李坤趙艷紅徐晨王連永楊強(qiáng)李洪發(fā)滕彬宏

1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，天津 300070；2.煙臺市口腔醫(yī)院正畸科，煙臺 264000；3.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071；4.天津市天津醫(yī)院脊柱外科，天津 300211

基于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的取向支架的制備及評價

李坤1,2趙艷紅1徐晨1王連永3楊強(qiáng)4李洪發(fā)1滕彬宏1

1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科，天津 300070；2.煙臺市口腔醫(yī)院正畸科，煙臺 264000；3.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物活性材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071；4.天津市天津醫(yī)院脊柱外科，天津 300211

目的 制備軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（CECM）取向多孔支架，評價其理化特性及對脂肪干細(xì)胞（ADSCs）的相容性。方法 切取新鮮豬關(guān)節(jié)軟骨片，勻漿后離心篩選出直徑50～500 nm左右的軟骨纖維，經(jīng)Triton X-100脫細(xì)胞后制備成濃度6%的CECM漿料，通過定向結(jié)晶和冷凍干燥后交聯(lián)即得CECM取向支架。對CECM取向支架的理化性能和細(xì)胞相容性進(jìn)行評價。結(jié)果 CECM取向支架橫斷面為均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔壁上密布軟骨纖維，縱斷面為垂直管狀結(jié)構(gòu)；支架呈蘇木精-伊紅紅染，甲苯胺藍(lán)、番紅O、天狼星紅染色均呈陽性；支架孔隙率、吸水率和縱向壓縮彈性模量分別為95.455%±0.910%、95.889%±1.071%和（40.208±5.097）kPa；ADSCs在支架上黏附和增殖，并均勻長入支架孔隙內(nèi)。結(jié)論 CECM取向支架的成分與天然軟骨相似，生物相容性良好，孔隙結(jié)構(gòu)、孔徑大小適于種子細(xì)胞黏附、增殖和長入，是一種比較理想的軟骨組織工程支架。

軟骨； 細(xì)胞外基質(zhì)； 取向支架； 組織工程； 定向結(jié)晶； 冷凍干燥

由創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等引起的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨組織缺損是臨床較常見的疾患。由于軟骨組織退變呈漸進(jìn)性發(fā)展且自身修復(fù)能力極為有限，目前應(yīng)用于臨床的多種治療方法如手術(shù)、軟骨移植等均不能達(dá)到令人滿意的治療效果。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，組織工程化軟骨修復(fù)展現(xiàn)了其良好的臨床應(yīng)用前景[1]。

軟骨組織工程主要包括支架材料、種子細(xì)胞和信號因子三要素[2]，其中，支架材料是組織工程構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。理想的組織工程軟骨支架材料應(yīng)具有以下特征[4-6]：良好的生物相容性；促進(jìn)細(xì)胞黏附與增殖；適當(dāng)?shù)目山到庑?；接近于正常關(guān)節(jié)軟骨的組織結(jié)構(gòu)等。然而，目前尚未有一種支架材料能滿足以上全部特征。支架作為種子細(xì)胞的載體，不僅影響種子細(xì)胞的增殖與分化，而且還決定移植后能否與組織有效的結(jié)合，從而發(fā)揮其修復(fù)病變軟骨組織的作用。因此，開發(fā)性能優(yōu)異的支架材料是軟骨組織工程的突破點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（cartilage extracellular matrix，CECM）為材料，采用定向結(jié)晶及冷凍干燥技術(shù)，成功制備出取向性的仿生軟骨支架，并對其理化特性及與脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的相容性進(jìn)行了系列評價。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要材料、試劑及設(shè)備

新鮮豬關(guān)節(jié)軟骨購于天津市屠宰場；Triton X-100、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、DNase I、RNase A、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、碳二亞胺[1-ethyl-3-（3-dimethyllaminopropyl） carbodiimide，EDAC]、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy-succinamide，NHS）（Sigma-Aldrich公司，美國），膠原檢測試劑盒、糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）檢測試劑盒（Biocolor公司，英國），胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco公司，美國），Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（Dojinko公司，日本），Live/Dead染料（Life Technologies公司，美國），5810R型低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國），F(xiàn)P40-HE型加熱制冷恒溫循環(huán)器（Julabo公司，德國），F(xiàn)D-1型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 豬CECM取向支架的制備

1.2.1 CECM凍干海綿的制備 切取新鮮豬關(guān)節(jié)軟骨片，采用pH7.5、0.01 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（含0.035 mmol·L-1PMSF）浸泡軟骨片并以組織粉碎機(jī)粉碎為勻漿后，3 500 r·min-1離心15 min，提取上清液，沉淀繼續(xù)于Tris-HCl緩沖液中粉碎勻漿，反復(fù)勻漿、離心數(shù)次，直至離心后無沉淀或僅有少量沉淀。將提取的上清液9 000 r·min-1離心15 min后棄去上清，所剩沉淀即為直徑50～500 nm的軟骨纖維。加入pH7.5的含1%TritonX-100的Tris-HCl緩沖液（含0.035 mmol·L-1PMSF）混勻，在4 ℃下振蕩脫細(xì)胞12 h，9 000 r·min-1離心15 min后蒸餾水反復(fù)沖洗。加入含50 U·mL-1DNase Ⅰ與1 U·mL-1RNase A的酶消化緩沖液混勻，37 ℃下振蕩消化12 h，9 000 r·min-1離心15 min后超純水反復(fù)沖洗，冷凍干燥后即得到CECM凍干海綿，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CECM取向支架的制備及交聯(lián) 用超純水溶解CECM凍干海綿并配制為濃度6%的漿料后加入圓柱型聚丙烯模具（直徑15 mm，高30 mm，厚度1 mm），離心去氣泡，模具周圍以聚苯乙烯保溫材料包裹，底部暴露。將裝有CECM漿料的模具與保溫材料置于預(yù)冷至-20 ℃的循環(huán)冷卻液表面，使模具底部與循環(huán)冷卻液接觸，從而形成由模具頂部到底部的溫度梯度差，使CECM漿料由模具底部至頂部定向結(jié)晶，12 h后將模具及CECM轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中冰相升華干燥24 h定型支架，取出模具內(nèi)支架浸泡于含50 mmol·L-1EDAC和20 mmol·L-1NHS的無水乙醇中37 ℃下交聯(lián)24 h，用超純水洗3 d，每天換水10次，然后50 ℃真空干燥箱內(nèi)干燥12 h，將支架切成直徑5 mm、高2.5 mm的圓柱狀（圖1），輻照滅菌備用。

圖 1 CECM取向支架大體觀察Fig 1 The general observation of CECM oriented scaffold

1.3 CECM取向支架與兔ADSCs的復(fù)合

滅菌后的CECM取向支架置于12孔板中，每孔一個支架。將第三代兔ADSCs調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5× 106個·mL-1，吹勻。用1 mL注射器將細(xì)胞懸液注入支架內(nèi)部至支架飽和，接種后將支架-細(xì)胞復(fù)合體移至37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，翻轉(zhuǎn)支架后繼續(xù)孵育1 h，每孔加入2 mL含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合體。

1.4 CECM取向支架理化性能評價

掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察：分別切取厚度為0.5 mm的CECM取向支架橫斷面和縱斷面，表面噴金處理后SEM觀察。

支架組織學(xué)染色：將支架于二甲苯中透明30 min后常規(guī)石蠟包埋，厚度10 μm橫斷切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）、甲苯胺藍(lán)、番紅O和天狼星紅染色觀察。

支架生化成分定量分析：將支架以胰蛋白酶完全消化后，分別以膠原檢測試劑盒和糖胺聚糖檢測試劑盒定量分析支架中總膠原含量和總糖胺聚糖含量（以牛硫酸軟骨素作為標(biāo)準(zhǔn)品）。

支架孔隙率測定：利用無水乙醇法測試支架的孔隙率。測試3次，取平均值。

支架吸水率測定：取支架5個浸于超純水中，接真空泵抽吸脫氣至無氣泡逸出，取出后擦凈支架表面水分，稱得質(zhì)量m，然后將支架在50 ℃的真空干燥箱內(nèi)干燥12 h，取出后稱得質(zhì)量m0，吸水率X=（m-m0）/m。測試3次，取平均值。

支架力學(xué)性能測定：利用微材料力學(xué)測試系統(tǒng)檢測支架的縱向壓縮彈性模量，繪制支架應(yīng)力—應(yīng)變曲線。測試3個支架，取平均值。

1.5 CECM取向支架細(xì)胞相容性評價

支架浸提液毒性檢測：以含有10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基浸泡支架48 h制備支架浸提液，取第一代兔ADSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將200 μL細(xì)胞密度為1.0× 104個·mL-1的細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，待細(xì)胞貼壁后加入支架浸提液培養(yǎng)（支架浸提液組），以含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基作為對照組，連續(xù)培養(yǎng)7 d，分別在培養(yǎng)1、3、5、7 d后采用CCK-8試劑盒檢測其對細(xì)胞增殖的影響。

細(xì)胞-支架復(fù)合體活-死（Live/Dead）細(xì)胞染色：細(xì)胞-支架復(fù)合體培養(yǎng)7 d后取出，加入Live/Dead染液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞活性。

細(xì)胞-支架復(fù)合體SEM觀察：細(xì)胞-支架復(fù)合體培養(yǎng)48 h后取出，固定、脫水，干燥后切為厚度0.5 mm的薄片，表面噴金處理后SEM觀察。

細(xì)胞-支架復(fù)合體組織學(xué)染色：細(xì)胞-支架復(fù)合體培養(yǎng)7 d后取出，固定、脫水、二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，厚度10 μm切片，HE染色觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CECM取向支架的SEM觀察

SEM下可見，支架橫斷面呈均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑100～200 μm（圖2A），孔壁上密布軟骨纖維（圖2C、D，箭頭所示）；支架縱斷面呈垂直取向的管狀結(jié)構(gòu)，管徑100～200 μm，孔隙之間連通性好（圖2B）。

圖 2 CECM取向支架 SEMFig 2 CECM oriented scaffold SEM

2.2 CECM取向支架的組織學(xué)染色觀察

組織學(xué)染色可見，支架HE單純紅染，無藍(lán)染（圖3A），表明CECM材料中已無完整的細(xì)胞及細(xì)胞核；甲苯胺藍(lán)、番紅O、天狼星紅染色均呈陽性（圖3B、C、D），表明CECM取向支架含有蛋白多糖、膠原成分，與天然軟骨成分相似。

圖 3 CECM取向支架組織學(xué)染色觀察 × 50Fig 3 The histological staining observation of CECM oriented scaffold × 50

2.3 CECM取向支架的生化成分定量分析

生化成分定量分析結(jié)果顯示，空支架本身含有膠原和糖胺聚糖成分，其含量（樣品濕重）分別為（8.73±0.26）μg·mg-1和（1.66±0.14）μg·mg-1，表明關(guān)節(jié)軟骨組織中的天然膠原和糖胺聚糖成分被保留下來。

2.4 CECM取向支架的孔隙率、吸水率及力學(xué)特性

CECM取向支架的孔隙率為95.455%±0.910%，吸水率為95.889%±1.071%；濕潤狀態(tài)下支架縱向壓縮彈性模量為（40.208±5.097） kPa（圖4）。

2.5 CECM取向支架的細(xì)胞相容性相關(guān)檢測

支架浸提液CCK-8檢測結(jié)果（圖5A）顯示：不同時間點(diǎn)支架浸提液對兔ADSCs的增殖與對照組相比無明顯差異（P>0.05），表明支架浸提液無細(xì)胞毒性。Live/Dead細(xì)胞染色結(jié)果（圖5B）顯示：復(fù)合體培養(yǎng)7 d后，支架上的細(xì)胞均顯綠色熒光（活細(xì)胞），無紅色熒光（死細(xì)胞）；SEM觀察細(xì)胞-支架復(fù)合體（圖5C），可見細(xì)胞貼附支架孔壁生長并分泌細(xì)胞外基質(zhì)；細(xì)胞-支架復(fù)合體HE染色（圖5D）可見，復(fù)合培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞在支架孔隙內(nèi)分布均勻，表明支架孔隙結(jié)構(gòu)適于細(xì)胞的黏附、長入。

圖 4 CECM取向支架的應(yīng)力—應(yīng)變曲線Fig 4 The stress strain curve of CECM oriented scaffold

圖 5 CECM取向支架的細(xì)胞相容性相關(guān)檢測Fig 5 The biocompatibility detection of CECM oriented scaffold

3 討論

可用于軟骨組織工程支架構(gòu)建的材料主要有合成材料、天然生物材料、復(fù)合材料等[7]。早期應(yīng)用于軟骨組織工程的支架材料主要為合成材料，如聚羥基乙酸[8]、聚乳酸[9]、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物[10-11]等。由于合成材料生物相容性較差，容易引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng)以及體內(nèi)降解產(chǎn)物偏酸性可能引起炎癥等缺點(diǎn)，臨床應(yīng)用價值有限。天然生物材料最突出的優(yōu)點(diǎn)是抗原性低，與正常組織細(xì)胞外基質(zhì)成分相似，能夠參與組織愈合過程，有效地克服了合成材料的不足之處；因而天然生物材料是軟骨組織工程中極具發(fā)展前景和臨床應(yīng)用價值的一類支架材料。

因?yàn)樨i在解剖學(xué)、生理學(xué)特性、發(fā)病機(jī)理、營養(yǎng)代謝等方面與人極其相似而備受組織工程界的青睞，并且豬關(guān)節(jié)軟骨來源廣泛、成本低廉、生物安全性高[12]，因此，本實(shí)驗(yàn)選用豬關(guān)節(jié)軟骨作為支架的材料來源。未經(jīng)處理的豬關(guān)節(jié)軟骨含有細(xì)胞成分，具有抗原性，體內(nèi)移植可能引起免疫排斥反應(yīng)，對此，本實(shí)驗(yàn)采用作用柔和的去垢劑Triton X-100[13-14]對其進(jìn)行脫細(xì)胞處理后，去除了大部分抗原性并保留了關(guān)節(jié)軟骨的天然成分如膠原、蛋白多糖、生長因子等[15-16]，這些天然成分能夠?yàn)榉N子細(xì)胞提供高度仿生的生化環(huán)境并對干細(xì)胞產(chǎn)生定向誘導(dǎo)分化作用[17-18]。既往國內(nèi)外有對整塊軟骨組織脫細(xì)胞后應(yīng)用于組織工程的相關(guān)報(bào)道[19-20]，但塊狀的脫細(xì)胞軟骨存在脫細(xì)胞不徹底、孔隙過小和孔隙連通性差不利于種子細(xì)胞長入和遷徙等缺陷，而本實(shí)驗(yàn)中超微勻漿、定向結(jié)晶和冷凍干燥再成型技術(shù)的結(jié)合，有效地彌補(bǔ)了上述缺陷。

超微勻漿技術(shù)徹底破壞關(guān)節(jié)軟骨原有的物理結(jié)構(gòu)，形成軟骨纖維脫細(xì)胞更加徹底，經(jīng)進(jìn)一步冷凍干燥而成CECM凍干海綿，方便保存和配制。超微勻漿過程為單純物理變化過程，能夠在極大限度上保留關(guān)節(jié)軟骨的天然成分，這是在Jia等[21]的物理粉碎與化學(xué)消化結(jié)合法基礎(chǔ)上的優(yōu)化。對于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)凍干海綿的重溶過程，姚軍等[22]采用了稀鹽酸重溶法，而由于本實(shí)驗(yàn)所制備的CECM凍干海綿結(jié)構(gòu)更加微細(xì)，超純水即可完全重溶，從而進(jìn)一步避免了酸對天然軟骨成分的破壞；定向結(jié)晶技術(shù)即在體系中建立一定的溫度梯度差，使CECM漿料中水分能逆著溫度梯度差的方向結(jié)晶生長，從而控制冰晶在體系中的形成方向；冷凍干燥后，冰晶升華，留下的空隙即為支架的孔隙結(jié)構(gòu)。為了控制支架的孔隙率和吸水率，將CECM漿料濃度調(diào)節(jié)為6%，定向結(jié)晶溫度梯度最低值控制在-20 ℃，經(jīng)過此流程制備而成的取向性CECM支架孔隙率和吸水率均在95%以上，孔隙連通性好，滿足軟骨組織工程對支架結(jié)構(gòu)的要求。

軟骨支架作為種子細(xì)胞再生組織的模板，具有搭載種子細(xì)胞并引導(dǎo)種子細(xì)胞及其分泌的新生細(xì)胞外基質(zhì)的積累排列，最終決定新生組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及功能的作用[23]，因此，在結(jié)構(gòu)上高度仿生也是軟骨組織工程對軟骨支架的另一要求。早期國內(nèi)外對軟骨組織工程支架的研究多局限于制備成無規(guī)則的、隨機(jī)排列的孔隙結(jié)構(gòu)，而本實(shí)驗(yàn)方法所制備的軟骨支架具備類似于正常關(guān)節(jié)軟骨垂直于關(guān)節(jié)面的柱狀組織排列結(jié)構(gòu)，在結(jié)構(gòu)上達(dá)到了高度仿生的要求。此外，由于解剖部位的特殊性，顳下頜關(guān)節(jié)軟骨組織通常需承受相當(dāng)?shù)妮d荷來支持關(guān)節(jié)的活動，因而軟骨支架的力學(xué)特性也應(yīng)盡量接近于正常關(guān)節(jié)軟骨組織，具有足夠的載荷能力，而垂直取向的結(jié)構(gòu)同時也大大提高了軟骨支架本身的縱向抗壓縮性能，這對于在新生軟骨組織形成、成熟前支架能夠?yàn)榉N子細(xì)胞提供足夠的修復(fù)空間以及保護(hù)種子細(xì)胞有重要意義。

種子細(xì)胞是缺損組織修復(fù)再生的細(xì)胞來源，種子細(xì)胞的持續(xù)增殖、分化以及其細(xì)胞外基質(zhì)的積累使得缺損組織能夠修復(fù)、再生。早期應(yīng)用于軟骨組織工程研究的種子細(xì)胞多為終末分化的組織細(xì)胞，然而這類細(xì)胞在分離培養(yǎng)、增殖潛能等方面均存在著一定的困難和缺陷，因而對干細(xì)胞誘導(dǎo)分化已經(jīng)成為當(dāng)今軟骨組織工程研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。ADSCs是一種以極小的手術(shù)創(chuàng)傷即可大量獲得的自體干細(xì)胞，且其定向成軟骨誘導(dǎo)潛能已被國內(nèi)外研究所證實(shí)。本研究結(jié)果表明CECM取向支架對ADSCs具有良好的相容性，為進(jìn)一步探討以CECM取向支架搭載自體ADSCs構(gòu)建組織工程化軟骨的可行性奠定了基礎(chǔ)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)成功制備了豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來源的取向性軟骨支架，結(jié)構(gòu)上具有一定仿生性，理化性能優(yōu)良，生物相容性好，是一種比較理想的軟骨組織工程支架。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步結(jié)合動物實(shí)驗(yàn)，探索其構(gòu)建組織工程軟骨及體內(nèi)再生修復(fù)軟骨損傷的生物可行性。

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（本文編輯 李彩）

Development and characterization of oriented scaffolds derived from cartilage extracellular matrix

Li Kun1,2, Zhao Yanhong1, Xu Chen1, Wang Lianyong3, Yang Qiang4, Li Hongfa1, Teng Binhong1. (1. Dept. of Orthodontics, Stomatological Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2. Dept. of Orthodontics, Yantai Stomatological Hospital, Yantai 264000, China; 3. The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China; 4. Dept. of Spine Surgery, Tianjin Hospital, Tianjin 300211, China)
Supported by: The National Natural Science Foundation of China (31300798, 31470937, 81572154); The Key Project of Science and Technology Research of Tianjin Health Bureau (15KG125, 16KG114).

Objective This study aimed to prepare oriented scaffolds derived from a cartilage extracellular matrix (CECM) and to investigate their physicochemical property and compatibility with adipose-derived stem cells (ADSCs). Methods A fresh porcine articular cartilage was cut into pieces. Cartilage nanofi bers with diameters of 50–500 nm were collected through homogenization and centrifugation. These nanofi bers were then decellularized by using Triton X-100 to produce 6% CECM. The oriented scaffolds derived from the nanoscale CECM were fabricated through unidirectional solidifi cation and lyophilization. Afterward, these scaffolds were crosslinked. The physical and chemical performances and cell compatibility of CECM-oriented scaffolds were evaluated. Results The cross-sections of the scaffolds contained homogeneous reticular porous structures with nanofi bers on the walls of the pores, and the longitudinal sections revealed vertical tubular structures. Hematoxylin–eosin staining revealed that the scaffolds were red without blue. Toluidine blue, safranin O, and Sirius red staining showed positive results. The porosity, water absorption rate, and vertical compressive elastic modulus of the scaffolds were 95.455%± 0.910%, 95.889%±1.071%, and (40.208±5.097) kPa, respectively. Conclusion The components of the oriented scaffolds derived from CECM are similar to those of native cartilage with favorable biocompatibility. The porous structures and sizes of the scaffolds are suitable for the adhesion, proliferation, and infiltration of ADSCs. The oriented scaffolds derived from CECM are relatively optimal for cartilagetissue engineering.

cartilage; extracellular matrix; oriented scaffolds; tissue engineering; unidirectional solidifi cation; lyophilization

Q 81

A

10.7518/hxkq.2017.01.007

2016-06-20；

2016-08-10

國家自然科學(xué)基金（31300798，31470937，81572154）；天津市衛(wèi)生局科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（15KG125，16KG114）

李坤，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：likun_630216@163.com

趙艷紅，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：leafzh@126.com

Correspondence: Zhao Yanhong, E-mail:leafzh@126.com.