馬新欣，張躍力，王 曼，鄭東燕，薛曉培，朱夢(mèng)若，江文君

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科 上海醫(yī)學(xué)超聲研究所，上海 200233)

自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌應(yīng)變與心肌纖維化程度的相關(guān)性

馬新欣，張躍力*，王 曼，鄭東燕，薛曉培，朱夢(mèng)若，江文君

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科 上海醫(yī)學(xué)超聲研究所，上海 200233)

目的 探討自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左心室心肌應(yīng)變與心肌纖維化程度的關(guān)系。方法 選取10周齡雄性SHR及Wistar-Kyoto大鼠(WKY)各15只，均隨機(jī)平均分為3個(gè)亞組。12周后每2周行常規(guī)超聲及二維斑點(diǎn)追蹤顯像(2DSTE)，于左心室長(zhǎng)軸和乳頭肌水平短軸切面測(cè)量左心室整體縱向應(yīng)變(GLS)、徑向應(yīng)變(GRS)及周向應(yīng)變(GCS)峰值。分別于16、20、24周將SHR和WKY各取1個(gè)亞組處死，行心臟離體固定、Masson染色，觀察心內(nèi)膜下和心外膜下層心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)、血管周?chē)z原面積與管腔面積比率(PVCA/LA)。結(jié)果 與同周齡WKY相比，SHR的GLS自16周、GRS自18周、GCS自20周顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。SHR的GLS與心內(nèi)膜下CVF呈正相關(guān)(r=0.65，P<0.05)；GLS、GCS與PVCA/LA呈正相關(guān)(r=0.65、0.63，P均<0.05)，GRS與PVCA/LA呈負(fù)相關(guān) (r=-0.59，P<0.05)。結(jié)論 2DSTE技術(shù)可無(wú)創(chuàng)評(píng)價(jià)大鼠心肌形變，其與心肌纖維化程度具有良好的相關(guān)性。

超聲心動(dòng)描記術(shù)；高血壓；斑點(diǎn)追蹤應(yīng)變顯像；應(yīng)變；心肌纖維化

高血壓易致腦卒中、缺血性心臟病及心衰等嚴(yán)重并發(fā)癥，是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素[1]。高血壓可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)與功能改變，且二者間密切相關(guān)。心肌纖維化是高血壓性心臟病的病理基礎(chǔ)，易致心肌僵硬度增加、左心室舒張功能減退、心律失常甚至心衰[2]。對(duì)心肌纖維化程度的評(píng)價(jià)，有助于指導(dǎo)臨床治療和預(yù)測(cè)疾病轉(zhuǎn)歸。二維斑點(diǎn)追蹤應(yīng)變顯像(two-dimensional speckle tracking echocardiography, 2DSTE)能定量分析心臟整體和局部心肌的形變能力[3-4]。本研究探討采用2DSTE技術(shù)獲取的左心室心肌應(yīng)變參數(shù)在反映心肌纖維化程度方面的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertension rats， SHR)15只，隨機(jī)平均分為3個(gè)亞組，采用2%氯化鈉鹽飼。同周齡京都Wistar大鼠(Wistar-Kyoto rats， WKY)15只作為對(duì)照組，隨機(jī)平均分為3個(gè)亞組，采用2%氯化鈉鹽飼。適應(yīng)性喂養(yǎng)12周后，每隔2周測(cè)量大鼠血壓、心率和體質(zhì)量，并行超聲心動(dòng)圖檢查。

1.2儀器與方法 采用Philips iE33彩色多普勒超聲診斷儀，12S高頻探頭；TomTec超聲工作站，TomTec-Image Arena 4.0軟件；Olympus BX51顯微鏡。

對(duì)大鼠采用戊巴比妥鈉麻醉后左側(cè)臥位固定，胸前備皮，同步記錄胸導(dǎo)聯(lián)心電圖。調(diào)整超聲儀器使幀頻≥200幀/秒，獲取胸骨旁左心室長(zhǎng)軸切面(圖1A、1B)和左心室乳頭肌水平短軸切面，并連續(xù)采集1 s二維灰階動(dòng)態(tài)圖像。于常規(guī)左心室長(zhǎng)軸切面測(cè)量左心房?jī)?nèi)徑(left atrial diameter, LAD)。將M型超聲的取樣線置于左心室乳頭肌水平短軸切面獲取M型曲線，測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole, LVIDd)、室間隔厚度(interventricular spetal thickness, IVST)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness, LVPWT)，計(jì)算獲得相對(duì)室壁厚度(relative wall thickness, RWT)和左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)。

1.3圖像分析 將所存儲(chǔ)的動(dòng)態(tài)灰階圖像導(dǎo)入TomTec超聲工作站進(jìn)行脫機(jī)分析。于收縮末期停幀，手動(dòng)勾畫(huà)心內(nèi)膜邊界，生成ROI，觀察所勾畫(huà)邊界曲線能否自動(dòng)跟蹤內(nèi)膜，如不能實(shí)時(shí)跟蹤則手動(dòng)修正。軟件可自動(dòng)生成包含心室6個(gè)心肌節(jié)段的應(yīng)變-時(shí)間曲線及各節(jié)段應(yīng)變的平均曲線。分別于左心室胸骨旁長(zhǎng)軸切面和乳頭肌水平短軸切面的應(yīng)變-時(shí)間平均曲線上，測(cè)量左心室心肌收縮期整體周向應(yīng)變(global circumferential strain, GCS)、徑向應(yīng)變(global radial strain, GRS)和縱向應(yīng)變(global longitudinal strain, GLS)峰值(圖1)。

1.4大鼠心肌組織學(xué)分析 分別于16、20、24周超聲檢查后，將SHR和WKY各取1個(gè)亞組處死，離體心臟用10%緩沖甲醛固定液固定，取左心室游離壁中間段心肌進(jìn)行病理切片和Masson染色，顯微鏡下觀察以下指標(biāo)：①心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction, CVF)，于20倍鏡視野下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照保存，用Imagepro-Plus 6.0軟件調(diào)節(jié)保存圖像的灰度以區(qū)分膠原與非膠原成分，CVF=心肌膠原面積/(心肌總面積-空白面積)×100%，以反映心肌間質(zhì)中的心肌纖維化程度。以每張切片5個(gè)視野的平均值作為該標(biāo)本的CVF，其中膠原面積不包括血管周?chē)哪z原面積。②血管周?chē)z原面積/血管管腔面積(perivascular collagen area to luminal area ratio, PVCA/LA)×100%，隨機(jī)選取5根小動(dòng)脈的橫斷面拍照保存，采用上述方法，計(jì)算血管壁周?chē)z原面積與小動(dòng)脈管腔面積的比值，取5根小動(dòng)脈比值的平均值作為該標(biāo)本的PVCA/LA，以此反映血管周?chē)z原纖維化程度。

1.5重復(fù)性檢驗(yàn) 采用變異系數(shù)(coefficient of variance， CV)進(jìn)行評(píng)價(jià)。隨機(jī)選取10只大鼠，由觀察者本人重復(fù)測(cè)量2次，獲得觀察者內(nèi)CV，由另1名觀察者重復(fù)測(cè)量1次，獲得觀察者間CV。

表1 兩組大鼠二維及多普勒超聲心動(dòng)圖參數(shù)比較(±s)

注：*：與WKY組比較，P<0.05

圖1 SHR的2DSTE分析圖像 A、B.于左心室長(zhǎng)軸切面描記心內(nèi)膜，軟件自動(dòng)生成整體縱向應(yīng)變-時(shí)間平均曲線； C、D.于左心室乳頭肌水平短軸切面描記心內(nèi)膜，獲得整體周向應(yīng)變-時(shí)間平均曲線

2 結(jié)果

2.1一般資料和超聲指標(biāo)比較 SHR和WKY兩組大鼠的體質(zhì)量、心率和收縮壓的比較見(jiàn)圖2，同周齡WKY組的體質(zhì)量大于SHR組；SHR組的收縮壓高于同周齡WKY，且隨著周齡增加逐漸上升，14～24周兩組大鼠的體質(zhì)量、收縮壓差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。兩組大鼠的心率波動(dòng)較大，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。

SHR和WKY兩組大鼠常規(guī)二維超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的比較見(jiàn)表1。22、24周時(shí)，SHR組的LAD較同周齡WKY組增大；24周時(shí)，SHR的LVIDd、IVST、LVPWT和RWT均高于同周齡WKY大鼠(P均<0.05)。

SHR和WKY兩組大鼠的應(yīng)變指標(biāo)總體變化趨勢(shì)見(jiàn)表2、圖3。與同周齡WKY相比，SHR的GLS自16周、GRS自18周、GCS自20周顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。兩組大鼠的心內(nèi)膜下和心外膜下CVF、PVCA/LA的比較見(jiàn)表3、圖4。SHR組的CVF和PVCA/LA隨著周齡逐漸增加，均高于同周齡WKY組 (P均<0.05)，且同周齡SHR組的心內(nèi)膜下層心肌CVF均大于心外膜下層的CVF。

2.2相關(guān)性分析 SHR組的GLS與心內(nèi)膜下心肌CVF呈正相關(guān)(r=0.65，P<0.05)，而GRS和GCS與心外膜下、心內(nèi)膜下CVF均無(wú)顯著相關(guān)性(P均>0.05)。GLS、GCS與PVCA/LA均呈正相關(guān)(r=0.65、0.63，P均<0.05)，GRS與PVCA/LA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.59，P<0.05)。

2.3重復(fù)性檢驗(yàn) GLS的觀察者內(nèi)CV為(5.62±1.78)%，觀察者間CV為(8.69±4.61)%；GCS的觀察者內(nèi)CV為(7.86±2.63)%，觀察者間CV為(9.62±3.18)%；GRS的觀察者內(nèi)CV為(6.84±1.92)%，觀察者間CV是(8.21±3.27)%。

3 討論

2DSTE技術(shù)可用于定量分析心肌功能，包括心肌的縱向、徑向、周向應(yīng)變等。左心室心肌走向較為特殊[5-6]，心內(nèi)膜下心肌呈縱行的右手螺旋形、心外膜下心肌為縱行的左手螺旋形，中層心肌纖維呈橫向排列，左心室收縮過(guò)程中不同走行方向心肌可產(chǎn)生多維空間形變運(yùn)動(dòng)。

表2 兩組大鼠應(yīng)變參數(shù)比較(±s)

注：*：與WKY組比較，P<0.05

表3 兩組大鼠病理組織學(xué)參數(shù)比較(%，±s)

注：*：與WKY組比較，P<0.05

與同周齡WKY相比，隨著周齡增加，SHR的收縮壓逐漸增高，IVST和LVPWT代償性增厚，LAD、LVIDd于實(shí)驗(yàn)后期有輕度增大。這因?yàn)殚L(zhǎng)期高血壓引起心臟后負(fù)荷加重，導(dǎo)致左心室發(fā)生重構(gòu)[7-8]。隨著高血壓進(jìn)展，心肌微血管功能減退，心肌纖維化加重，心肌僵硬及心室舒張功能減退，最終可導(dǎo)致高血壓性心衰[9]。

本研究結(jié)果顯示，雖然SHR的LVEF與WKY相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但應(yīng)變所反映的心肌收縮功能已出現(xiàn)改變，表現(xiàn)為與同周齡的WKY相比，SHR的GLS、GCS、GRS下降明顯，且GLS降低早于GCS、GRS。這表明左心室GLS能較GCS、GRS更為敏感、更為早期地識(shí)別異常心肌，是預(yù)測(cè)臨床不良心血管事件的重要指標(biāo)，與Martinez等[10-13]的研究結(jié)果相符。因?yàn)樵赟HR的高血壓進(jìn)程中，心內(nèi)膜下層最易受心肌缺血等因素影響，最先出現(xiàn)膠原基質(zhì)異常沉積，故心肌縱向形變能力最先出現(xiàn)下降，表現(xiàn)為保留LVEF的心肌舒張功能受限；隨病程加重，心肌中層、心外膜下層膠原纖維均增多且排列紊亂，此時(shí)累及徑向應(yīng)變和周向應(yīng)變，舒張功能不全發(fā)展為心肌收縮障礙[14]。

圖2 各周齡SHR和WKY大鼠的體質(zhì)量(A)、收縮壓(B)及心率(C)變化情況 (*：與WKY比較，P<0.05)

本研究中SHR的GLS與心內(nèi)膜下層CVF呈正相關(guān)，而GRS、GCS則與心外膜下、心內(nèi)膜下CVF無(wú)明顯的相關(guān)性，與Ishizu等[15]研究結(jié)果一致，可能與研究的周數(shù)較短有關(guān)。病理組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SHR的PVCA/LA與GLS、GCS、GRS均呈明顯相關(guān)性，纖維膠原在SHR室壁小動(dòng)脈旁異常積聚，導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)，表現(xiàn)為血管壁增生、管腔變小，動(dòng)脈彈性減弱，應(yīng)變能力隨之下降，進(jìn)而可影響心肌細(xì)胞的血供。這些結(jié)果提示SHR左心室心肌收縮期的多維應(yīng)變的下降與心肌纖維化的分布和程度相一致。

本研究的局限性：①樣本量較少，研究周數(shù)較短；②由于未對(duì)大鼠心肌進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)，故未能從分子水平分析大鼠心肌纖維化程度；③僅觀察了16周后大鼠心臟的心肌纖維化程度，未對(duì)16周之前的CVF與GLS進(jìn)行分析比較；④體質(zhì)量較大的大鼠，左心室長(zhǎng)軸和短軸切面成像質(zhì)量較好，但由于大鼠心率過(guò)快，影響組織多普勒測(cè)量的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致對(duì)心臟舒張功能的評(píng)價(jià)受限。

綜上所述，基于2DSTE技術(shù)的應(yīng)變成像能夠反映自發(fā)性高血壓大鼠左心室心肌纖維化程度，其中左心室心肌GLS最先受損，其能夠較GCS和GRS更早期地用于評(píng)估心內(nèi)膜下心肌纖維化程度。左心室應(yīng)變指標(biāo)的變化對(duì)研究高血壓心臟病的發(fā)展進(jìn)程、危險(xiǎn)分層及預(yù)后有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

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Relationship between left ventricular global strain and myocardial fibrosis in spontaneously hypertension rats

MAXinxin,ZHANGYueli*,WANGMan,ZHENGDongyan,XUEXiaopei,ZHUMengruo,JIANGWenjun

(DepartmentofUltrasound,SixthPeople'sHospitalAffiliatedShanghaiJiaoTongUniversity,ShanghaiInstituteofUltrasoundinMedicine,Shanghai200233,China)

Objective To investigate the relationship between left ventricular strain and myocardial fibrosis in spontaneously hypertension rats (SHR). Methods Totally 15 SHR and 15 Wistar-Kyoto rats(WKY) with 10 weeks old were observed， each group was randomly divided into 3 subgroups. Echocardiography and two-dimensional speckle tracing echocardiography (2DSTE) were performed every two week from 12 weeks. two-dimensional dynamics images were required from the left ventricular long axis view and papillary muscle short axis view, and then the left ventricular peak global longitudinal strain (GLS), radial strain (GRS) and circumferential strain (GCS) were measured. One subgroup of SHR and WKY rats were killed and hearts were isolated at 16, 20 and 24 weeks respectively. The myocardium were fixed and performed Masson staining to observe collagen volume fraction (CVF) in subendocardial and subepicardial myocardium, perivascular collagen area to luminal area ratio (PVCA/LA). Results Compared with WKY rats, global strain of SHR significantly decreased, GLS significantly decreased since 16 weeks, GRS decreased since 18 weeks and GCS decreased since 20 weeks (allP<0.05). GLS was positively correlated with subendocardial CVF (r=0.65,P<0.05). GLS and GCS were positively correlated with PVCA/LA (r=0.65, 0.63, bothP<0.05), and GRS was negatively correlated with PVCA/LA (r=-0.59,P<0.05). Conclusion 2DSTE can be used to analyze the myocardial strain non-invasively and it has a good correlation with the degree of myocardial fibrosis.

Echocardiography； Hypertension; Speckle tracing echocardiography； Strain； Myocardial fibrosis

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目(134119a5801)。

馬新欣(1990—)，女，安徽宿州人，在讀碩士。研究方向：心臟超聲。E-mail： 15000023187@163.com

張躍力，上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科 上海醫(yī)學(xué)超聲研究所，200233。E-mail: zhangyueli2002@163.com

2016-07-08

2016-12-06

實(shí)驗(yàn)研究

10.13929/j.1003-3289.201607040

R-332; R540.45

A

1003-3289(2017)02-0161-06