趙欽 敖奕然 楊凱 蘇小麗 呂曉強

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400016

沉默生物鐘基因PER1對口腔鱗狀細胞癌細胞中生物鐘基因網(wǎng)絡的影響

趙欽 敖奕然 楊凱 蘇小麗 呂曉強

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科，重慶 400016

目的 探討口腔鱗狀細胞癌細胞中生物鐘基因PER1對生物鐘基因網(wǎng)絡中其他生物鐘基因表達的影響。方法采用RNA干擾技術(shù)沉默人口腔鱗狀細胞癌SCC15細胞中PER1基因，應用流式細胞儀檢測沉默后細胞的增殖和凋亡水平，實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測生物鐘基因CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、PER3、DEC1、DEC2、CRY1、CRY2、TIM、CKIE、RORA、NPAS2、REV-ERBA mRNA的表達情況。結(jié)果 PER1基因沉默后，SCC15細胞增殖指數(shù)上升，凋亡指數(shù)下降（P＜0.05）；PER1、PER2、DEC1、DEC2、CRY1、CRY2和NPAS2 mRNA的表達水平降低（P＜0.05），PER3、TIM、RORA和REV-ERBA mRNA的表達水平升高（P＜0.05），CLOCK、BMAL1和CKIE mRNA的表達水平無統(tǒng)計學改變（P＞0.05）。結(jié)論 生物鐘基因PER1能夠調(diào)控生物鐘基因網(wǎng)絡中眾多其他生物鐘基因PER2、DEC1、DEC2、CRY1、CRY2、NPAS2、PER3、TIM、RORA和REV-ERBA的表達，PER1在生物鐘基因網(wǎng)絡中具有重要調(diào)控作用。

生物鐘； 鱗狀細胞癌； 口腔； 基因

生物鐘對調(diào)控體內(nèi)各種復雜生命活動協(xié)同有序進行和維持正常生命活動具有重要作用[1-2]。生物鐘基因是構(gòu)成生物鐘的核心，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)14個生物鐘基因，即：CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、PER3、DEC1、DEC2、CRY1、CRY2、TIM、CKIE、RORA、NPAS2和REV-ERBA[2-8]。這些生物鐘基因存在于人體內(nèi)幾乎所有的細胞[9-10]，其通過相互作用，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平形成多條正負反饋環(huán)路的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)[3-6]。哺乳類動物基因組中有2%～10%的基因受到這些生物鐘基因的調(diào)控，被稱為鐘控基因[3]，不同生物鐘基因可通過對下游不同鐘控基因的調(diào)控影響細胞的生命活動[3]。生物鐘基因的異常表達和晝夜節(jié)律紊亂是導致癌癥、內(nèi)分泌疾病、心血管疾病和抑郁癥等諸多疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因[3,7]。

PER1是重要的生物鐘基因之一[4-5]。PER1在頭頸部癌、前列腺癌和乳腺癌等多種實體癌中表達降低[11-12]，PER1表達降低可導致細胞增殖和凋亡平衡失調(diào)，促進細胞惡性轉(zhuǎn)變[7-8,13]。本課題組前期研究也證明：PER1 mRNA和蛋白在口腔鱗狀細胞癌（以下簡稱鱗癌）中的表達顯著低于癌旁組織，沉默口腔鱗癌SCC15細胞中PER1后導致下游眾多細胞周期基因表達改變，癌細胞增殖能力增強[2,11]。PER1在癌癥中表達降低后通過調(diào)控下游眾多細胞周期基因的改變，從而與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10,13]。PER1在癌細胞中表達降低對其本身生物鐘基因網(wǎng)絡中的其他生物鐘基因表達的影響目前還不清楚。本研究通過沉默人口腔鱗癌SCC15細胞中PER1后，全面檢測生物鐘基因網(wǎng)絡中PER2、PER3、DEC1、DEC2、CRY1、CRY2、TIM、RORA、NPAS2和REV-ERBA mRNA的表達改變。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、熒光定量PCR儀（S1000TM Thermal Cycler）（Bio-Rad公司，美國），RNAiso Plus試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），QIAGEN質(zhì)粒抽提試劑盒和QIAGEN質(zhì)粒包裝試劑盒（Qiagen公司，德國），BCA蛋白濃度測定試劑盒（Sigma公司，美國），人口腔鱗癌SCC15細胞和293T細胞（重慶醫(yī)科大學生命科學院）。

1.2 短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

根據(jù)人PER1 mRNA序列（Genbank Accession：NM_002616.2），用Reynolds A對照篩選原則[14]，篩選獲得PER1基因的3個不同干擾靶點，即PER-Ⅰ：CAGCACCACTAAGCGTAAATG；PER1-Ⅱ：CCAGCACCACTAAGCGTAAAT；PER1-Ⅲ：CCATGGACATGTCCACCTATA。根據(jù)RNA干擾序列設計原則[14]，分別設計合成3條PER1干擾序列，即PER1-shRNA-Ⅰ、PER1-shRNA-Ⅱ和PER1-shRNA-Ⅲ（表1）。然后使用Age Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切，將載體質(zhì)粒PLKO.1酶切后行凝膠電泳并回收，用T4 DNA連接酶分別與PER1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ退火引物鏈接，構(gòu)建PER1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ慢病毒質(zhì)粒。以不含任何干擾基因片段的scramble質(zhì)粒為陰性對照（Control-shRNA）。將以上慢病毒質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5A，接種于含氨基核苷類抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，然后按照Qiagen質(zhì)粒抽提說明書提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR反應后將擴增產(chǎn)物行DNA測序，測序結(jié)果用軟件Chromas V2.4（Technelysium公司，美國）進行分析鑒定。

1.3 shRNA的包裝

根據(jù)QIAGEN質(zhì)粒包裝試劑盒說明書進行操作，簡述如下：將1 mL DMEM、10 μL質(zhì)粒、10 μL慢病毒包裝混合質(zhì)粒（Lenti-HG Mix）和60 μL核酸轉(zhuǎn)染劑（HG transgene reagent）在室溫下混合20 min后，轉(zhuǎn)移至細胞密度為70%～80%的293T細胞培養(yǎng)皿中，12 h后滴加120 μL 100×Enhancing buffer。培養(yǎng)48 h后用孔徑為0.45 μm的過濾器過濾293T細胞，獲上清液，即為質(zhì)粒病毒液，分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PER1-shRNA質(zhì)粒病毒感染SCC15細胞及沉默PER1基因

將對數(shù)生長期的SCC15細胞均勻接種于六孔板中（編號1～6），加入1.5 mL含10%胎牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)液，第1～4孔先加2.5 μL聚凝胺（polybrene），然后分別加入500 μL的PER1-shRNA-Ⅰ、PER1-shRNA-Ⅱ、PER1-shRNA-Ⅲ、Control-shRNA質(zhì)粒病毒液，第5和第6孔只加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液500 μL，培養(yǎng)24 h（37 ℃，5%CO2）后更換培養(yǎng)液（第1～5孔為含濃度為2 μg·mL-1的嘌呤霉素DMEM/ F12培養(yǎng)液，第6孔為DMEM/F12培養(yǎng)液），每日更換培養(yǎng)液，連續(xù)7 d后獲得PER1穩(wěn)定干擾的SCC15細胞。實驗分為5組：PER1-shRNA-Ⅰ組、PER1-shRNA-Ⅱ組、PER1-shRNA-Ⅲ組、Control-shRNA組和SCC15組，分別轉(zhuǎn)染PER1-shRNA-Ⅰ、PER1-shRNA-Ⅱ、PER1-shRNA-Ⅲ和Control-shRNA質(zhì)粒病毒的SCC15細胞以及未做任何處理的SCC15 細胞。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

將對數(shù)生長期的SCC15細胞用RIPA裂解液裂解30 min，然后用細胞刮刀收集后離心（12 000 r·min-1，4 ℃）5 min，收集上清液。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取50 μg蛋白的樣品溶液行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后凝膠濕轉(zhuǎn)PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，然后加入一抗為兔抗人PER1多克隆抗體和鼠抗人GAPDH單克隆抗體，在室溫下?lián)u床孵育2 h，TBS洗膜3次后加入二抗為辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體，孵育2 h后洗膜3遍。暗室下將ECL發(fā)光液滴加在PVDF膜上，化學發(fā)光儀曝光后用凝膠成像系統(tǒng)拍照并測量條帶灰度值。計算PER1和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值比值。實驗重復3次。

1.6 流式細胞儀檢測

將對數(shù)生長期的SCC15細胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單細胞懸液，用PBS調(diào)整細胞濃度為1× 106個·mL-1。1）細胞增殖檢測：將1 mL細胞懸液離心（4 ℃，800 r·min-1）5 min后棄上清液，然后加入-20 ℃、70%的乙醇1 mL，反復吹打混勻后于4 ℃過夜固定。固定后的細胞用PBS洗滌2遍后用1 mL PBS重懸，然后加入1 mL碘化丙啶染液，4 ℃避光30 min。用流式細胞儀檢測，細胞增殖指數(shù)=（S+ G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。2）細胞凋亡檢測：取1 mL單細胞懸液用70%的乙醇固定2 h，換用0.5 mL結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）重懸細胞，然后加入200 μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光15 min后加入1 mL碘化丙啶染液混勻，室溫避光2 min。用流式細胞儀檢測，細胞凋亡指數(shù)=（凋亡細胞數(shù)/所測細胞總數(shù)）×100%。實驗重復3次。

1.7 實時熒光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測

根據(jù)RNAiso Plus試劑盒說明書提取細胞總RNA，用核酸蛋白分析儀檢測波長在260 nm和280 nm處的光密度值，計算RNA濃度和純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。Oligo7.0軟件（DBA Oligo公司，美國）設計目的基因引物序列，合成目的基因CLOCK、BMAL1、PER1、PER2、PER3、DEC1、DEC2、CRY1、CRY2、TIM、CKIE、RORA、NPAS2、REV-ERBA和內(nèi)參β-actin的引物（表2）。反應體系為：2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，濃度均為0.4 μmol·L-1的上游引物和下游引物各1 μL，濃度為50 ng·μL-1的DNA 模板2 μL，滅菌滅酶蒸餾水8.5 μL。反應條件均為：95 ℃預變性90 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，擴增40個循環(huán)，60 ℃延伸時采集熒光信號，2-ΔΔCt法計算各基因mRNA表達。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行分析，組間比較進行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。

表 2 各生物鐘基因qRT-PCR引物序列Tab 2 Primer sequences for clock genes used for qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 shRNA慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建和測序

PER1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ慢病毒載體質(zhì)粒DNA的測序結(jié)果見圖1。

圖 1 PER1-shRNA慢病毒載體質(zhì)粒DNA測序結(jié)果Fig 1 The sequencing atlas of PER1-shRNA recombinant plasmids

PER1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ慢病毒載體質(zhì)粒DNA與設計的寡核苷酸干擾靶點組合序列的PER1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ正義鏈一致，證明3條PER1-shRNA質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 SCC15細胞感染shRNA質(zhì)粒病毒后PER1蛋白和mRNA的表達

PER1-shRNA-Ⅰ～Ⅲ、Control-shRNA和SCC15組中，PER1蛋白表達分別為0.18±0.07、0.61±0.06、0.56±0.06、1.14±0.05和1.18±0.13（圖2）；PER1 mRNA表達分別為0.22±0.05、0.56±0.07、0.63±0.11、0.94±0.20和1.12±0.10。PER1-shRNA-Ⅰ組細胞中PER1 mRNA和蛋白的表達均低于其他組（P＜0.05）。表明PER1-shRNA-Ⅰ組對PER1的干擾效果最明顯。

圖 2 Western blot 檢測5組細胞PER1蛋白的表達Fig 2 The protein expression of PER1 in fi ve groups by Western blot

2.3 PER1基因沉默后SCC15細胞的增殖和凋亡

PER1-shRNA-Ⅰ組細胞的增殖指數(shù)高于ControlshRNA組和SCC15組（P＜0.05），凋亡指數(shù)低于Control-shRNA組和SCC15組（P＜0.05）；ControlshRNA組與SCC15組細胞的增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖3）。

圖 3 PER1沉默后SCC15細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果Fig 3 Flow cytometry results after PER1 knockdown in SCC15 cells

2.4 PER1沉默后SCC15細胞內(nèi)生物鐘基因的表達

qRT-PCR檢測顯示：PER1-shRNA-Ⅰ組細胞中PER3、TIM、RORA和REV-ERBA mRNA的表達水平高于Control-shRNA組和SCC15組（P＜0.05），而PER1、PER2、DEC1、DEC2、CRY1、CRY2和 NPAS2 mRNA的表達水平降低（P＜0.05）；ControlshRNA組和SCC15組細胞中各基因mRNA的表達水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；CLOCK、BMAL1和CKIE mRNA的表達水平在3組中均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖4）。

圖 4 沉默PER1后SCC15細胞中生物鐘基因mRNA的表達Fig 4 Levels of mRNA expression of clock genes in SCC15 cells after PER1 knockdown

3 討論

目前已證明生物鐘基因PER1在多種癌癥中表達降低，并通過對下游眾多細胞周期基因的調(diào)控，從而與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-13]。PER1作為重要生物鐘基因之一[4-5]，PER1在癌癥中表達降低是否導致生物鐘基因網(wǎng)絡中其他生物鐘基因表達的改變？目前對這個問題還不清楚。

研究[4-6]表明：正常細胞內(nèi)生物鐘基因之間在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平主要包括3條正負反饋環(huán)路的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。3條正負反饋環(huán)路中的正反饋因子均為CLOCK和BMAL1結(jié)合形成的CLOCK/BMAL1異二聚體，作為轉(zhuǎn)錄因子激活PERs、CRYs、DECs、REV-ERBA和RORA基因的轉(zhuǎn)錄，啟動這些基因的表達，形成正反饋通路；而形成的PERs和CRYs結(jié)合為異二聚體發(fā)生核轉(zhuǎn)移與CLOCK/BMAL1結(jié)合抑制CLCOK/ BMAL1活性，反饋性降低其轉(zhuǎn)錄激活作用，形成第一條負反饋通路，這條通路也是主要的通路。其次，DEC1和DEC2結(jié)合形成二聚體或異二聚體，作為轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)運至核內(nèi)與CLCOK/BMAL1具有競爭性結(jié)合作用，從而降低CLOCK/BMAL1的轉(zhuǎn)錄激活作用，形成第二條負反饋通路；REV-ERBA和RORA轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，分別抑制和促進BMAL1的表達，形成第三條負反饋通路。本研究中，沉默SCC15癌細胞中PER1后，正反饋因子CLOCK和BMAL1 mRNA表達水平?jīng)]有顯著改變，提示在轉(zhuǎn)錄水平上CLOCK和BMAL1不受PER1的調(diào)控。Lee等[15]報道：在哺乳動物正常肝細胞，生物鐘反饋環(huán)路中CLOCK/BMAL1具有能保持持續(xù)穩(wěn)定水平的特點，CLOCK/BMAL1的正向調(diào)控功能是通過發(fā)生核轉(zhuǎn)移作為轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮作用，因此，筆者推測在癌細胞中PER1的表達改變也是通過調(diào)控CLOCK/BMAL1的活性或在細胞內(nèi)的分布來實現(xiàn)的，而不是表達水平的改變。

從以上正常細胞內(nèi)生物鐘基因的反饋環(huán)路來看，當PER1表達減低時，由于降低了對正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子CLOCK/BMAL1的抑制作用，導致CLOCK/BMAL1轉(zhuǎn)錄激活作用增強，因而負向調(diào)控基因PER2、PER3、CRY1、CRY2、DEC1、DEC2、REV-ERBA和RORA的表達應該升高。Zheng等[9]報道在PER1缺陷的小鼠體內(nèi)，PER2蛋白表達升高。Richards等[16]發(fā)現(xiàn)在小鼠正常肝細胞和內(nèi)皮細胞中敲除PER1能導致CRY2 mRNA和蛋白表達上調(diào)。本研究證明：在SCC15細胞中沉默PER1后，負向調(diào)控基因中只有PER3、REVERBA和RORA mRNA的表達升高，符合已知的正常細胞內(nèi)生物鐘基因正負反饋調(diào)節(jié)特點，而其他負向調(diào)控基因PER2、CRY1、CRY2、DEC1、DEC2 mRNA的表達反而顯著降低，這與正常細胞內(nèi)生物鐘基因正負反饋調(diào)節(jié)特點不符。筆者推測原因是：首先，先前的研究均是正常細胞，而本研究是癌細胞，可能在癌細胞中生物鐘基因正負反饋通路網(wǎng)絡的調(diào)控作用發(fā)生變化，也可能在癌細胞中出現(xiàn)了其他補充調(diào)控途徑。另外，在癌細胞中，可能還存在其他調(diào)控生物鐘基因表達的因素，導致生物鐘基因的反饋環(huán)路出現(xiàn)異常。

本研究還發(fā)現(xiàn)癌細胞中沉默PER1后，生物鐘基因TIM和NPAS2 mRNA分別顯著升高和降低。目前已知的正常細胞內(nèi)生物鐘基因反饋環(huán)路中未包括TIM[4-6]。本研究發(fā)現(xiàn)在癌細胞中沉默PER1后TIM mRNA表達升高，這表明TIM也可能是生物鐘基因反饋環(huán)路中的因子之一。NPAS2是CLOCK的同源類似物，能與BMAL1結(jié)合形成NPAS2/BMAL1異二聚體，NPAS2/BMAL1的功能與CLOCK/BMAL1相似，主要對CLOCK/BMAL1具有代償作用，本研究沉默PER1后NPAS2 mRNA表達顯著降低，提示在癌細胞中PER1沉默后，NPAS2/BMAL1對CLOCK/ BMAL1的代償作用減弱。

目前認為PER1的表達變化導致下游眾多的細胞周期基因改變，從而導致腫瘤的發(fā)生[10,13]。本研究進一步發(fā)現(xiàn)在癌細胞中PER1對生物鐘基因網(wǎng)絡中PER2、PER3、CRY1、CRY2、DEC1、DEC2、TIM、RORA、REV-ERBA和NPAS2基因也具有重要的調(diào)控作用，證明了PER1對癌癥發(fā)生發(fā)展的影響并非通過單一對下游鐘控基因的調(diào)控，而同時對生物鐘基因網(wǎng)絡本身也具有調(diào)控作用。

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（本文編輯 李彩）

Effect of clock gene PER1 knockdown on clock gene networks in human oral squamous cell carcinoma

Zhao Qin, Ao Yiran, Yang Kai, Su Xiaoli, Lü Xiaoqiang. (Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, The First Affi liated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

Objective This study investigated the effect of clock gene PER1 on the expression levels of other clock genes in clock gene networks in oral squamous cell carcinoma cells. Methods We used RNA interference mediated by short hairpin RNAs (shRNAs) to effectively knock down PER1 in SCC15 human oral squamous cell carcinoma cells. Flow cytometry was used to detect the degree of proliferation and apoptosis of the cells after PER1 knockdown, and quantitative real-time PCR was used to detect the mRNA expression levels of the clock genes CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, PER3, DEC1, DEC2, CRY1, CRY2, TIM, CKIE, RORA, NPAS2, and REV-ERBA. Results The proliferation index of SCC15 cells increased signifi cantly while the apoptotic index decreased signifi cantly after PER1 knockdown (P＜0.05). The mRNA expression levels of PER1, PER2, DEC1, DEC2, CRY1, CRY2, and NPAS2 markedly decreased (P＜0.05) while those of PER3, TIM, RORA, and REV-ERBA markedly increased (P＜0.05). By contrast, no obvious changes were observed in the mRNA expression levels of CLOCK, BMAL1, and CKIE (P＞0.05). Conclusion The clock gene PER1 can regulate the expression levels of other clock genes in the clock gene networks; these genes include PER2, DEC1, DEC2, CRY1, CRY2, NPAS2, PER3, TIM, RORA, and REV-ERBA. PER1 gene thus plays an important role in the regulation of clock gene networks.

circadian clock; squamous cell carcinoma; oral cavity; gene

R 739.8

A

10.7518/hxkq.2017.01.008

2016-07-10；

2016-09-10

趙欽，碩士，E-mail：zhaoqinzxc123@163.com

楊凱，教授，博士，E-mail：cqfyyk@aliyun.com

Correspondence: Yang Kai, E-mail: cqfyyk@aliyun.com.