李 煜，張 進(jìn)，王麗娟，盧孟柱*

(1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

楊樹(shù)PtROP家族基因的表達(dá)分析與功能預(yù)測(cè)

李 煜1,2，張 進(jìn)1,2，王麗娟1,2，盧孟柱1,2*

(1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

[目的]為探究ROP基因在林木中的功能。[方法]本研究以楊樹(shù)為模式，在全基因組水平上對(duì)ROP基因的家族成員、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、氨基酸序列相似性及表達(dá)模式進(jìn)行了分析。[結(jié)果]顯示，楊樹(shù)PtROP基因家族包含13個(gè)成員，不同成員間在進(jìn)化上相對(duì)保守，均存在與GTP結(jié)合與水解相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。這些基因在不同組織、不同脅迫條件下的表達(dá)具有明顯差異，說(shuō)明它們參與不同的生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)構(gòu)建功能基因網(wǎng)絡(luò)(functional gene network for poplar)發(fā)現(xiàn)PtROP基因主要參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。[結(jié)論] 楊樹(shù)PtROP基因家族包含13個(gè)成員參與不同的生物學(xué)過(guò)程，可能主要參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。

楊樹(shù)；ROP；基因家族；基因表達(dá)模式

G蛋白是一類(lèi)GTP結(jié)合蛋白，按照G蛋白分子量和亞基組成可分為異源三聚體G蛋白、小G蛋白和幾種特殊的GTP結(jié)合蛋白[1]。小G蛋白家族又稱(chēng)為Ras超家族，根據(jù)其成員之間結(jié)構(gòu)和功能的相似性，將Ras超家族分為五個(gè)不同的家族，分別是Ras、Rab、Arf、Ran和Rho家族[2]，其中Rho家族又可被分為CDC42、RAC和RHO三個(gè)亞家族[3-4]。這五個(gè)家族成員在細(xì)胞中參與了不同的生物學(xué)過(guò)程，例如Ras家族成員參與調(diào)控細(xì)胞增殖，Rab家族和Arf家族成員在介導(dǎo)不同膜細(xì)胞器之間的囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用，Ran家族成員主要調(diào)控與細(xì)胞核相關(guān)的一些細(xì)胞活動(dòng)，而Rho家族成員在細(xì)胞骨架重組及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中行使重要功能[5]。

與動(dòng)物或真菌Ras超家族不同，植物沒(méi)有Ras家族，而植物中Rho形成了獨(dú)特的一類(lèi)，稱(chēng)為ROP(Rho-related proteins from plants)[5]。自1993年首次從豌豆中發(fā)現(xiàn)Rho相似性GTPase以來(lái)，已在擬南芥、水稻與玉米等多種植物中進(jìn)行了鑒定[6]。ROP主要在與GTP結(jié)合的活性形式和與GDP結(jié)合的非活性形式之間循環(huán)，該循環(huán)過(guò)程需要多種蛋白的參與，如鳥(niǎo)苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)、GTPase激活蛋白(GTPase activating protein，GAP)、鳥(niǎo)苷酸解離抑制因子(GDP dissociation inhibitor，GDI)等。一旦受體感知到上游信號(hào)，鳥(niǎo)苷酸交換因子就催化ROP從GDP結(jié)合的非活性形式轉(zhuǎn)換為GTP結(jié)合的活性形式，具有活性的ROP蛋白與下游效應(yīng)蛋白結(jié)合發(fā)揮其生理功能[7]。ROP蛋白的結(jié)構(gòu)極為保守，主要包含與鳥(niǎo)苷酸結(jié)合和水解有關(guān)的5個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域、1個(gè)效應(yīng)因子結(jié)合區(qū)、1個(gè)插入序列和C端高度可變區(qū)。GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)因子結(jié)合區(qū)決定ROP蛋白的功能，插入序列的功能目前尚不清楚，C端高度可變區(qū)決定ROP蛋白的亞細(xì)胞定位[8]。

ROP在植物發(fā)育與抗逆等生物學(xué)過(guò)程中具有重要的功能。在葉表皮鋪板細(xì)胞中，擬南芥ROP2調(diào)節(jié)PIN1的內(nèi)吞過(guò)程[9]。在擬南芥胚胎發(fā)育階段，ROP3在維持PIN1和PIN3在細(xì)胞膜上的極性分布方面具有重要作用[10]。擬南芥中多種ROP基因在花粉管尖端表達(dá)，其中ROP1對(duì)花粉管的極性生長(zhǎng)起主要作用[11]。ROP還參與根毛的發(fā)育，超表達(dá)擬南芥ROP2，能增加根毛數(shù)量和密度，而AtROP4控制根毛的發(fā)生和尖端的伸長(zhǎng)[12]。此外，擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中的ROP2能夠被光激活來(lái)抑制光誘導(dǎo)的氣孔張開(kāi)[13]。目前，在擬南芥基因組中共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)ROP基因成員，水稻和玉米分別發(fā)現(xiàn)7個(gè)和9個(gè)[6]。雖然一些研究都表明ROPs廣泛參與了植物對(duì)激素，環(huán)境等信號(hào)的響應(yīng)及植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，但各個(gè)ROP成員的功能還有待進(jìn)一步解析。楊樹(shù)全基因組序列雖已公布，但對(duì)ROP基因家族成員尚未進(jìn)行系統(tǒng)分析[14]。

本研究利用擬南芥ROP氨基酸序列，在楊樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)，共鑒定出13個(gè)PtROP基因序列。在此基礎(chǔ)上，對(duì)楊樹(shù)PtROP基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析，并對(duì)其在不同組織和不同脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，構(gòu)建了其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果為將來(lái)系統(tǒng)解析楊樹(shù)ROP基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用銀腺楊(P.alba×P.glandulosa)無(wú)性系84K，由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。楊樹(shù)幼苗培養(yǎng)于人工培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，晝夜溫度為23℃/20℃。分別取楊樹(shù)幼株(株高約80 cm)的頂端、幼葉、成熟葉、莖頂端、莖下部及根，分別提取總RNA。

1.2 總RNA的提取

總RNA提取參見(jiàn)QIAGEN RNeasy Plant Kit RNA描述的方法進(jìn)行。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

用帶有Oligo(dT)的磁珠富集樣品總RNA中的mRNA，將富集的mRNA片段化后用隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，隨后合成雙鏈cDNA，再對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行純化，末端修復(fù)和添加測(cè)序接頭，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫(kù)用Illumina HiSeqTM2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行pair-end 100 bp測(cè)序，每個(gè)樣品分別獲得2G clean data。測(cè)序原始數(shù)據(jù)去除接頭及低質(zhì)量reads，獲得的clean reads利用TopHat2比對(duì)到毛果楊基因組上(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Ptrichocarpa，release 3.0)。標(biāo)準(zhǔn)化的FPKM值反映基因的表達(dá)水平。

1.4 數(shù)據(jù)來(lái)源

擬南芥ROP基因及其編碼的蛋白質(zhì)序列來(lái)源于TAIR(http://www.arabidopsis.org/index.jsp)數(shù)據(jù)庫(kù)。以擬南芥ROP蛋白序列為搜索對(duì)象，通過(guò)blastp程序在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Ptrichocarpa，release 3.0)中搜索相似的蛋白序列，選取E≤10-10的序列作為候選序列，獲得的毛果楊ROP基因命名為PtROP1-13。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將擬南芥和楊樹(shù)PtROP氨基酸序列保存為FASTA格式，用Clustal X[15]對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，分別利用MEGA5.0[16]中Maximum-Likelihood(ML)法和Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 基因結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用在楊樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的基因組DNA序列及CDS序列使用GSDS[17]程序(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)楊樹(shù)PtROP基因的外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行分析。楊樹(shù)PtROP基因組DNA序列及CDS序列下載自Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Ptrichocarpa, release 3.0)。

1.7 基因表達(dá)分析

分析楊樹(shù)不同脅迫條件下的PtROP基因成員的表達(dá)模式所用的基因芯片數(shù)據(jù)來(lái)自NCBI Gene Expression Omnibus(GEO)[18]數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.8 楊樹(shù)PtROP基因功能網(wǎng)絡(luò)分析

利用網(wǎng)站(http://10.13.200.25/PoplarGene/index.php)對(duì)楊樹(shù)ROP基因進(jìn)行功能網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)PtROP基因鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

表1 楊樹(shù)PtROP基因家族成員基本信息Table1 Basic information of Populus PtROP gene

A.最大似然法(ML)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；B.鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)A. Phylogenetic tree was constructed by the Maximum Likelihood method; B. Phylogenetic tree was constructed by the neighbor-joining method圖1 楊樹(shù)和擬南芥ROP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 1 Phylogenetic relationship between Populus and Arabidopsis ROP families

2.2PtROP基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEME結(jié)構(gòu)域搜索工具在楊樹(shù)PtROP中檢測(cè)到15個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。結(jié)果表明， PtROP10中不存在motif 2，PtROP5不具有motif 5，而其它ROP均具有motif 1-7。Motif 1、2、3及5代表了ROP蛋白與GTP結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(圖4)，這四個(gè)結(jié)構(gòu)域中都存在與GTP結(jié)合的保守結(jié)合位點(diǎn)。PtROP5雖然不具有motif 5，但它具有其它與GTP結(jié)合的保守結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)楊樹(shù)PtROP蛋白motif 2中第20位的蘇氨酸、motif 3中第10位的天冬氨酸分別進(jìn)行點(diǎn)突變，能夠改變ROP蛋白與GTP的親和性，使其成為顯性失活形式。如果對(duì)楊樹(shù)PtROP蛋白motif 1中將第6

位的谷氨酰胺突變?yōu)榱涟彼?，ROP蛋白就成為了持續(xù)活性型形式(圖4)。

圖2 楊樹(shù)PtROP基因結(jié)構(gòu)Fig. 2 Gene structures of PtROP genes

2.3PtROP基因旁系同源基因?qū)Φ膹?fù)制

通過(guò)比較其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)及氨基酸序列相似性，在楊樹(shù)PtROP基因家族中共鑒定得到4對(duì)旁系同源基因?qū)?，分別是PtROP1/PtROP4、PtROP2/PtROP6、PtROP8/PtROP11及PtROP9/PtROP13，這些基因?qū)χg在氨基酸序列、內(nèi)含子的插入大小及插入位點(diǎn)都極為保守。PtROP1/PtOP4、PtROP2/PtROP6、PtROP8/PtROP11、PtROP9/PtROP13所在染色體片段區(qū)域的大部分基因都是同源基因，因此這四個(gè)基因?qū)赡苁怯捎谌旧w復(fù)制產(chǎn)生的(圖5)。計(jì)算這四個(gè)基因?qū)Ψ峭x替換率和同義替換率的比值，發(fā)現(xiàn)它們都小于0.4，因此基因?qū)χ械膬蓚€(gè)旁系同源基因復(fù)制后經(jīng)歷了純化選擇在功能上產(chǎn)生了一定程度的差異(表2)。根據(jù)楊樹(shù)擴(kuò)張度λ=9.1×10-9，估算出PtROP旁系同源基因?qū)赡苁窃?.74到17.30百萬(wàn)年前產(chǎn)生的，其中PtROP1/PtROP4產(chǎn)生的最早，約在17.30百萬(wàn)年前；PtROP8/PtROP11產(chǎn)生的最晚，約在8.74百萬(wàn)年前。而PtROP2/PtROP6、PtROP9/PtROP13分別是在13.98百萬(wàn)年前和11.77百萬(wàn)年前產(chǎn)生的，這個(gè)時(shí)期與楊樹(shù)最近一次在13百萬(wàn)年前發(fā)生的大規(guī)模片段復(fù)制時(shí)間大致相符[14]。

圖3 楊樹(shù)與擬南芥ROP氨基酸序列相似性Fig. 3 Sequence similarites between Populus and Arabidopsis ROP proteins

圖4 楊樹(shù)PtROP蛋白保守結(jié)構(gòu)域分布Fig. 4 Distribution of conserved motifs in PtROP proteins

圖5 楊樹(shù)PtROP旁系同源基因?qū)ig. 5 PtROP paralogous gene pairs in P trichocarpa ROP gene family

基因1基因2非同義替換率同義替換率非同義替換率/同義替換率時(shí)期(百萬(wàn)年前)PtROP1PtROP40.0740.3150.23617.30PtROP2PtROP60.0130.2550.05213.98PtROP8PtROP110.0200.1590.1258.74PtROP9PtROP130.0200.2140.09411.77

2.4 在不同組織、不同脅迫條件下的表達(dá)

為了探究楊樹(shù)PtROP基因可能參與的生物學(xué)過(guò)程，利用課題組的RNA-seq數(shù)據(jù)和已公布的楊樹(shù)基因芯片數(shù)據(jù)，分析了楊樹(shù)PtROP基因在不同組織及不同脅迫條件下的表達(dá)模式。與幼葉、老葉、幼莖、木質(zhì)化莖及根相比，楊樹(shù)PtROP1、PtROP2、PtROP8、PtROP11及PtROP12在頂點(diǎn)的表達(dá)水平較高，表明它們可能參與了頂端發(fā)育過(guò)程。PtROP7、PtROP9及ROP13特異性地在已木質(zhì)化的莖中表達(dá)，說(shuō)明這些基因可能參與楊樹(shù)次生生長(zhǎng)。PtROP1、PtROP8、PtROP9及PtROP12在老葉中的表達(dá)量最低，表明它們可能不參與光合作用及次生物質(zhì)的代謝過(guò)程(圖6)。

圖6 楊樹(shù)PtROP基因在不同組織中的表達(dá)模式Fig.6 Expression analyses of PtROPs in various tissues

在應(yīng)拉木和應(yīng)力木中PtROP7、PtROP9、PtROP10及PtROP13表達(dá)都顯著下調(diào)，且PtROP7、PtROP9及PtROP13在次生莖中特異性高表達(dá)，表明這三個(gè)基因的表達(dá)受外力的調(diào)控。對(duì)高溫、低溫、干旱和鹽脅迫條件下PtROP基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，13個(gè)基因中僅有PtROP7在低溫條件下下調(diào)表達(dá)，表明大部分PtROP基因可能不直接對(duì)高、低溫、干旱和鹽等脅迫響應(yīng)，或者其在脅迫條件下的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)細(xì)胞功能的維持具有重要作用(圖7)。

2.5 楊樹(shù)PtROP基因功能基因網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步解析PtROP基因的生物學(xué)功能，構(gòu)建了PtROP的功能基因網(wǎng)絡(luò)。發(fā)現(xiàn)與PtROP基因緊密聯(lián)系的基因主要分為四類(lèi)，即Rho GDP-解離抑制活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、tRNA修飾及Actin細(xì)胞骨架(表3)。其中，在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中大約50%的基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，并且這些基因與楊樹(shù)PtROP基因的相關(guān)性都比較大，這與擬南芥中ROP參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果相符合，說(shuō)明PtROP基因具有功能保守性。13個(gè)基因中，與PtROP2和PtROP3相關(guān)聯(lián)的基因最多，表明二者在整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮主要作用。在網(wǎng)絡(luò)中，與tRNA修飾相關(guān)的基因占50%以上，但僅有PtROP4與之相關(guān)聯(lián)，并且它們之間的相關(guān)性較小，可能PtROP4廣泛地參與到tRNA修飾中，但不在其中起主要作用，另外，PtROP4基因在13個(gè)PtROP基因中僅與PtROP1存在關(guān)聯(lián)，顯示楊樹(shù)PtROP4可能在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了功能分化(圖8)。

圖7 楊樹(shù)PtROP基因不同脅迫下的表達(dá)(PtROPs在不同脅迫下的變化倍數(shù)的log2轉(zhuǎn)換值)Fig.7 Expression analyses of PtROPs under various stresses

表3 楊樹(shù)PtROP功能基因網(wǎng)絡(luò)中基因相關(guān)信息Table 3 Genes information in the PtROP gene functional network

圖8 楊樹(shù)PtROP基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 8 PtROP gene functional network

3 討論

楊樹(shù)是全球廣泛分布的重要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，具有生長(zhǎng)迅速，生物量大、輪伐期短等特點(diǎn)，隨著楊樹(shù)全基因組測(cè)序的完成，楊樹(shù)已成為研究多年生林木生長(zhǎng)發(fā)育的模式樹(shù)木。在不同物種中對(duì)ROP基因的研究發(fā)現(xiàn)ROP基因廣泛地參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆過(guò)程，而且ROP基因在初生細(xì)胞壁和次生細(xì)胞壁的沉積過(guò)程中具有重要作用[20]。因此對(duì)于楊樹(shù)ROP基因的研究，不僅在揭示木本植物發(fā)育和抗逆機(jī)理上具有重要意義，而且具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本研究利用已知的擬南芥ROP氨基酸序列在楊樹(shù)全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性序列搜索，共檢測(cè)到13個(gè)PtROP基因成員，其中包含四個(gè)旁系同源基因?qū)?；進(jìn)化分析表明，這些基因可能來(lái)自全基因組染色體復(fù)制。楊樹(shù)PtROP基因結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析及氨基酸序列相似性分析表明，楊樹(shù)PtROP基因家族成員在結(jié)構(gòu)與氨基酸序列上極為保守。楊樹(shù)PtROP基因與擬南芥相同，分為四類(lèi)，它們相對(duì)應(yīng)的類(lèi)別，氨基酸序列相似度很高。對(duì)楊樹(shù)PtROP的motif研究表明，楊樹(shù)和擬南芥ROP一樣，都具有相同的與GTP結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域。這些研究結(jié)果預(yù)示著ROPs在楊樹(shù)中具有類(lèi)似的、保守的功能。

對(duì)楊樹(shù)PtROP基因家族成員在不同組織、不同脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)不同的PtROP基因在不同的組織中表達(dá)存在差異，表明它們可能參與了不同的生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥ROP11影響次生細(xì)胞壁的沉積，在超表達(dá)持續(xù)活性型ROP11擬南芥中，正在分化的木質(zhì)部細(xì)胞次生壁上沒(méi)有紋孔的形成，而ROP效應(yīng)因子ROPGEF4的缺失導(dǎo)致次生壁上紋孔數(shù)量減少[21]。桉樹(shù)ROP1也能夠影響次生細(xì)胞壁的沉積，其在形成層和正在分化的木質(zhì)部細(xì)胞中都有很高的表達(dá)水平，在擬南芥中超表達(dá)持續(xù)活性型的桉樹(shù)ROP1基因抑制次生木質(zhì)部的木質(zhì)化和木葡聚糖沉積[22]。本研究發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)PtROP7、PtROP9與PtROP13特異性地在莖的次生長(zhǎng)生中高豐度表達(dá)，表明這三個(gè)基因可能參與了楊樹(shù)次生生長(zhǎng)過(guò)程。PtROP7、PtROP9與PtROP13同屬于楊樹(shù)PtROP基因家族的第三類(lèi)，可能存在功能上的冗余，以保障在莖的次生維管發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

已有研究表明，植物ROP蛋白參與了多種逆境脅迫。例如，油菜ROP5和ROP9在高溫脅迫后表達(dá)發(fā)生明顯變化[23]，玉露桃冷害脅迫后，果實(shí)中的ROP基因表達(dá)量顯著降低[24]。本研究通過(guò)對(duì)高溫、低溫、干旱與鹽等脅迫條件下楊樹(shù)PtROP的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，PtROP基因?qū)@些脅迫沒(méi)有產(chǎn)生顯著響應(yīng)，可能是由于楊樹(shù)PtROP基因功能的特化，趨于基本維持細(xì)胞正常的信息與物質(zhì)的流動(dòng)。通過(guò)楊樹(shù)PtROP的功能基因網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)PtROP基因主要參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，這與上述推測(cè)是一致的[25]。

4 結(jié)論

本研究以楊樹(shù)為模式，在全基因組水平上對(duì)ROP基因的家族成員、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、氨基酸序列相似性及表達(dá)模式進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)中共有13個(gè)PtROP基因，它們的基因結(jié)構(gòu)相似，功能結(jié)構(gòu)域是保守的。根據(jù)氨基酸序列相似性及C端高度可變區(qū)結(jié)構(gòu)，楊樹(shù)PtROP被分為四類(lèi)：第一類(lèi)(PtROP10)、第二類(lèi)(PtROP8、PtROP11和PtROP12)、第三類(lèi)(PtROP7、PtROP9和PtROP13)及第四類(lèi)(PtROP1-6)。對(duì)PtROP基因的復(fù)制情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PtROP基因家族中存在四對(duì)旁系同源基因?qū)?PtROP1/PtROP4、PtROP2/PtROP6、PtROP8/PtROP11及PtROP9/PtROP13)，它們都是通過(guò)全基因組復(fù)制產(chǎn)生的。四個(gè)基因?qū)Χ冀?jīng)歷了純化選擇。PtROP旁系同源基因?qū)赡苁窃?.74到17.30百萬(wàn)年前產(chǎn)生的。對(duì)PtROP基因家族成員在不同組織和不同脅迫響應(yīng)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PtROP基因家族成員表達(dá)模式具有明顯差異。通過(guò)構(gòu)建PtROP功能基因網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)PtROP可能參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、tRNA修飾及細(xì)胞骨架形成等過(guò)程。

本研究系統(tǒng)分析了楊樹(shù)PtROP家族的成員及其進(jìn)化關(guān)系，研究PtROP基因在木本植物發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)特性和可能的功能，為進(jìn)一步研究其在木本植物特別是次生生長(zhǎng)過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1] Assmann S M. Heterotrimeric and unconventional GTP binding proteins in plant cell signaling[J]. The Plant Cell, 2002, 149(suppl 1): S355-S373.

[2] Kahn R A, Der C J, Bokoch G M. The ras superfamily of GTP-binding proteins: guidelines on nomenclature[J]. The FASEB Journal, 1992, 6(8): 2512-2513.

[3] Chant J, Stowers L. GTPase cascades choreographing cellular behavior: movement, morphogenesis, and more[J]. Cell, 1995, 81(1): 1-4.[4] Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton[J]. Science, 1998, 279(5350): 509-514.

[5] Vernoud V, Horton A C, Yang Z,etal. Analysis of the small GTPase gene superfamily ofArabidopsis[J]. Plant Physiology, 2003, 131(3): 1191-1208.

[6] Pandey G K, Sharma M, Pandey A,etal. GTPases: Versatile Regulators of Signal Transduction in Plants[M]. Springer, 2015.

[7] Ren H, Lin D. ROP GTPase Regulation of Auxin Transport inArabidopsis[J]. Molecular Plant, 2015, 8(2): 193-195.

[8] Berken A, Wittinghofer A. Structure and function of Rho-type molecular switches in plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2008, 46(3): 380-393.

[9] Nagawa S, Xu T, Lin D,etal. ROP GTPase-dependent actin microfilaments promote PIN1 polarization by localized inhibition of clathrin-dependent endocytosis[J]. PLoS Biol, 2012, 10(4): e1001299.

[10] Huang J, Liu H, Chen M,etal. ROP3 GTPase contributes to polar auxin transport and auxin responses and is important for embryogenesis and seedling growth inArabidopsis[J]. The Plant Cell, 2014, 26(9): 3501-3518.

[11] Li H, Wu G, Ware D,etal. Arabidopsis Rho-related GTPases: differential gene expression in pollen and polar localization in fission yeast[J]. Plant Physiology, 1998, 118(2): 407-417.

[12] Molendijk A J, Bischoff F, Rajendrakumar C S V,etal.Arabidopsisthaliana Rop GTPases are localized to tips of root hairs and control polar growth[J]. The EMBO Journal, 2001, 20(11): 2779-2788.[13] Jeon B W, Hwang J U, Hwang Y,etal. TheArabidopsissmall G protein ROP2 is activated by light in guard cells and inhibits light-induced stomatal opening[J]. The Plant Cell, 2008, 20(1): 75-87.[14] Tuskan G A, Difazio S, Jansson S,etal. The genome of black cottonwood,Populustrichocarpa(Torr. & Gray)[J].Science, 2006, 313(5793): 1596-1604.

[15] Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F,etal. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25(24): 4876-4882.

[16] Tamura K, Peterson D, Peterson N,etal. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739.

[17] Guo A Y, Zhu Q H, Chen X,etal. [GSDS: a gene structure display server[J]. Yi Chuan= Hereditas/Zhongguo Yi Chuan Xue Hui Bian Ji, 2007, 29(8): 1023-1026.

[18] Barrett T, Edgar R. [19] Gene Expression Omnibus: Microarray Data Storage, Submission, Retrieval, and Analysis[J]. Methods in enzymology, 2006, 411: 352-369.

[19]Zheng Z L, Yang Z. The Rop GTPase switch turns on polar growth in pollen[J]. Trends in plant science, 2000, 5(7): 298-303.

[20] Oda Y, Fukuda H. Emerging roles of small GTPases in secondary cell wall development[J]. Frontiers in Plant Science, 2014, 5.

[21] Oda Y, Fukuda H. Initiation of cell wall pattern by a Rho-and microtubule-driven symmetry breaking[J]. Science, 2012, 337(6100): 1333-1336.

[22] Foucart C, Jauneau A, Gion J M,etal. Overexpression ofEgROP1, a Eucalyptus vascular-expressed Rac-like small GTPase, affects secondary xylem formation inArabidopsisthaliana[J]. New Phytologist, 2009, 183(4): 1014-1029.

[23] Chan J, Pauls K P. Brassica napus Rop GTPases and their expression in microspore cultures[J]. Planta, 2007, 225(2): 469-484.[24] Jin W, Xu C, Li X,etal. Expression ofROP/RACGTPasegenes in postharvest loquat fruit in association with senescence and cold regulated lignification[J]. Postharvest Biology and Technology, 2009, 54(1): 9-14.

[25] Miyawaki K N, Yang Z. Extracellular signals and receptor-like kinases regulating ROP GTPases in plants[J]. Frontiers in Plant Science, 2014, 5.

(責(zé)任編輯：張 研)

Expression and Functional Analysis ofROPGene Family inPopulus

LIYu1,2，ZHANGJin1,2，WANGLi-juan1,2，LUMeng-zhu1,2

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China;2.Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry,Beijing 100091, China)

[Objective]To explore the putative function ofROPsin forest trees. [Method]A genome-wide analysis ofROPswas performed, including the phylogeny, gene structure, conserved motifs, ROP amino sequences similarity betweenPopulusandArabidopsisROP proteins and the expression patterns usingPopulusas a model. [Result]The results showed that there were 13 members ofPtROPgenes inPopulusand thePtROPgenes were conserved during evolution of species, all of them containing GTP binding and hydrolysis-related domains. Furthermore, the expression profiles revealed thatPopulusPtROPhad distinct expression pattern across different tissues and different stress conditions, suggesting thatPtROPgenes were involved in different biological processes. In addition, the analysis onPtROPgene functional network was conducted. It is predicted thatPopulusPtROPgenes were mainly involved in signal transduction.[Conclude]In this study, systematically bioinformatics analysis onPtROPwere conducted which laid the foundation for the further exploration of poplarPtROPfunctions.

Populus; ROP; gene family; gene expression pattern

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.001

2016-02-01

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31270699)。

李 煜，男，在讀碩士。主要方向：林木極性生長(zhǎng)調(diào)控。E-mail：linxueliyu@163.com
* 通訊作者：研究員，博士生導(dǎo)師，從事分子生物學(xué)研究。E-mail：lumz@caf.ac.cn

S792.11

A

1001-1498(2017)01-0001-09