

[11] Boland D J. Toona ciliata M.Roemer.[M]. Wallingford: CAB International, 2000: 6472-6485.

[12] Zacaroni A B, Pozza E A, Mansur T D O F,etal. Occurrence of Phyllachora balansae in Toona ciliata in Southern Minas Gerais State, Brazil.[J]. Summa Phytopathologica, 2013, 39(3): 219-221.

[13] 劉均利，楊柳璐，劉 青，等. 紅椿的組織培養(yǎng)與植株再生[J]. 林業(yè)科技, 2014(06): 1-5.

[14] 文亞峰，韓文軍，吳 順. 植物遺傳多樣性及其影響因素[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2010(12): 80-87.

[15] Zeng J, Zou Y, Bai J,etal. Preparation of Total DNA from “ Recalcitrant Plant Taxa[J]. Acta Botanica Sinica, 2002, 44(6): 694-697.

[16] 李建光，李榮生，李發(fā)根，等. 蛇皮果基因組DNA提取及其RAPD條件優(yōu)化[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2012(06): 110-114.

[17] 令狐斌，侯思宇，孫朝霞，等. 苦蕎SRAP分子標(biāo)記體系優(yōu)化與遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015(01): 37-43.

[18] 糜亞男，張水寒，蔡 媛，等. 杜仲SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2015(02): 1-6.

[19] 武正前，李雪虎，梁劍平，等. 大青葉SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化研究[J]. 植物研究, 2015(02): 310-314.

[20] Alghamdi S, Al-Faifi S, Migdadi H,etal. Molecular Diversity Assessment Using Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP)Markers in Vicia faba L.[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2012, 13(12): 16457-16471.

[21] Aneja B, Yadav N R, Chawla V,etal. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP) molecular marker system and its applications in crop improvement[J]. Molecular Breeding, 2012, 30(4): 1635-1648.

[22] Huang C, Liu G, Bai C,etal. Genetic Analysis of 430 Chinese Cynodon dactylon Accessions Using Sequence-Related Amplified Polymorphism Markers[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(10): 19134-19146.

[23] Jing Z B, Wang X P, Cheng J M. Analysis of genetic diversity among Chinese wild Vitis species revealed with SSR and SRAP markers[J]. Genet Mol Res, 2013, 12(2): 1962-1973.

[24] Mokhtari N, Rahimmalek M, Talebi M,etal. Assessment of genetic diversity among and within Carthamus species using sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers[J]. Plant Systematics and Evolution, 2013, 299(7): 1285-1294.

[25] Polat I, Kacar Y A, Yesiloglu T,etal. Molecular characterization of sour orange (Citrus aurantium) accessions and their relatives using SSR and SRAP markers[J]. Genet Mol Res, 2012, 11(3): 3267-3276.

[26] 趙秀娟，宋建文，胡開林. 苦瓜種質(zhì)遺傳多樣性的SRAP標(biāo)記分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2013(01): 78-84.

[27] Shen J, Jia X, Ni H,etal. AFLP analysis of genetic diversity of Jatropha curcas grown in Hainan, China[J]. Trees. 2010, 24(3): 455-462.

[28] Brunt C, Read J, Sanson G D. Changes in resource concentration and defence during leaf development in a tough-leaved (Nothofagus moorei) and soft-leaved (Toona ciliata) species[J]. Oecologia, 2006, 148(4): 583-592.

[29] 李芳芳，楊少宗，柳新紅，等. 楓香樹DNA提取及SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015(01): 46-51.

[30] 劉明騫，陳麗君，歐陽(yáng)昆唏，等. 劍豆SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015(01): 75-78.

[31] 王 軍，楊榮萍，洪明偉，等. 石榴SPAR-PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化及驗(yàn)證[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué), 2013(03): 376-379.

[32] 劉萌芽，黃如葵，黃玉輝，等. 正交直觀分析法和新復(fù)極差法優(yōu)化苦瓜SRAP反應(yīng)體系研究[J]. 北方園藝, 2014(05): 85-88.

[33] 陳麗君，劉明騫，廖柏勇，等. 苦楝SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 36(3):104-108.

[34] 陳 罡，關(guān)明東，葉景豐，等. 楊樹SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 北方園藝, 2010(16): 132-134.

[35] 何仁鋒，馮尚國(guó)，陳 喆，等. 藥用菊花SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J]. 分子植物育種, 2015(02): 367-378.

[36] Wang B H, Zhu P, Yuan Y L,etal. Development of EST-SSR markers related to salt tolerance and their application in genetic diversity and evolution analysis in Gossypium[J]. Genet Mol Res, 2014, 13(2): 3732-3746.

[37] Xie W, Zhang X, Cai H,etal. Genetic diversity analysis and transferability of cereal EST-SSR markers to orchardgrass (Dactylis glomerata L.)[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2010, 38(4): 740-749.

(責(zé)任編輯：張 研)

ToonaciliataRoem.

LIPei1,QUEQing-min1,WANGFang1,LIJun-cheng1,ZHUQin2,LIAOBo-yong1,CHENXiao-yang1

(1.Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm, College of Forestry and Landscape Architecture,South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China; 2.Jiaying University, Meizhou 514015, Guangdong, China)

[Objective]To optimize the different components of sequence-related amplified polymorphism (SRAP)and to establish suitable SRAP-PCR system forToonaciliataRoem., and to select high-stability polymorphic band SRAP primer combinations. [Method]The experiment basis for genetic diversity ofT.ciliatewas established. Five factors each with eight concentration levels were screened to the suitable concentration range in the PCR reaction system using single factor experiment. After that, four levels were selected in each range of the five factors. The orthogonal experiment ofL16(45)was carried out for optimization. Combining with orthogonal design-direct analysis and SSR to optimize these factors and the optimized system was determined. [Result] The optimal SRAP-PCR system was established, containing 25 ng template DNA, 0.3 mmol·L-1each dNTP, 0.3 μmol·L-1each primer, 2.5 mmol·L-1each Mg2+and 1 UTaqDNA polymerase in a total volume of 25 μL. 30 primer combinations were selected from 1 505 s using the stability of the PCR system. [Conclusion]Through repeated validations using DNA of differentT.ciliataprovenances, the clear polymorphic bands were obtained. The result showed that the optimal SRAP-PCR system can be used for the follow-up experiments onT.ciliatagenetic diversity research in virtue of its stable, reliable, and good applicability.

ToonaciliataRoem.; SRAP-PCR; reaction system; optimization

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.002

2016-02-29

國(guó)家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201004020)。

李 培，博士，主要研究方向：林木遺傳育種。電話：15920837987。E-mail：lipei-meinv@163.com。地址:廣州市天河區(qū)五山路華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院614，郵編：510642。
* 通訊作者：陳曉陽(yáng)，博士，教授。主要研究方向：林木遺傳育種。電話: 020-85280001。E-mail:zhbd0226@163.com 地址:廣州市天河區(qū)五山路華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院620，郵編：510642。

S817.46

A

1001-1498(2017)01-0010-08